专利名称：一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵和生物分离领域，涉及一种联产LI-F类抗生素(即LI-F 抗菌脂肽，目前无中文名称，总共包括12种组分，其中分子量883、897、947、961四种也可以叫Furscidins即杀镰孢菌素)和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株。利用多粘类芽孢杆菌生产的LI-F类抗生素适用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。
背景技术：
食品发酵工业、农业生产以及医药工业长期面临以下一些问题食品的微生物污染，植物病虫害，日益严重的致病菌抗药性。传统的解决方法(化学防腐剂、化学农药、抗生素)虽然可以暂时缓解矛盾，然而随着检测技术的进步以及环保意识的提高，人们开始注意到上述化学药剂的潜在危害。开发高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然防腐剂已经成为当前食品、医药、植物抗病基因工程领域的研究和应用热点，将具有更广阔的发展空间。基于科技的进步，检测手段的完善以及人类对生态环境意识的提高，低毒、高效、 选择性强、残留时间短、对环境污染小的微生物天然防腐剂和生防试剂的研究和开发日益引起国内外专家学者的关注。微生物是地球上分布最为广泛的一大类生物，它无处不在，是一个丰富的资源宝库。细菌又作为自然界中分布最广泛的一类微生物，以其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养等优势，倍受微生物工作者越来越多的关注。从微生物中提取抗菌物质成本低、周期短、操作简单方便、容易实现工业化生产，而且微生物分泌的抗菌物质抑菌谱较宽，热稳定性较好，适用PH范围广，使用过程不易产生抗性菌和交叉拈抗性，因此可以发挥更大的工业应用价值。多粘类芽孢杆菌(Paenikicillus polymyxa)是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌， 原名多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)，以形态学为分类基础，早期研究将其归入芽孢杆菌属。多粘类芽孢杆菌细胞呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，接触酶阳性，氧化酶反应可变，厌氧条件下所测定的大多数菌株固定氮。多粘类芽孢杆菌是少数能够产生具有临床应用价值的抗生素的细菌之一，由它产生的多粘菌素B (polymyxins B, PMB)和多粘菌素 E(colistin)已在临床上用于抗细菌感染。其中的某些菌株也是重要的植物生防细菌和植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)，并且在农业领域已得到广泛的应用。此外，多粘类芽孢杆菌及其代谢产物在工矿业及废水处理方面也有应用。由于其诱人的应用前景，美国环保署(EPA)将它列为可商业上应用的微生物之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。研究表明，多粘类芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，其中包括肽类、蛋白质类、核苷类、吡嗪类和酚类等，能够防治多种植物病害。多粘类芽孢杆菌的不同菌株之间可能产生同种的抗菌物质，而同一菌株也可能同时产生多种不同抗菌物质。多粘类芽孢杆菌在生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等方面非常具有应用潜力，但是要实现商业化，还必须加强
4高产菌株的选育、培养基和培养条件优化、制剂研制等方面的研究。
发明内容
本发明目的是针对上述技术问题提供一种联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的I^aenibacillus poIymyxa菌株以及该菌株的用途。本发明另一个目的是提供利用上述菌株进行LI-F类抗菌脂肽和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法。本发明的目的通过下列技术方案实现一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株，该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenikicillus polymyxa) JSa_9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4314。所述的多粘类芽孢杆菌菌株在制备抗生素方面的应用，特别是该菌株在联产LI-F 类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯方面的应用。