专利名称：用人间充质干细胞为滋养层培养诱导多能干细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种以人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养诱导多能干细胞的方法。
背景技术：
诱导多能干细胞anduced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。其是通过异位表达几个与维持胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)多潜能性相关的关键性核转录因子，使体细胞发生重编程，得到的一种类似ESCs的多潜能细胞，可以在体内外分化为三胚层的所有组织细胞。由体细胞重编程而来的iPSCs为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径，且不再使用人类早期胚胎和卵母细胞，故伦理学的争论将随之平息，核移植技术缺乏卵母细胞和技术繁杂的窘境也得到了合理的解决。是组织工程和再生医学、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞，因此具有广阔的临床应用背景。目前，研究者已在体外将人iPSCs向各种组织细胞诱导分化，如造血干/祖细胞、红细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、胰岛β细胞、肝脏细胞等； 建立了多种遗传性疾病人iPSCs疾病模型，用于发病机制的研究，并在动物模型上尝试通过对有遗传缺陷的iPSCs进行基因改造，治疗遗传性疾病；建立多种肿瘤iPSCs疾病模型， 用于发病机制的研究和药物筛选。人iPSCs的体外培养需要细胞与细胞的相互作用、各种细胞因子、基质等来维持其自我更新和多潜能性。其经典培养模式是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic fibroblasts, MEF)为滋养层，用含bFGF、血清替代物(serum replacement, SR)的培养液培养。但是，人iPSCs进入临床应用前，去除培养体系中异源蛋白、细胞污染是必须解决的一个问题。因此，自人iPSCs出现以后，研究者就开始尝试改善其培养体系，在维持其自我更新和多潜能性的同时，减少异源蛋白、细胞的污染。如2010年，Christian等用永生化的人皮肤成纤维细胞作为滋养层，培养人iPSCs，发现这种人源化的滋养层可产生和维持人 iPSCs的培养，但其培养时间较短(报道的培养代数为7代)；同年，Kristiina等用一种成分明确的无异源蛋白的RegES培养液培养人iPSCs，发现其能长期(> 80代)维持iPSCs的自我更新和多潜能性，但是并没有证明在重编程过程中，该培养液可使人体细胞重编程为 iPSCs。Ruth等用另一种成分明确的mTeSRTM培养液悬浮培养人iPSCs，发现培养17代后， 仍可维持其自我更新和多潜能性，但是该培养体系价格昂贵，且同样没有证明在重编程过程中，该培养液可使人体细胞重编程为iPSCs。因此，进一步开发研究人iPSCs人源化的培养体系，包括重编程过程和维持培养，以及对iPSCs生物学特性的影响，是人iPSCs走向临床应用的重要前提。
发明内容
本发明的目的是提供一种用人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)作为滋养层培养人诱导多能干细胞(iPSCs)的方法，通过以下技术方案实现(1)滋养层细胞的准备用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三 第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞。人骨髓间充质干细胞采用目前常用的Ficoll-paque密度梯度离心结合贴壁筛选分离培养获得。作为滋养层时，细胞接种到用0. l%gelatin处理后的六孔板上，细胞融合度达80%-90% (约2X 104/cm2)，并用10ug/ml的丝裂霉素C处理2小时灭活，灭活后的细胞M小时内使用；
(2)人iPSCs的获得取2-3岁儿童包皮成纤维细胞，用携带有Klf4、Sox2、0ct4和 c-Myc转录因子的逆转录病毒转染两次。第二天在培养体系中加维生素C 25ug/ml，第五天加入VPA2 μ M (共使用5天)，第六天将转染后的成纤维细胞接种到滋养层细胞上，第七天， 换用含bFGF、替代血清的人ESCs培养液。随后每天换液，直到出现类ESCs的克隆，挑选、扩增培养；
(3)人iPSCs的扩增培养显微镜下挑选类ESCs的克隆，用IV型胶原酶消化5-10分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上。每天换液。每7-8天传代一次。 扩增后的细胞用机械法传代，即用5ml的玻璃滴管将细胞从滋养层上轻轻刮下，随后轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上；
