一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法

专利名称：一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法
技术领域：
本发明提供一种人类自然杀伤细胞的增殖方法，使自然杀伤细胞经本发明方法增殖过后，可达到至少高于增殖前五百倍的细胞数目，并保持自然杀伤细胞的毒杀活性，为人类自然杀伤细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。
背景技术：
根据资料，癌症一直高居中国台湾十大死因的第一位，癌症影响层面之广及所耗费社会成本之巨可见一斑。目前为止人类所熟知的抗癌疗法至少有五大类，包括手术切除法、化学治疗及放射线治疗等三种及其合并疗法与民俗疗法。手术疗法虽然效果很好，但有些肿瘤无法以外科手术切除，且手术的后仍会有残存的癌细胞容易造成复发或转移，这正是癌症之所以可怕以及致人于死的主要原因。而已转移或无法以外科手术切除的癌细胞就必须以放射线疗法或化学疗法来治疗，甚至无法以现有的医疗方式达到治疗效果。可是放射线疗法或化学疗法并没有专一性，会将好的细胞以及坏的细胞同时杀死，导致严重的副作用，该副作用对病患本身抗癌能力最为关键的免疫系统的破坏也最严重，这是目前医学上一直无法克服的难题之一，因此这样的治疗无论是在延长寿命或降低副作用方面都仍有大幅改善的空间。因此对于癌症治疗，各界都在积极寻求能抗癌，无副作用而又能加强免疫机能的方法。自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK cells)是人体内第一道与生俱来的免疫防线(Native immunity)成员之一，也是对抗癌细胞或病毒最强、最有效的细胞。与其它抗癌免疫细胞相比，例如毒杀性T细胞(Cytotoxic T cells)或树突细胞(Dendritic cells)，NK细胞的毒杀性较强、较具广谱性、不受组织兼容性抗原限制(MHC-Restriction) 且不需要致敏作用(I^rimimg)的启动就可直接发动对癌细胞的攻击。除此之外，NK细胞还具有调节免疫能力及和神经系统交互作用的能力。理论上NK细胞可以成为一个有效的癌症治疗手段，然而这种细胞平常在体内的数量本来就不多，只约占血液中白血球的2-6 %， 再加上受到疾病、年龄、压力、不良生活习惯及其它环境因素等的影响，NK细胞的数量及活性常随着年龄增长而逐渐降低，直接或间接促成癌症的发生或恶化；而临床上也常观察到癌症病人的NK细胞数量不足或活性下降的现象。公知技术无法在体外短时间内将NK细胞大量的增殖，且同时保有NK细胞的毒杀活性，再者，公知技术所采用的NK细胞，是取自于已经得到癌症的病患，在这状态下取得的NK细胞对于癌细胞的毒杀能力不够强，即便增殖后再回输于病人体内，所能达到的癌细胞杀伤效果也不高，使得利用NK细胞来治疗癌症的想法固然很有吸引力，但是实际执行上却碍于公知技术的不足而无法真正应用于制备治疗癌症的药物。

发明内容
本发明的目的，在于提供一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其是可以从冷冻保存的周边血液单核球细胞(Peripheral bloodmononuclear cells, PBMCs)中增殖 CD3—CD56+亚型自然杀伤细胞的方法，使自然杀伤细胞经本方法增殖过后，可达到至少高于增殖前五百倍的细胞数目，并保持自然杀伤细胞的毒杀活性，为人类自然杀伤细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。为更好的描述和理解本发明，我们将对本发明中所涉及的术语做详尽的解释。自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK cells) :NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，分布于周边各淋巴器官及血液循环系统，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒杀效应，并可分泌多种细胞因子及趋化因子。NK细胞的启动NK细胞可表达一系列活化性受体及抑制性受体，两者间的平衡是控制NK细胞是否被启动的重要机制。同时，干扰素及巨噬细胞来源的细胞介素均是NK细胞极强的活化因子。