专利名称：白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻抗病基因Xa7的一个分子标记的开发及其在育种中的应用，属于 作物遗传育种领域。
背景技术：
水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)是世界水稻生产中最严重的细 菌性病害之一，与稻瘟病和纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。目前，国内大面积种植的 杂交水稻对白叶枯病的抗性较差，主要是亲本不育系多数不携带白叶枯病抗性基因，而恢 复系携有的抗性基因大多源于Xa4，因此抗性单一且持久性不好。利用新的抗病基因尽快提 高杂交稻对白叶枯病的抗性是育种中急待解决的问题。迄今，水稻中已经鉴定了 30多个抗 白叶枯病基因，其中 Xa21 (Song et al.，1995)、Xal (Yoshimura et al.，1998)、xa5 (Iyeret al. ,2004)、Xa3/Xa26 (Sun et al.，2004)、Xa27 (Chu et al.，2006)、xal3 (Chu et al.， 2006)等6个基因已经被克隆。Xal编码一个NBS-LRR型蛋白；Xa3/Xa26和Xa21都编码L RR 类受体激酶；xa5和xal3都是隐性基因，分别编码一个TFIIA型转录因子和一个与棉花的 MtN3同源的新的跨膜蛋白；而Xa27是一类未知的新蛋白。从已有的研究及已克隆6个抗 性基因的功能来看，水稻抗白叶枯病基因的种类不一，抗病的机理和途径也多不相同。水稻Xa7基因源于孟加拉稻种DV85 (Sidhu et al.，1978)，是一个具有广谱抗性的 显性抗白叶枯病基因，对中国白叶枯病7个致病型均表现广谱高抗。菲律宾的大田区试实 验发现Xa7的抗性能保持十多年(White et al.，2009)。Vera Cruz等(2000)对水稻抗病 品种IRBB4 (Xa4)、IRBB7 (Xa7)和IRBBlO (XalO)的三年白叶枯病监测发现，只有IRBB7没有 发生严重的白叶枯病害，而且与IRBB7不亲和菌株的毒力都有所下降。这些结果表明Xa7 比其它抗白叶枯病基因具有更强、更持久的抗性。Bai等(2000)对无毒基因avrXa7的研究 发现，Xa7存在条件下avrXa7能引发抗性反应，它是一些白叶枯菌株中重要的毒力因子，缺 失avrXa7会导致菌株的毒力下降，所以avrXa7是维持白叶枯菌一定适应性的重要因子，这 也是Xa7基因能提供持久抗性的原因之一。因此，克隆Xa7基因不仅可以丰富水稻抗白叶 枯病的分子机制，而且可以与其它Xa基因结合培育抗性更好的基因累加系品种。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的 dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic sequences)分子标记，其會邑用于 Xa7 基 因的辅助选择育种，同时为克隆Xa7基因奠定了良好的基础。为了解决上述技术问题，本发明提供一种白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的 dCAPS分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID N0. 1。作为本发明的白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记，是基于PCR技 术，PCR扩展引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5' -3'，正向引物5，GCGGTGGTCGTGTGTTCTTCG3，(SEQ ID N0. 23),
反向引物5，TCCGGCACAGCCGCCGCCTC3，(SEQ ID NO. 24) 本发明还同时提供了上述白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记的用 途用于对Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。发明人在发明过程中， 首先，按照现有技术，利用一个带Xa7基因的籼型强优恢复系“镇恢084”水稻品种 与感病品种“成恢448”，构建了 F2分离群体，通过SSR、InDel等DNA分子标记对群体中331 个感病单株的分析，将Xa7基因精细定位在水稻第6染色体的200kb物理区间内，并预测了 19个候选基因。然后，本发明是在Xa7基因的定位区间内开发了一个新的与Xa7基因紧密连锁的 DNA分子标记，用于检测Xa7基因位点，利用该标记我们已将Xa7基因成功地转育到了珍汕 97、龙特甫、协特青等水稻品种中，明显增强了这些品种对白叶枯病的抗性。