(4)人iPSCs的生物学特性和多潜能性的维持在以人骨髓间充质干细胞为滋养层上扩增培养14代以后，用RT-PCR法鉴定扩增培养后人iPSCs的ESCs特异基因表达情况；同时用EB形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否可向三胚层分化。本发明提供了一种用人源化细胞即人骨髓间充质干细胞作为滋养层获得培养人 iPSCs的方法，这种人源化的滋养层细胞可长期维持人iPSCs的生物学特征和多潜能性；由此获得的人iPSCs没有异源细胞的污染，为其临床应用提供了可能性。本发明使用人骨髓间充质干细胞代替传统方法中用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增(见实施例4)，且维持了其生物学特性和多潜能性(见实施例5)，为人诱导多能干细胞进入临床应用提供了可能。
图1为技术路线图。图2为第4代人骨髓间充质干细胞。A为灭活前；B为丝裂霉素C灭活后。图3为用人骨髓间充质干细胞作为滋养层获得的人iPSCs。A为成纤维细胞转染 21-25天后，出现的肉芽肿样克隆(标尺为100 μ m)，B为扩增培养后形成的iPSCs克隆(标尺为100 μ m)，C为克隆局部细胞形态(标尺为20 μ m)。图4为第8-11代人iPSCs在以第4代人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中的生长曲线。图5为第9、10代人iPSCs在不同供者来源第4代人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中的扩增倍数(hMSCl和hMSC2为女性供者来源，hMSC3为男性供者来源)。图6为RT-PCR检测人iPS/MSC7在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后人ESCs特异基因的表达情况。图7为人iPS/MSC7在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后在体外形成EB向三胚层分化情况。A为EB培养8天后形成的悬浮EB(标尺为50 μ m);B-D为培养14天后EB贴壁分化成的各种类型细胞(标尺为100 μ m) ;E为PT-PCT检测EB 分化后多潜能基因(S0X2和0CT4)和三胚层的标记基因(F0XA2和AFP为内胚层标记基因； MSXl和BRACHYURY为中胚层标记基因；MAP2和PA)(6为外胚层标记基因)表达情况(U表示未分化，D表示分化后)。图8为人iPS/MSC7在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后在NOD-SCID小鼠体内形成畸胎瘤情况。A为长出畸胎瘤的小鼠；B为畸胎瘤内形成的腺样组织(HE染色，标尺为20 μ m);C为畸胎瘤内形成的肌肉样组织(HE染色，标尺为20 μ m)。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1 人骨髓间充质干细胞分离培养、冻存复苏 (1)人骨髓间充质干细胞分离培养
无菌条件下采集3份健康供者的骨髓，肝素抗凝，用Ficoll-paque (比重1. 077)密度梯度离心收集单个核细胞，以5X IO5个细胞/cm2密度接种，培养液为含10% (V/V)胎牛血清和1%谷氨酰胺的低糖DMEM (LG-DMEM)培养液，置于37%、5%0)2培养箱培养。M小时后更换培养液，弃去非贴壁细胞，可见有梭形贴壁细胞。之后每3天换液1次，14天左右原代细胞贴壁融合达90%-95%，排列有明显方向性，成漩涡状、网状、辐射状(见图2A)。用0. 25% 胰蛋白酶-1 mmol EDTA消化，按1 :3比例分瓶传代培养，并标记为Pl细胞。传代培养过程中每3天换液一次，细胞达90%融合后消化传代，并标记为P2，以此类推。(2)人骨髓间充质干细胞的冻存和复苏
冻存时，将处于对数生长期的间充质干细胞消化后，用冻存保护液(60% LG-DMEM、30% 胎牛血清、10% DMSO)重悬细胞，细胞终浓度为5 X 106/ml，分转入冻存管内，标记上细胞名称、代数、冻存时间和冻存者。立即将冻存管放入异丙醇冻存盒后，放入_80°C，过夜后移入-196 液氮罐保存。细胞复苏时，从液氮中取出细胞放入37 恒温水浴箱快速解冻，待冻存液解冻至小冰晶后，移入超净台。无菌条件下，将细胞悬液移入15ml离心管，逐滴加入预冷的培养液10ml，200g离心5min后，弃去上清。将细胞团块用适量预热培养液重悬培养。 复苏存活细胞接种他后完全贴壁，细胞形态逐渐变成梭形。细胞经过1-2天休眠期后开始迅速增殖。复苏后的细胞形态与冻存前基本一致。实施例2 人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞的准备