本发明中利用重组人类白血球间素(Recombinant human Interleukin, rhIL)、2(rhIL-2)、12(rhIL-12)、15(rhIL-15)、18(rhIL-18)、21(rhIL_21)及其组合的应用来活化NK细胞。NK细胞的增殖是指NK细胞在体外培养中通过一系列的细胞分裂，而达到一定的增殖数目。本发明中所增殖的NK细胞主要是⑶3—CD56+亚群的NK细胞。细胞毒杀活性是指由细胞引起的单纯的细胞杀伤事件。NK细胞的毒杀活性不单纯局限于肿瘤细胞，还包括对病毒感染细胞、受损和功能异常细胞的杀伤作用。本发明中所涉及的NK细胞毒杀活性主要是指其对肿瘤细胞的杀伤作用。NK细胞毒杀活性的测定目前主要是应用对NK细胞敏感的骨髓白血病(erythroleukemia)细胞株K562和对NK细胞抗性的淋巴肿瘤细胞株Raji为靶细胞，测定NK细胞对它们的杀伤率。本发明中应用K562细胞株来测定NK细胞毒杀活性。NK细胞疗法是一种利用高科技的细胞培养技术在短时间内于体外(Ex vivo)大量繁殖病人本身可以对抗癌细胞的NK细胞后，再将其注入病人体内，直接提高病人本身的抗癌能力，达到抗癌、治癌目标的一种医疗技术。NK细胞疗法的前提是NK细胞的启动和大量增殖，并对肿瘤细胞保持高的细胞毒杀伤活性。自体免疫细胞，尤其是NK细胞的免疫细胞治疗法简单的说，是一种利用高科技的细胞培养技术在短时间内于体外(Ex vivo)大量繁殖病人本身可以对抗癌细胞的NK细胞后，再将其注入病人体内，直接提高病人本身的抗癌能力。实际的做法是病人经医师仔细评估且判定适合NK细胞疗法后，从病人身上采集约30毫升的周边血液在符合GTP/GMP规范的无尘、无菌实验室进行连续15天的培养，在过程中以特殊的配方专门培养、增殖其中的NK细胞，使其数量增加达原先的数百倍甚至上千倍后再注入体内，直接提高NK细胞的数量进而达到治疗癌症的目的。利用NK细胞疗法来治疗癌症有下列各种学理上的优势一、NK细胞是人体内抗癌活性最强的细胞，可直接杀死癌细胞抑制肿瘤的生长及扩散；二、NK细胞会抑制肿瘤附近新血管的增生，故可限制肿瘤取得所需要的养份进而限制肿瘤的生长；三、NK细胞可直接改善并调节患者的免疫力及神经系统，间接提高患者的生活质量；四、NK细胞会分泌一种叫做b-endorphin的脑内啡，可减少病患的疼痛令病患有愉悦感，间接提升生活质量 ’五、 副作用低或几乎无副作用。目前一些研究已指出，周边血液自然杀伤细胞所具有的毒杀范围除了包括黑色素瘤、头颈癌之外，还有肺、卵巢、子宫颈、膀胱、前列腺、肝细胞、胰脏、食道、乳房及许多合并的癌症。尤其对肺癌、淋巴癌、食道癌、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管较密集地区的癌症较有效。一般的状况下，我们身体以部位计算，会有5到15颗的癌细胞产生，那时，只要一颗NK细胞，就可以杀光这些癌细胞。但是，一但得了癌症，每一颗癌细胞，要250颗当时体内的NK细胞，才能杀死。因此，储存未得癌症前的战斗力高的NK细胞，在万一未来得癌时， 复制成多数以协助抗癌，是目前最有效、无副作用的制备治疗癌症的药物的方法。本发明实施例提供一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其是一种自冷冻的周边血液单核球细胞中增殖CD3—CD56+亚型自然杀伤细胞，并使增殖后的该自然杀伤细胞数目高于增殖前细胞数目至少五百倍的方法，其中该方法包含以下步骤(a)取得一周边血液样本；(b)由该周边血液样本取得一周边血液单核球细胞；(c)冷冻保存该周边血液单核球细胞；(d)将该周边血液单核球细胞解冻；以及(e)于体外使用含有一重组人类白血球间素的细胞培养液来增殖该周边血液单核球细胞中的一自然杀伤细胞；其中，该重组人类白血球间素选自以下任意一项或其组合重组人类白血球间素2号、重组人类白血球间素12号、重组人类白血球间素15 号、重组人类白血球间素18号、重组人类白血球间素21号。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，该周边血液单核球细胞取自一人类个体。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，该人类个体为一健康人类个体或一人类肿瘤患者。