利用CGMCC No. 4314菌株进行LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法，包括下列步骤a.将保藏号为CGMCC No. 4314的多粘类芽孢杆菌JSa_9进行培养，得到抗菌物质发酵液；b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，萃取，将有机相进行纳滤，得抗菌提取物；c.抗菌提取物通过HPLC分离纯化LI-F类抗生素及邻苯二甲酸二丁酯；d.对分离纯化的物质进行鉴定。进一步，所述的方法包括下列步骤a.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的发酵将多粘类芽孢杆菌JSa-9接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30°C培养MhJf 菌种活化；再将试管斜面活化的多粘类芽孢杆菌JSa-9菌种接种于LB液体培养基，30°C、 ISOrpm培养20 Mh，至对数生长期，制成浓度为IO7 108cfu/l的种子液；将多粘类芽孢杆菌JSa-9种子液以10%浓度接种于Landy发酵培养基中，在30°C和150rpm条件下培养 72h，得到抗菌物质发酵液；b.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的分离①发酵液在12. OOOg下离心20min除去菌体，然后用与上清液相同体积的乙酸乙酯以萃取法抽提两次后，将有机相经过l-2nm的纳滤膜，即为获得的抗菌提取物；②多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC):将多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物采用RP-C18柱(4. 6mmΦ X 250mm)进行HPLC分离纯化LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯；洗脱液为含3. Smmol三氟乙酸的水和乙腈溶液(三氟乙酸和乙腈为MERK公司产品)，梯度洗脱条件为0 20min，乙腈10 40% ；20 30min，乙腈40 60%；30 40min，乙腈60 70%；流速为0. 5ml/min ；检测波长为210nm ；邻苯二甲酸二丁酯标准样品(美国SIGMA公司)也在相同条件下进行HPLC层析；LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的HPLC洗脱保留时间分别约为25 30和52min ；c.多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质的鉴定多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物经HPLC分离后，各抗菌组分再利用电
5喷雾电离、诱导石並撞角军离质谱(Electrospray ionization mass spectrometry/ collision-induceddissociation, ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。所述的方法，其中步骤b中高效液相色谱仪为美国AGILENT llOOseries，配备DVD 检测器。所述的方法，其中步骤c中在质谱分析前对环脂肽样品采用弱碱性NaOH在 40°C条件下处理24h水解成直链；ESI-MS/CID采用配备了电喷雾离子源的LCQDECA XPPLUS Thermo Finnigan 液质联用(LS-MS)设备(Thermo Corporation，USA)，采用 MS 柱(2. 6πιπιΦΧ250πιπι，2μπι)进行分析，HPLC条件中流动相成分和比例与多粘类芽孢杆菌 JSa-9产抗菌物质的分离步骤相同，流速为2μ Ι/min ；电喷雾源操作电压为5kV，操作温度为300°C，操作压力为20abr。本发明利用多粘类芽孢杆菌生产抗菌物质，其特征为该抗菌物质包括LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯，来自多粘类芽孢杆菌 (paenibacillus polymyxa) JSa_9，经过ESI-MS鉴定两者的分子量，前者分别为883，897， 911，947和961Da;后者为278Da。LI-F类抗生素是一系列环形抗菌脂肽类化合物的总称， 共有12种组分。本发明鉴定出的五种LI-F类抗生素分别为LI-F04a、LI_F04b、LI_F03a、 LI-F03b 和 LI-F05b。本发明的有益效果本发明首次提供了一种联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的 Paenibacilluspolymyxa菌株。多粘类芽孢杆菌产LI-F类抗生素对多种革兰氏阳性细菌、 真菌和酵母菌具有很高的抑菌活性。邻苯二甲酸二丁酯是首次在I^aenibacillus polymyxa 中发现，是聚氯乙烯最常用的增塑剂，具有杀菌活性。本发明采用的I^enibacillus polymyxa是被美国环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种，并在农业领域已得到广泛的应用。I^aenibacillus polymyxa抗菌脂肽LI-F类抗生素属于微生物天然抗菌肽，对人类健康和食品安全性高，不会导致对环境的污染，可用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。