取第3-5代人骨髓间充质干细胞作为滋养层的细胞。将6孔板预先用0. l%gelatin在 37°C孵育Ih到过夜。人骨髓间充质干细胞以2X IOVcm2密度接种到gelatin处理后的六孔板上，使第二天细胞融合度达80%-90%。用10ug/ml的丝裂霉素C处理2小时灭活，灭活后的细胞形态与灭活前基本一致(见图2)。灭活后的细胞M小时内使用。实施例3 以人骨髓间充质干细胞为滋养层的人iPSCs的诱导
取第三代儿童(2-3岁)包皮成纤维细胞，用携带有Klf4、Sox2、0ct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒转染两次。转染结束后在培养体系中加维生素C 25ug/ml直到挑选克隆， 第五天加入VPA2 μΜ(共使用5天)，第六天将转染后的成纤维细胞接种到以人骨髓间充质干细胞滋养层细胞上，第七天换用含8ng/ml的bFGF、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、100 μ M 和20%替代血清的人ESCs培养液。随后每天换液，直到出现类ESCs的克隆(见图3Α)，边界清楚、细胞致密。显微镜下逐个挑选、扩增培养。技术路线见图1
实施例4 以人骨髓间充质干细胞为滋养层的人iPSCs的扩增培养 (1)人iPSCs在以人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养后的细胞形态显微镜下挑选类ESCs的克隆，用lmg/ml的IV型胶原酶消化5_10分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上，用人ESCs培养液，在37乂、5%0)2中培养。每天换液。iPSCs每7-8天传代一次。扩增后的细胞用机械法传代，即用5ml的玻璃滴管将细胞从滋养层上轻轻刮下，随后轻轻吹散成小团块，以1 :2-1 :3接种到准备好的滋养层细胞上。人 iPSCs在以人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增后形成典型的人ESCs样克隆 边界清楚，细胞致密，大部分细胞为圆形，核仁明显，边界为类成纤维样细胞(见图3B、C)。(2)人iPSCs在以人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中的生长动力学将第 8 代的三株人 iPSCs (iPS/MSCl、iPS/MSC7 和 iPS/MSC10)以 5X IO4 细胞 / 孔接
种(以小团块接种)到铺有人骨髓间充质干细胞为滋养层的12孔板中，设三个复孔。培养 7天后，将人iPSCs从滋养层上刮下，取部分计数，计算扩增倍数；同时取其中部分接种到新的铺有人骨髓间充质干细胞为滋养层的12孔板中，设三个复孔，继续培养7天，计数并计算扩增倍数。以此类推，共培养三代，计算扩增倍数。人iPSCs在以人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中可持续扩增，平均每代扩增2. 32士0. 05倍(见图4)。(3)人iPSCs在不同供者来源的人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中的生长情况
将第 9、10 代的三株人 iPSCs (iPS/MSCl、iPS/MSC7 禾口 iPS/MSC10)以 5 X IO4 细胞 / 孔接种(以小团块接种)到铺有不同供者来源的人骨髓间充质干细胞(hMSCl、hMSC2、hMSC3，其中hMSCl和hMSC2为女性供者，hMSC3为男性供者)为滋养层的12孔板中，设三个复孔。培养7天后，将人iPSCs从滋养层上刮下，取部分计数，计算扩增倍数。不同供者来源的骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系对人iPSCs细胞的扩增没有显著差异(见图5)。实施例5 人iPSCs在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后生物学特性和多潜能性的维持情况
(1)人iPSCs表达人ESCs特异基因情况
收集在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后的人iPSC/ MSC7细胞团块，用TRIZOL提取总RNA，随后进行RT-PCR，检测人ESCs特异基因的表达情况包括内源性 KLF4、S0X2、c-Myc、0CT4 以及 NANOG、DNMT3B、DPPA4、hTERT、NODAL、REX13、 TDGFl等。同时以Hl人ESCs和儿童包皮成纤维细胞为对照。检测结果显示这些基因在人 iPSCs中的表达水平类似于Hl人ESCs。(2)人iPSCs在体外形成EB向三胚层分化情况