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，步骤(C)冷冻保存该周边血液单核球细胞，包含以下步骤(i)制备一含有90%人类个体自体血清和10%二甲基亚砜的混合液；(ii)将由该周边血液样本取得的该周边血液单核球细胞与该混合液混合；(iii)将含有该周边血液单核球细胞的该混合液置于摄氏1至10度之间，时间为一分钟至三小时；(iv)再将含有该周边血液单核球细胞的该混合液置于摄氏0度至零下40度之间， 时间为十分钟至四十八小时；(ν)再将含有该周边血液单核球细胞的该混合液置于摄氏零下50度至零下100度之间，时间为二十分钟至四十八小时；以及(vi)再将含有该周边血液单核球细胞的该混合液放置于含有液态氮的一冷冻保存装置中长期冷冻保存。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，步骤(iii)至(V)被下述步骤取代将含有该周边血液单核球细胞的该混合液放置于程控的一降温机中，并且以每分钟下降摄氏 0. 1度至5度的速度降温。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，步骤(V)被省略。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，于体外增殖该周边血液单核球细胞中的该自然杀伤细胞，包含以下步骤
(i)将冷冻保存的该周边血液单核球细胞解冻；(ii)以含有5%该人类个体的自体血清干细胞的培养液培养解冻后的该周边血液单核球细胞，并添加最终浓度为500-750U/ml的重组人类白血球间素2以及最终浓度为 10-20ng/ml 的鼠抗人 CD3 mAb ；(iii)于第六天后使用含3-5%该人类个体的自体血清的干细胞培养液培养，并加入该重组人类白血球间继续培养；其中，该重组人类白血球间素选自以下任意一项或其组合最终浓度为500U/ml的重组人类白血球间素2号、最终浓度为200U/ml的重组人类白血球间素12号、最终浓度为20-30ng/ml的重组人类白血球间素15号、最终浓度为100U/ml 的重组人类白血球间素18号、最终浓度为100U/ml的重组人类白血球间素21号。本发明提供的NK细胞增殖的方法，满足NK细胞疗法的条件，为制备治疗癌症的药物提供了一种切实可行的技术。本发明人等经锐意研讨，发现从冻存周边血液单核球细胞启动、增殖NK细胞的方法。所增殖的NK细胞是具有高肿瘤细胞毒杀活性的CD3—CD56+亚群。细胞培养条件在实施例中详细描述。根据本发明实施例结果，周边血液单核球细胞在体外培养5天后，NK细胞开始增殖，发明人等称之为启动阶段，在后续的1到10天过程培养中，发明人等称之为增殖阶段，NK细胞会继续增殖至100到500倍，甚至到1000倍。根据本发明实施例结果，启动并增殖的NK细胞与非体外增殖的NK细胞相比，细胞毒杀活性至少增加了 100%，较好的增加了 150%到200%，甚至最好的增加了 400%。本发明中非体外启动并增殖的NK细胞是指采用CD56抗体磁珠，阳性分选的新鲜NK细胞。体外启动并增殖NK细胞的细胞毒杀活性之所以增高可能是由于结合受体表达上调所介导的一种效应。本发明的实施例中描述了前述NK细胞启动、增殖的具体方法。需要强调的是，在以冷冻保存的周边血液单核球细胞启动、增殖NK细胞的培养体之中，由于周边血液单核球细胞是包含不同细胞群的混合物，例如⑶3TD56+亚群的NK细胞、NKT细胞(⑶3+CD56+)和 T细胞(CD3+)，所以在启动增殖后，除了大量增殖的CD3_CD56+亚群NK细胞外，还有其它细胞类型在启动增殖的培养体系中存在。根据本发明实施例结果，发明人等还详细设计了 NK细胞的临床施用方案。发明人等在一系列的NK细胞培养及其状态的观察过程中，发现NK细胞的最佳状态在培养的第9 到14天。根据细胞状态，发明人等将在第9-10天和13-14天换无血清培养基培养，48小时后换液，再经M小时其状态达到最佳，NK细胞的数目达到10-80亿之间。因此，此时为进行细胞回输至人体的最佳时机。根据本发明中NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒杀活性，本发明包括NK细胞能与其它癌症治疗手段联合给药或应用。例如与手术、放疗和细胞毒性药物的联合应用。同时，本发明相关的研究结果提示体外启动增殖的NK细胞与体内未启动的NK细胞相比具有明显的抗肿瘤能力。因此本发明也包括了 NK细胞对肿瘤的杀伤作用。而所说的肿瘤细胞是指自体肿瘤细胞。自体肿瘤细胞是指来源和再植入同一个体的细胞，也就是说，供体和受体是同一个人。