图IPaenikiciIlus polymyxa J&1-9产LI-F类抗菌肽以及邻苯二甲酸二丁酯标样的ESI-MS图。图 2Paenibacillus polymyxa JSa-9 产 LI-F 类抗菌肽 m/z 883. 82 作为前导子的 CID图谱及其分子结构与离子碎片分析图。图 3Paenibacillus polymyxa JSa-9 产 LI-F 类抗菌肽结构通式。图 4Paenibacillus polymyxa JSa_9 产 m/z 278. 89 物质与邻苯二甲酸二丁酯标样的CID图谱。图5菌株JSa-9的革兰氏染色。图6J&-9菌株16S rRNA PCR扩增产物凝胶电泳图。生物材料保藏信息本发明提供的该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenikicillus polymyxa) JSa_9，已保
6藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 4314，保藏日期为2010 年11月08日。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1 广谱抗菌活性I^aenibacillus polymyxa JSa-9的筛选与鉴定1.材料与方法1. 1分离样品来源分离样品为土壤，采样地点包括江苏省南京市紫金山下田园、南京农业大学食品院后菜地和北苑食堂外田地，以及江西省临川市、德兴市和黑龙江省齐齐哈尔市郊区菜地等六处。1. 2 试齐[JTE 缓冲液；溶菌酶(10mg/ml) ；SDS (10 % ) ；RNase 溶液(lmg/ml)(购自天津 H&YBio. Co. Ltd) ；NaAc (3M),蛋白 g| K(20mg/ml), 10XPCR buffer, dNTP, fDl primer, rPlprimer (由北京三博远志生物技术公司提供)；Taq酶，DNA Mark (购自北京清华天为生物技术公司)。1. 3供试菌株试验中采用的抗菌活性检测指示菌蜡样芽孢杆菌(Baci 1 Ius cereus ASl. 1846)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus CMCC 28001)、大肠杆菌(Escherichia coli ASl. 487)、荧光假单胞菌(Pseudomouas fluorescens ASl. 1802)、黑曲霉(Aspergillus niger AS 3. 350)、点青霉(Penicllium notatum AS 3. 4356)，来源于中国普通微生物菌种保藏中心。1. 4培养基1. 4. 1菌株分离培养用培养基LB 培养基胰蛋白胨 10. 0g，酵母膏 5. 0g、NaCl 10. 0g、蒸馏水 1000ml ;pH7. 0、 121°C、20min灭菌备用，固体培养基另加15 20g的琼脂。1.4. 2指示菌用培养基(1)营养琼脂培养基(细菌用)(沈萍等，1999)牛肉膏3. 0g，蛋白胨 10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水 1000ml，琼脂 20g，pH 7. 0 7. 2。(2) PDA培养基(真菌用)(沈萍等，1999)马铃薯200g(切片水煮30min，过滤取汁)，葡萄糖20. Og,蒸馏水1000ml，琼脂 20g，pH 自然。1.4.3菌株鉴定用培养基在菌株鉴定中所用到的营养琼脂半固体培养基、淀粉培养基、糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基等的配制均参照东秀珠等的《常见细菌系统鉴定手册》配制。1. 5主要仪器磁力加热搅拌器，超净工作台(苏净集团安泰公司)，PH计(美国Orion公司)，高压蒸气灭菌锅(北京发恩科贸有限公司)，恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，高速冷冻离心机(centrifuge 5804R, Eppendorf 公司)，电子天平(BS-200S，Sartorius公司)，HYG-A全温摇瓶柜(太仓实验设备厂)；PCR 仪(PTC-100 ，MJ Research 公司)。1. 6抗菌活性菌株的分离筛选1.6. 1 土壤样品的采集选择无人为干扰、有机质含量丰富、水分适宜的土壤区域采样，采样时按照多点取样(不同地点、不同土层深度)方法，去除表层土样，利用简易打孔器向下打取5 IOcm土层，并将上下土样充分混勻，然后取几十克装入无菌牛皮袋中，并在袋上注明采集地点、日期、土样号和植被状况，迅速送回实验室立即进行分离或4°C保存备用。