在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后的人iPSC/MSC7从滋养层上刮下，以细胞团块接种在超低黏附性6孔板中，培养液为不含bFGF的人ESCs培养液，在37%、5%0)2中培养，隔天换液；培养8天后，接种到0. l%gelatin处理后的6孔板中， 继续用不含bFGF的人ESCs培养液，在37%、5%0)2中贴壁培养8天。实验结果显示扩增后的人iPSCs可在体外形成EB (见图7A)，这些EB贴壁培养后，可分化成各种类型的细胞(见图7B-D)。收集这些分化的细胞，用RT-PCR检测三胚层标记性基因的表达情况，结果显示分化后的细胞三胚层标记基因(F0XA2和AFP为内胚层标记基因；MSXl和BRACHYURY为中胚层标记基因；MAP2和PAX6为外胚层标记基因)表达明显增加。表明在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后的人iPSCs仍维持了其多向分化潜能。
(3)人iPSCs在体内形成畸胎瘤向三胚层分化情况
将在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后的人iPSC/MSC7 从滋养层上刮下，用不含钙镁离子的PBS缓冲液清洗两遍，用PBS将人iPSCs重悬，取200ul 注射到NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每个注射点的细胞数量为2-3X106。注射后观察成瘤情况。待畸胎瘤形成后，取出畸胎瘤行石蜡切片和HE染色，观察其向三胚层分化情况。实验结果显示扩增后的人iPSCs可在免疫缺陷小鼠体内形成畸胎瘤(见图8A)，HE染色后见瘤内有肌肉样、腺样组织形成(见图8B、C)。表示在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后的人iPSCs仍维持了其多向分化潜能。
权利要求
1.一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现(1)滋养层细胞的准备用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三 第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞，细胞接种到用0. l%gelatin处理后的六孔板上，细胞融合度 80%-90%，并用10ug/ml的丝裂霉素C处理2小时灭活，灭活后的细胞M小时内使用；(2)人诱导性多能干细胞的获得取2-3岁儿童包皮成纤维细胞，用携带有Klf4、Sox2、 0ct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒转染两次，第二天在培养体系中加维生素C 25ug/ml, 第五天加入VPA2 μ Μ,第六天将转染后的成纤维细胞接种到滋养层细胞上，第七天，换用含bFGF、替代血清的人ESCs培养液，随后每天换液，直到出现类ESCs的克隆，挑选、扩增培养；(3)人诱导性多能干细胞的扩增培养显微镜下挑选类ESCs的克隆，用IV型胶原酶消化5-10分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上，每天换液，每7-8天传代一次，扩增后的细胞用机械法传代；(4)人诱导性多能干细胞的生物学特性和多潜能性的维持在以人骨髓间充质干细胞为滋养层上扩增培养14代以后，用RT-PCR法鉴定扩增培养后人诱导性多能干细胞的ESCs 特异基因表达情况，同时用EB形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否可向三胚层分化。
2.根据权利要求1所述的一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，步骤(3)所述扩增培养是用5ml的玻璃滴管将细胞从滋养层上轻轻刮下，随后轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上。
全文摘要
本发明提供一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导多能干细胞的方法，用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三~第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞，从儿童包皮成纤维细胞获得人iPSCs，经扩增培养，接种到滋养层细胞，诱导多能干细胞。本发明使用人骨髓间充质干细胞代替传统方法中用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了人iPSCs的生物学特性和多潜能性，为人诱导多能干细胞进入临床应用提供了可能。
文档编号C12N5/0775GK102161980SQ201110036898
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月12日 优先权日2011年2月12日
发明者张丽飞, 郑伟燕, 黄河 申请人:浙江大学