上述的自体肿瘤细胞包含了血液肿瘤及实体肿瘤。与以往NK细胞增殖发明的方法比较，本发明包含以下几点明显的不同或优势1、本发明是抽取健康人类个体的周边血液，取出其中的周边血液单核细胞(PBMCs)以进行NK细胞的增殖，较之公知技术可以确保NK细胞的活力、质量、与毒杀活性皆处于健康而良好有效的状态。2、本发明在 NK 细胞增殖过程中，应用 rhIL-2、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18、 rhIL-21及其组合刺激增殖NK细胞，更有效的保证了 NK细胞具有高的细胞毒杀伤活性。3、本发明的增殖方法可以使得NK细胞在增殖后达到至少高于增殖前细胞数目五百倍的细胞数量。4、本发明在NK细胞增殖过程中，采用自体血清进行培养，使用NK细胞制造的肿瘤治疗药物更加安全。本发明中采用不同干细胞培养基混合培养NK细胞方案，有效降低了 NK细胞增殖的成本，也为NK细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。


为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1 (A)、⑶和(C)为本发明的方法中，于体外增殖周边血液单核球细胞(PBMCs) 中的自然杀伤细胞的较佳实施例的流程图。图2㈧和⑶分别为根据本发明的方法增殖NK细胞，在第11和15天NK细胞比例流式细胞仪检测图。图3为根据本发明的方法使用5名健康人周边血液单核球细胞(PBMCs)培养增殖的结果。图4为根据本发明的方法使用5名健康人的周边血液单核球细胞(PBMCs)培养增殖过程中NK细胞比例变化的结果。图5为根据本发明的方法使用5名健康人的周边血液单核球细胞(PBMCs)中NK 细胞培养增殖的结果。图6为根据本发明的方法增殖NK细胞，以K562细胞为靶细胞，进行细胞毒杀伤活性检测的结果。
具体实施例方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。在以下内容中，发明人将对如何从冻存周边血液单核球细胞中启动增殖NK细胞做详尽说明。同时，发明人会进一步说明所启动增殖NK细胞的细胞毒杀伤活性。这些数据为用NK细胞制造治疗肿瘤的药物提供了坚实的依据。实施例一请参照图1 (A)、图1 (B)、与图1 (C)。
研究样本来源周边血液来自5名健康献血者，献血者经临床诊断无血液系统恶性肿瘤和严重自身免疫性疾病。本研究获得当地研究伦理委员会同意，同时与所有献血者签署知情书。周边血液单核细胞(PBMCs)的提取、冷冻保存及复苏所有操作均严格遵守标准操作规程(SOP)的程序。采集20-40毫升受试者周边血液(约含3-6 X IO7个单个核细胞)。经FicolI-Hypaque密度梯度离心分离单个核细胞，分离的单个核细胞采用90%的自体血清和10%二甲基亚砜混合液进行冷冻保存。冷冻保存细胞时，较佳的实施例为先将其置于摄氏4度2小时，再放置于摄氏零下20度过夜，最后放置于含有液态氮的冷冻保存装置中长期保存，或者是先将含有90%的自体血清和10%二甲基亚砜以及周边血液单核细胞(PBMCs)的混合液放置于摄氏4度10分钟，再放置于摄氏零下20度30分钟，接着再放置于摄氏零下80度过夜，最后再放置于含有液态氮的冷冻保存装置中长期保存。另一种合适的降温方法为将含有90%的自体血清和10%二甲基亚砜以及周边血液单核细胞(PBMCs)的混合液放入使用程控的降温机中进行降温。冷冻保存细胞时，降温的速度较佳应当维持在每分钟下降摄氏1至3度，以免降温速度过快导致细胞破裂，或者降温速度过慢使细胞丧失活性。增殖周边血液单核细胞(PBMCs)时，取出冷冻细胞小管，投入摄氏37至40度水浴中复温，小管内容物全部融化后，吸出细胞以5倍体积的无血清RPMI 1640培养基稀释，以1200rpm/min的速度离心5分钟，丢弃上清液，洗涤两次，再用无血清RPMI 1640培养基重新悬浮。体外启动增殖冷冻保存的周边血液PBMCs中NK细胞的方法将所得的PBMCs离心，重新悬浮于含5%人自体血清干细胞培养基中，以 0. 5XlOVml细胞密度铺入培养瓶中，加入重组人类白血球间素2号(Recombinant human Interleukin 2，rhIL-2，最终浓度为 500_750U/ml)和鼠抗人 CD3mAb (最终浓度为 10_20ng/ ml)，培养5天。