1. 6. 2 土壤芽孢杆菌的分离将采来的土样阴干、研磨后，称取10g，放入250ml盛有90ml生理盐水及玻璃珠的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡IOmin后于80°C水浴中加热20min，杀灭不产芽孢的细菌和其他菌类气采用土壤稀释分离法依次制得ιο-2、ιο-3、ιο-4、ιο-5、 (Γ6、ιο-7 土壤稀释液，再分别取各梯度稀释液0. Iml涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上。倒置于30°C的恒温培养箱中培养48h。挑取单菌落，镜检，将已纯化的菌株保存于营养琼脂培养基斜面4°C冰箱内备用。1. 6. 3指示菌的准备与培养条件指示细菌培养于营养琼脂培养基上，采用37°C培养Mh;真菌培养于PDA培养基上，培养3 7天。各指示菌在接种前，用无菌生理盐水调整菌体浓度至OD6tltlnm = 0. 5。 抗菌活性菌株的初筛选择蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和黑曲霉三种指示菌，而复筛中指示菌包括蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、黑曲霉以及点青霉五种。1.6.4抗菌活性菌株的初筛将分离得到的芽孢杆菌分别划线于LB固体培养基平板上，30°C培养3 后，以无菌打孔器于生长菌落旁取出5mm直径的琼脂块，贴放于含有蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌和黑曲霉的指示平板表面，于特定温度下培养后测定抑菌圈大小。1.6.5抗菌活性菌株的复筛将经初筛有抗菌活性的菌株于80ml LB液体培养基中，30°C、180r/min摇床培养 36h。发酵培养液于IOOOOg离心20min，上清液经0. 45 μ m孔径的细菌滤器过滤，采用琼脂孔扩散法(100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基中混入30ml指示菌菌液，倾倒平板待其冷却后， 用6. 8mm直径的无菌打孔器打取平板上的琼脂块，取滤液50 μ 1注入琼脂孔中，指示细菌和真菌于相应的培养条件下培养后，通过游标卡尺测其抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示发酵液的抗菌活性)测定发酵液的抗菌活性。1.7目标菌株的鉴定方法1.7. 1形态特征观察取在营养琼脂培养基上30°C培养Mh的菌株平板中的插片，置载玻片上在光学显微镜下观察菌体形态，鞭毛及芽孢的有无和着生情况。1.7.2培养特征观察将实验菌株接种于营养琼脂培养基上，30°C培养Mh，观察其表观特征，包括菌株的形状和大小，边缘、表面隆起形状，透明度，菌落及培养基的颜色等。1.7.3生理生化特征研究参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)对JSa-9菌株进行革兰氏染色以及生理生化特性鉴定。(1)生长温度的测定将目标菌株接种于营养琼脂液体培养基中，置于4°C冰箱和15°C、20°C、25°C、 30°C、37°C、40°C的恒温培养箱以及45°C、50°C、60°C的水浴中培养，每隔12h与未接种的对照管对比，目测菌株的生长情况，确定菌株生长的最低及最高温度。(2)耐酸碱度的测定将目标菌株接种于pH 值为 3,3. 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5、10
的营养琼脂液体培养基中，3o°c培养，每隔1 与未接种的对照管对比，目测菌株的生长情况。(3)需氧性及运动性的测定取活化Mh的目标菌株穿刺接种于营养琼脂半固体培养基中，30°C培养3天后观察生长状况。(4)耐盐性试验将目标菌株接种于加入NaCl至终浓度为0%、2%、5%、7%、10%的营养琼脂液体培养基中，30°C培养，在第3天和第7天各观察一次，与未接种的对照管对比，目测生长情况。(5)柠檬酸盐利用在适用于芽孢菌的培养基(NaCllg,MgSO4 ·7Η20 :0. 2g,NH4H2PO4 :0. 5g，柠檬酸钠 2g，蒸馏水1000ml, 0. 04%酚红液:20ml)斜面上划线接种，30°C培养3 7d。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。(6)接触酶试验将目标菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上30°C培养Mh，以钼丝接种环取一环涂抹于已滴有3%的H2A的玻片上，观察气泡的产生，有气泡者为阳性，否则为阴性。(7)淀粉水解试验将大肠杆菌(阳性对照)以及目标菌株分别在淀粉培养基的平板上划线接种，将培养皿倒置，放入37°C恒温培养箱中培养Mh。打开皿盖，加入少量卢哥氏碘液于平皿中， 轻轻旋转平板，使碘液均勻铺满整个平板，观察菌苔周围是否有透明圈出现。