本发明的具体技术内容如下为了在Xa7基因定位区间设计分子标记，根据已 公布的水稻日本晴(Nipponbare)序列设计了许多PCR引物，对水稻品种“镇恢084 ”的 基因组DNA进行PCR扩增和测序，与日本晴的序列进行比对，发现了一些单核苷酸多态性 (singlenucleotide polymorphism, SNP)。针对这些SNP位点，对含Xa7基因的水稻品种 DV85、DV86和IRBB7等以及其它不含Xa7的17个水稻品种进行测序分析，这些品种测序的 序列分别为SEQ ID NO. 2至SEQ ID N0. 22，发现其中一个SNP在4个含Xa7品种中都是C， 在不含Xa7品种中都是G (图1)。利用这个SNP设计了一个dCAPS分子标记，对不同水稻品 种的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物经一个限制性内切酶Nru I酶切，在电泳中可检测 到两种大小不同条带，含Xa7品种的条带大小为178bp(baSe pair)，不含Xa7品种的条带为 203bp，这两种条带在3%琼脂糖凝胶电泳中具有很好的多态性(图2，图3)。该dCAPS标记 与Xa7基因紧密连锁，能分析待测水稻品种是否含有Xa7基因位点，在Xa7遗传育种中可以 大大提高基因转育的效率。利用本发明检测出某个水稻品种内是否含有“Xa7基因位点”的最终目的是，确认 在被测定水稻品种中是否含有Xa7基因。目前由于还没有克隆Xa7基因，也没有报道用于 鉴定Xa7基因的紧密连锁的分子标记。一般现在可采用白叶枯病菌的抗谱分析来鉴定Xa7 基因的存在，但是该方法需要多个菲律宾生理小种，接菌条件包括水稻的生育时期、气候、 温度等也比较严格，不适合大面积的鉴定和应用。本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其 它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应 用。本发明对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，用于Xa7基因的辅助选择育种，同时 为克隆Xa7基因奠定了良好的基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1不同水稻品种在dCAPS标记位点的序列Alignment分析图；图1中在不同品种中的差异碱基添上了边框，箭头指示的碱基就是本发明的 dCAPS标记所在的SNP位点；图2本发明dCAPS标记的设计图3不同水稻品种的dCAPS分子标记的电泳分析图；图 3 中M :marker ； 1-4 含 Xa7 基因的水稻品种，DV85、DV86、IRBB7 和镇恢 084 ； 5-11 不含Xa7基因的水稻品种，日本晴、9311、11 24、11 83、成恢448、中花11、扎昌龙。图4转育了 Xa7基因的水稻品种的dCAPS分子标记的电泳分析图；图4中M :marker ； 1-3 珍汕97、龙特甫、协特青；4_6 与IRBB7多次回交后，转育 了 Xa7基因的珍汕97、龙特甫、协特青。
具体实施例方式1、引物设计根据对以下水稻品种(DV85、DV86、IRBB7、镇恢084、IR24、IRBB3、 IRBB13、成恢448、Dongiin、韭菜青、黑壳子粳、龙特甫、Norin8、台北309、W11、云村稻、浙辐 802、扎昌龙、珍汕97、中花11、9311)的测序分析，即序列SEQ ID NO. 2至SEQ ID NO. 22，在 这个SNP位点及其周围约200bp处，设计一对dCAPS分子标记的PCR引物，序列为正向引 物5，GCGGTGGTCGTGTGTTCTTCG 3，，反向引物5，TCCGGCACAGCCGCCGCCTC 3，。引物可委托 Invitrogen公司合成。PCR扩展的产物为203bp，即SEQ ID NO. 1。2、DNA提取以水稻的叶片为材料提取基因组DNA，已报道的DNA提取方法很多，可 任意选择一种。本发现采用的是陈文岳等(中国水稻科学，2005，19 561-563)报道的一种 水稻DNA简易提取法。3、PCR扩增在0.2ml的PCR扩增专用薄壁管中，加入20ng水稻DNA、正反向引物 各 0. 25μΜ、4 种 dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP,)各 100 μ Μ、10 μ 1 2 X GC BufferIU 个酶 活力单位的Taq DNA聚合酶，用去离子水定容到20μ1，充分混勻。本发明使用的PCR试剂 为TaKaRa公司产品。PCR扩增在热循环仪上进行，扩增条件为95°C预变性5分钟；95°C变 性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C延伸5分钟。