第6天计数细胞，Hanks液洗涤1_2次后，加入含3_5%人自体血清的干细胞培养基，这些干细胞培养基可含有rhIL-2 (最终浓度为500U/ml)、rhIL-12 (最终浓度为 200U/ml)、rhIL-15(最终浓度为 20-30ng/ml)、rhIL_18 (最终浓度为 100U/ml)、rhIL_21 (最终浓度为100U/ml)中的一种或其组合，随后重新悬浮细胞，使细胞密度维持在0. 5 XlOVml 左右。较佳的实施例为，在0、10-11、14-15天计数细胞、用流式细胞仪检测细胞比例并详细记录细胞增殖数目(图幻，根据细胞的增殖情况酌情补加含3-5%人自体血清的干细胞培养基，这些干细胞培养基可为rhIL-2 (最终浓度为500U/ml)、rhIL-12 (最终浓度为200U/ ml)、rhIL-15 (最终浓度为 20_30ng/ml)、rhIL_18 (最终浓度为 100U/ml)、rhIL_21 (最终浓度为100U/ml)中的一种或其组合，使细胞密度维持在0. 5 XlOVml左右。以本发明的方法增殖而得的自然杀伤细胞，可以连同适当体积的该人类自体血清与适当体积的生理食盐水，运用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合的范畴。其所制备的药物可利用静脉注射的方式回输至该人类个体体内。为了验证NK细胞启动增殖的效率，发明人等在5名献血者的冷冻保存的周边血液 PBMCs中，进行了 NK细胞的增殖实验。在5名健康供血者的PBMCs细胞中，启动增殖前经流式细胞仪分析，确认⑶3_CD56+亚群NK细胞为总细胞的9. 7% 士2. 1 %，⑶3+细胞，主要是 T细胞为总数的61% 士8%。在经过15天的启动增殖后，细胞总数增殖了 135士 11倍(图 3)。而NK细胞的比例由增殖前的9. 7% 士 2. 增长为62% 士 3.6% (图4)，由于NK细胞比例的增高，发明人等计算得出NK细胞的增殖倍数为888士 165(图5)倍。以上结果均证实发明人等可有效的从冻存周边血液PBMCs启动增殖NK细胞，而且所增殖的NK细胞主要是⑶3TD56+亚群细胞。根据体外增殖NK细胞的实际制作，在细胞培养第9-16天即可通过静脉注射，施打于个案身上，其中较佳的实施态样为细胞培养第10-11天与第14-15天，预计个案体内可看到NK细胞的大量持续增殖。实施例二 NK细胞毒杀活性检测方法收集对数生长期K562细胞、培养第5、15天启动增殖NK细胞及体外利用细胞磁珠阳性分选的NK细胞。以K562细胞为靶细胞，调整细胞浓度为1 XlO5Ail。以NK细胞为效应细胞，根据不同的效靶比分别调整细胞浓度为1 X 105/ml、1. 5 X 105/ml、1 X 106/ml。按不同效靶比(1 1、5 UlO 1)将效应细胞和靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔、效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置于37°C、5%C02、饱和湿度培养箱中培养12小时后，每孔加入IOul的CellCounting kit_8(日本同仁化工)，混勻，于37°C、 5% CO2、饱和湿度培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定每孔450nm波长处OD值。细胞毒杀活性计算方法求出平行孔的平均值，按以下方法计算各组NK细胞毒杀活性，以杀伤率％表示。细胞毒杀活性=[1_(靶细胞孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]X100%本发明人等为检测比较所启动增殖NK细胞的细胞毒杀伤活性，以K562细胞为靶细胞，对比了体外利用细胞磁珠阳性分选的NK细胞和应用本发明增殖5及15天的NK细胞的细胞毒杀伤活性。在靶效比为1 10时，经15天启动增殖的NK细胞毒杀伤活性为65% 士 10%，经5天启动增殖的NK细胞毒杀伤活性为51 % 士6. 3%，而细胞磁珠阳性分选的NK 细胞毒杀伤活性仅为9% 士3.2%。在靶效比为1 5时，三者的细胞毒杀伤活性分别为 51% 士8. 2%、39% 士5. 1%、7% 士2. 4%。在靶效比为1 1时，三者的细胞毒杀伤活性分别为31% 士5. 6^^22% 士3. 7^^4% 士 1.4% (图6)。以上结果揭示本发明所启动增殖的 NK细胞，对肿瘤细胞具有高的杀伤活性。以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