(8)糖、醇类发酵试验将目标菌株以及大肠杆菌分别接种于葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蔗糖发酵培养基、甘露醇发酵培养基、阿拉伯糖发酵培养基中，以不接种的培养基为对照，37°C 培养M 48h，观察各试管的颜色变化以及德汉氏小管中有无气泡产生。(9)硝酸盐还原试验取目标菌接种于硝酸盐还原测定培养基中，30°C培养24 48h，用Griess试剂测定。如培养液变为红色表示亚硝酸盐存在，为阳性。(10)甲基红试验取目标菌接种于甲基红测定培养基中，30°C培养M 48h，用甲基红试剂测定。如培养液变为红色表示甲基红试验阳性反应，黄色则为阴性。(Il)V-P 试验取目标菌接种于甲基红测定培养基中，30°C培养M 48h，去等量的40%氢氧化钠相混，加少许肌酸，IOmin后如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色。1. 7. 4基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定(1)细菌总DNA的制备吸取IOml 280C 160r · mirT1培养至对数期的菌培养液，5000r · mirT1离心IOmin, 沉淀用TE洗涤后，再次离心，菌体重悬于TE溶液，加入50mg · ml—1溶菌酶溶液8 μ 1， 37°C保温 20min,加入 RNase (IOmg .ι Γ1) 10 μ 1，至终浓度为 25 μ g .mr1,然后加入 10 % SDS 溶液 0. 51111，371保温301^11，加入蛋白酶1((2011^ -πιΓ1) 10 μ L，至终浓度为 50 μ g ^1^,37^ 保温60 90min，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇05 24 1)，混勻，8000r .mirT1离心5min，取上清液转入另一离心管中，如此2 3次，将上清液中加入0. 1倍体积的醋酸钠和2倍体积的冷冻的无水乙醇，旋转离心管，出现沉淀物DNA，70%乙醇洗涤一次，室温下干燥，加入0. 5ml TE或双蒸水溶解DNA作为PCR模板待用。(2) 16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定采用原核生物16S rRNA扩增的通用引物用于16S rRNA基因的PCR反应的引物为一对通用引物(由北京三博远志生物技术有限公司合成)正向引物fD1 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物rP 1 5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，PCR反应体系IOXPCR buffer5μ 1IOmmol ‘ F1MgCl23μ 12· Ομπ ο · ΓΜΝΤΡ4μ 1IOymol ‘ F'fDl3μ 1IOymol ‘ Γ'γΡΙ3μ 11. 0 μ mol · F1DNA 模板1 μ 15U · μ r1Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)1 μ 1ddH2030 μ 1_总反应体积50 μ 1PCR反应程序94 °C 5min
94 °C 40 sη}- 34cycles 52°C 50 s J72 °C 2min72 °C IOminPCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。PCR产物通过电泳，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit试剂盒割胶回收纯化。送至上海生工测序。测序结果利用Blast在非重复的GENBANK+EMBI+PDB基因库中进行同源性比较，并将其鉴定到种。(3)绘制系统发育树将所测得的16S rRNA序列经过校对后与NCBI上的GeneBank序列数据库中的已有序列进行Blast分析，根据序列同源性从高到低的次序选取模式菌株的序列，采用 Bioedit7. 0和Treedrawing软件用Neighbor-Joining法构建了系统发育树，以确定该菌株的分类地位。2结果与分析2. 1抗菌活性菌株的分离筛选从不同来源的六份土壤样品中分离到共119株芽孢杆菌菌株，采用琼脂块法对蜡样芽孢杆菌(G+)、E.Coil(G_)、黑曲霉的抑菌活性进行测定，从中有36株具有抗菌活性。用摇瓶法复筛后发现，有9株菌株的抗菌谱较广、抗菌活性较高，即JSa-6、JSa-9、JSa-47, JSb-Il、几c-6、几c-16、HLJ-25、JXa-16、JXb-2(结果见表 1-1)。其中 JSa_9、JSa-48、JSb_2、 HLJ-6四株菌对三种指示细菌均有明显抑制作用，而对两种指示真菌均具有抑菌活性的菌株只有JSa-9、JSa-47、JSb-Il三株，其中JSa_9在9株抗菌活性菌株中抗菌谱最广，不仅对革兰氏阳性及阴性细菌有明显的抑制作用，对真菌黑曲霉、点青霉也有抑菌活性，但对点青霉的抑制作用相对较弱。