本发明采用的热循 环仪为Biometra公司的T3000型。4、PCR产物的酶切取步骤3所得PCR产物的10 μ 1，加入2 μ 1 Buffer K、1个酶 活力单位的限制性内切酶Nru I，用去离子水定容到20μ 1，充分混勻，37°C保温5 8个小 时。本发明使用限制性内切酶及其Buffer是Promega公司产品。5、酶切产物的电泳用IXTAE电泳液制备浓度为3 %的琼脂糖凝胶，将步骤 4所得的20μ 1酶切产物与2μ 1 IOXLoading Buffer混合，加到凝胶的点样孔中，以 DNAMarkerlOObp DNALadder (TaKaRa公司)作为分子量对照，在100V恒压下电泳30分钟。 用溴化乙锭(Ethidium bromide, EB)对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子 克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版)。6、电泳图谱分析在紫外透射仪上，用305nm波段观察凝胶上的电泳条带，通过比 对DNAmrker判断电泳条带的大小，电泳条带为179bp的水稻品种含Xa7基因位点，电泳条 带为203bp的水稻品种不含Xa7基因位点。注SEQ ID NO. 1中下划线标出的序列为酶切后产生的179bp片段。为了证明本发明的正确性，发 明人设置了如下对比试验实验1、分别将事先已知含Xa7基因位点的水稻品种DV85、DV86、IRBB7、镇恢084和事先 已知不含Xa7基因位点的水稻品种日本晴、9311、IR24、IRBB3、成恢448、中花11、扎昌龙按照实施例1所述的方法进行检测，最终结果如下事先已知含Xa7基因位点的水稻品种DV85、DV86、IRBB7、镇恢084，所得的电泳条 带均为179bp。而事先已知不含Xa7基因位点的水稻品种日本晴、9311、IR24、IRBB3、成恢448、 中花11、扎昌龙，所得的电泳条带均为203bp。实施例2、已知水稻品种“珍汕97、龙特甫、协特青”不含Xa7基因，将这三个水稻品种分别多 次与抗白叶枯病稻种IRBB7回交，并利用该分子标记进行辅助性地选择，将Xa7基因成功地 转育到了这个品种中(如图4所示)，明显增强了其对白叶枯病的抗性。以其中一个品种珍 汕97为例，具体过程如下用含有Xa7基因的水稻品种IRBB7做父本，与母本品种珍汕97进行杂交，得到的 F1代与轮回亲本珍汕97进行多次回交，将Xa7基因转育到珍汕97中去；由于，回交的后代 会发生分离，群体中只有一部分个体带Xa7基因，必须选择含有Xa7基因的植株继续进行回 交，因此利用这个dCAPS分子标记对回交后代进行分析，当电泳的条带为179bp时，表明该 植株中含有Xa7基因，这就能迅速找出含Xa7的植株进行下一轮的回交，从而缩短了 转育时 间，而且选择的可靠性高。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记，其特征是该分子标记的核苷 酸序列为SEQ ID NO. 1。
2.根据权利要求1所述的白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记，其特征 是dCAPS分子标记引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5' -3'，正向引物5’ GCGGTGGTCGTGTGTTCTTCG 3，， 反向引物5’ TCCGGCACAGCCGCCGCCTC 3，。
3.根据权利要求1或2所述的白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记的用 途，其特征是用于对Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。
全文摘要
本发明公开了一种白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。dCAPS分子标记的引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向引物5’GCGGTGGTCGTGTGTTCTTCG 3’，反向引物5’TCCGGCACAGCCGCCGCCTC 3’。本发明还同时公开了上述白叶枯病抗性基因Xa7辅助育种的dCAPS分子标记的用途用于对Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。
文档编号C12N15/11GK102146381SQ201110021668
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者郑茜茜, 陈析丰, 顾志敏, 马伯军 申请人:浙江师范大学