10
权利要求
1.一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其是一种自冷冻的周边血液单核球细胞中增殖CD3—CD56+亚型自然杀伤细胞，并使增殖后的该自然杀伤细胞数目高于增殖前细胞数目至少五百倍的方法，其中该方法包含以下步骤(a)取得一周边血液样本；(b)由该周边血液样本取得一周边血液单核球细胞；(c)冷冻保存该周边血液单核球细胞；(d)将该周边血液单核球细胞解冻；以及(e)于体外使用含有一重组人类白血球间素的细胞培养液来增殖该周边血液单核球细胞中的一自然杀伤细胞；其中，该重组人类白血球间素选自以下任意一项或其组合重组人类白血球间素2号、重组人类白血球间素12号、重组人类白血球间素15号、重组人类白血球间素18号、重组人类白血球间素21号。
2.根据权利要求1所述的人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其中，该周边血液单核球细胞取自一人类个体。
3.根据权利要求2所述的人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其中，该人类个体为一健康人类个体或一人类肿瘤患者。
4.根据权利要求1所述的人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其中，步骤(c)冷冻保存该周边血液单核球细胞，包含以下步骤(i)制备一含有90%人类个体自体血清和10%二甲基亚砜的混合液；( )将由该周边血液样本取得的该周边血液单核球细胞与该混合液混合；(iii)将含有该周边血液单核球细胞的该混合液置于摄氏1至10度之间，时间为一分钟至三小时；(iv)再将含有该周边血液单核球细胞的该混合液置于摄氏0度至零下40度之间，时间为十分钟至四十八小时；(ν)再将含有该周边血液单核球细胞的该混合液置于摄氏零下50度至零下100度之间，时间为二十分钟至四十Λ小时；以及(vi)再将含有该周边血液单核球细胞的该混合液放置于含有液态氮的一冷冻保存装置中长期冷冻保存。
5.根据权利要求4所述的人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其中，步骤(iii)至(ν) 被下述步骤取代将含有该周边血液单核球细胞的该混合液放置于程控的一降温机中，并且以每分钟下降摄氏0. 1度至5度的速度降温。
6.根据权利要求4所述的人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其中，步骤(ν)被省略。
7.根据权利要求1所述的人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其中，于体外增殖该周边血液单核球细胞中的该自然杀伤细胞，包含以下步骤(i)将冷冻保存的该周边血液单核球细胞解冻；( )以含有5%该人类个体的自体血清干细胞的培养液培养解冻后的该周边血液单核球细胞，并添加最终浓度为500-750U/ml的重组人类白血球间素2以及最终浓度为 10-20ng/ml 的鼠抗人 CD3 mAb ；(iii)于第六天后使用含3-5%该人类个体的自体血清的干细胞培养液培养，并加入该重组人类白血球间继续培养；其中，该重组人类白血球间素选自以下任意一项或其组合最终浓度为500U/ml的重组人类白血球间素2号、最终浓度为200U/ml的重组人类白血球间素12号、最终浓度为20-30ng/ml的重组人类白血球间素15号、最终浓度为100U/ml的重组人类白血球间素18号、最终浓度为100U/ml的重组人类白血球间素21号。
全文摘要
本发明提供一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其从健康人类个体的周边血液单核细胞(PBMCs)中培养自然杀伤细胞，并且使自然杀伤细胞经本发明方法增殖过后，可达到至少高于增殖前五百倍的细胞数目，而且还能保持自然杀伤细胞的毒杀活性，为人类自然杀伤细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。
文档编号C12N5/0786GK102533648SQ20111003639
公开日2012年7月4日 申请日期2011年2月11日 优先权日2010年12月31日
发明者李光辉 申请人:李光辉