将JSa-9菌株送CGMCC保藏，保藏号为CGMCC No. 4314。2. 2JSa-9菌株的培养特征及生理生化鉴定2. 2.1菌体形态特征菌体呈短杆状，染色均勻、革兰氏染色阳性(见图5)，具有运动性，可形成卵圆形芽孢，芽孢孢囊膨大，中生至次端生。2. 2. 2菌落特征JSa-9菌株在营养琼脂培养基上培养24h后呈淡黄色菌落，表面光滑，粘稠，微凸起，边缘整齐，直径0. 3 0. 5mm，不产色素。2. 2. 3J&1-9菌株的生理生化特征菌株革兰氏染色呈阳性；兼性厌氧生长；其最适生长温度为30°C，最低生长温度为15°C，40°C以上不能生长；5% NaCl条件下不生长；V-P试验阳性；能水解淀粉，接触酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性；喷哚试验阴性；甲基红试验阴性；不产H2S ；不利用柠檬酸盐；能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖和乳糖，同时能产生气体(见表1-2)。综合以上培养特征及生理生化特性，并根据东秀珠等的《常见细菌系统鉴定手册》，初步将JSa-9菌株鉴定为浸麻类芽孢杆菌(Paenikicillus macerans)或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。2. 3J&1-9菌株的分子生物学鉴定2. 3. IPCR 产物扩增以JSa-9总DNA为模板，利用16S rRNA基因引物进行PCR扩增，得到约为1. 5kb 的PCR扩增产物，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图6。2. 3. 2测序结果
取PCR产物40 μ 1，由上海生工生物技术公司完成16S rRNA基因的测序工作。测序结果如下(共计1430bp)。此序列已在GenBank中登录，其登录号为EU8^855。2. 3. 3BLAST同源性搜索比较结果将所得到的16S rRNA基因序列，在www. ncbi. nlm. nlh. gov网站中使用 BLASTN2. 211 [MAY-05-2005]在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索，所得结果中同相似性最高的前14个菌株比较结果如表1-3，从表1-3可见与JSa-9相似度最高的前14株菌均为多粘类芽孢杆菌，而且相似性均达到99%。因此，综合生理生化试验以及16S rRNA同源性比较结果可以把该菌归为多粘类芽孢杆菌(Paenikicillus polymyxa) 0表1-1摇瓶法测定抗菌活性菌株的抗菌效果
菌株 Strain来源 Origin抑菌圈直径(mm) Inhibition zone(diameter, mm)大肠 E. coli藤黄微球 Μ. Iuteus蜡样 B. cereus点青霉 P. notatum黑曲霉 A. nigerJSa-9江苏省南京市紫金山11.88±0.513.96±0.211.98±0.38.85±0.212.86±0.1JSa-36江苏省南京市紫金山8.36±0.3NI7.38±0.5NI8.48±0.5JSa-47江苏省南京市紫金山11.93±0.4NI10.07±0.19.05±0.28.13±0.50148] JSa-48江苏省南京市紫金山8.13±0.510.25±0.613.97±0.5NI10.32±0.2JSb-2江苏省南京农业大学12.95±0.110.97±0.38.32±0.3NI7.42±0.5JSb-Il江苏省南京农业大学12.30±0.3NI10.80±0.28.66±0.57.23±0.3HLJ-6黑龙江省齐齐哈尔市8.39±0.39.99±0.69.56±0.4NINIJXa-2江西省德兴市郊区10.02±0.1NI9.33±0.27.53±0.4NIJXb-3江西省临川市郊区9.18±0.39.13±0.3NINI7.66±0.3注“NI”表示无抑制作用，“ 士，，表示一式三份测量后的标准偏差。表1-2菌株JSa-9的生理生化特征
权利要求
1.一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株，该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenikicillus polymyxa) JSa_9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4314。
2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株在制备抗生素方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于该菌株在联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯方面的应用。
4.利用权利要求1所述菌株进行LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法，其特征在于包括下列步骤a.将保藏号为CGMCCNo. 4314的多粘类芽孢杆菌JSa-9进行培养，得到抗菌物质发酵液；b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，萃取，将有机相进行纳滤，得抗菌提取物；c.抗菌提取物通过HPLC分离纯化LI-F类抗生素及邻苯二甲酸二丁酯；d.对分离纯化的物质进行鉴定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括下列步骤a.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的发酵将多粘类芽孢杆菌JSa-9接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30°C培养Mh，将菌种活化；再将试管斜面活化的多粘类芽孢杆菌JSa-9菌种接种于LB液体培养基，30°C、ISOrpm 培养20 Mh，至对数生长期，制成浓度为IO7 108cfu/l的种子液；将多粘类芽孢杆菌 JSa-9种子液以10%浓度接种于Landy发酵培养基中，在30°C和150rpm条件下培养72h， 得到抗菌物质发酵液；b.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的分离①发酵液在12.OOOg下离心20min除去菌体，然后用与上清液相同体积的乙酸乙酯以萃取法抽提两次后，将有机相经过l_2nm的纳滤膜，即为获得的抗菌提取物；②多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC)将多粘类芽孢杆菌 JSa-9抗菌提取物采用RP-C18柱进行HPLC分离纯化LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯；洗脱液为含3. Smmol三氟乙酸的水和乙腈溶液，梯度洗脱条件为0 20min，乙腈10 40%; 20 30min，乙腈40 60% ;30 40min，乙腈60 70% ；流速为0. 5ml/min ；检测波长为 210nm ；邻苯二甲酸二丁酯标准样品也在相同条件下进行HPLC层析；LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的HPLC洗脱保留时间分别约为25 30和52min ；c.多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质的鉴定多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物经HPLC分离后，各抗菌组分再利用电喷雾电离、诱导石並撞角军离质谱(Electrospray ionization mass spectrometry/ collision-induceddissociation, ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤b中高效液相色谱仪为美国AGILENT llOOseries，配备DVD检测器。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤c中在质谱分析前对环脂肽样品采用弱碱性NaOH在40°C条件下处理24h水解成直链；ESI-MS/CID采用配备了电喷雾离子源的 LCQDECA XP PLUS Thermo Finnigan 液质联用(LS-MS)设备(ThermoCorporation，USA)，采用MS柱进行分析，HPLC条件中流动相成分和比例与多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质的分离步骤相同，流速为2μ 1/min ；电喷雾源操作电压为5kV，操作温度为300°C，操作压力为 20abr。
全文摘要
本发明属于微生物发酵和生物分离领域，公开了一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用。该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JSa-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4314。该菌株能联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯，可用于制备抗生素，可开发成为新型的天然食品防腐剂及生防试剂，广泛应用于水果和蔬菜等食品加工和防腐保鲜，对于延长食品保质期和减少农作物病虫害等具有十分重要的价值。
文档编号C12P7/62GK102168053SQ20111003698
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月13日 优先权日2011年2月13日
发明者别小妹, 吕凤霞, 邓阳, 陆兆新 申请人:南京农业大学