鞘氨醇单胞菌属菌株及其在水处理中的应用的制作方法

专利名称：鞘氨醇单胞菌属菌株及其在水处理中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境工程、生物工程技术领域。具体涉及鞘氨醇单胞菌属菌株及其对含氮工业废水、生活污水的短程硝化一反硝化脱氮以及在受污染水源水中处理应用。
背景技术：
近年来，随着工农业生产的快速发展和社会的进步，排入水体的污染物大量增加， 其中含氮废水的排放也急剧增加，导致我国主要河流、五大淡水湖及近海水体富营养化，藻类水华频繁暴发。进入水体的氨氮被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，消耗大量氧气，降低了水体质量，严重危害着水生生态系统安全。同时，超标的亚硝酸盐和硝酸盐也严重威胁着人类健康。面对越来越严重的水体氮污染状况，加强和深化废水脱氮技术的研究，尤其是筛选高效脱氮微生物、开发新型脱氮技术具有实际意义和价值。目前，纯种高效脱氮微生物的筛选， 因其脱氮速率快，脱氮效果好，能从生物地球化学循环的途径进行脱氮，并且对COD具有一定的去除效果越来越受到研究者的关注和重视。而对于具有革新脱氮工艺、生态安全性的微生物菌种的筛选更具有重要意义。加强生物脱氮技术方向主要有两个方面首先，开发新的工艺技术、优化反应器； 其次，筛选高效脱氮微生物。改进的成果主要有1)开发出了亚硝酸盐型硝化反硝化技术 (SHARON工艺、OLAND工艺)、同时硝化反硝化技术、厌氧氨氧化技术(SHAR0N-AN0MM0X工艺、 CANON工艺、OLAND工艺)、好氧脱氨技术。其中，短程脱氮技术因其具有显著的优点受到了研究者的重视，短程脱氮是在脱氮过程中仅将氨氮氧化成亚硝酸盐，然后进行短程反硝化， 相比于全程脱氮需要将氨氮及亚硝酸盐氧化，产物是硝酸盐，这一过程大大节约了碳源、能耗以及基建和运行费用、减少反应容积。由于其具有上述各种优点，短程硝化技术已成为生物脱氮领域研究的热点之一。2)筛选出可应用于环境治理的各种微生物菌种；目前，国内外在微生物应用于环境治理方面进行了广泛研究，分离出各种微生物菌种，取得了较好的效果，主要集中于鞘氨醇单胞菌对难降解有机物降解、养殖废水中和土壤中的应用(如李华等，2010 年，化工环保，固定化如cier sp. Ik临邾 Sphingomorms sp. FG03 降解苯酚；黄海东等，2010，天津农学院学报，菌株N3和TP-3的分类鉴定及保水效果研究；何丽媛，2010，环境科学学报，混合菌对原油的降解及其降解性能的研究)，申请了部分国家发明专利(鞘氨醇单胞菌属菌株及其在葱醒染料废水脱色中的应用，发明专利号ZL 200410020832. 6 ；少动鞘氨醇单胞菌在鳗鲡养殖中的应用，专利申请号200510083414 . 6 ；红树植物根际促生固氮菌(DZY - N56 )及其应用，专利申请号200810(^8955. 2 ；减少亚硝胺类的微生物和用其减少亚硝胺类的方法；专利号ZL 03810579. 9)。迄今为止，虽然筛选出多种环境治理微生物菌种，但其应用却主要集中在有机废水尤其是含难降解有机物废水的处理方面。而在废水脱氮新技术一短程脱氮方面，主要通过亚硝化控制技术——控制温度、DO、pH值、游离氨浓度(FA)等条件筛选出氨氧化细菌， 淘汰亚硝酸盐氧化细菌，实现亚硝酸盐积累。但这些方法同时也存在控制条件苛刻和容易向全程硝化转化的缺点，从而局限了其应用。而通过采用微生物技术筛选出的短程高效脱氮微生物较少(水生丛毛单胞菌属菌株及其在废水生物脱氮中的应用，发明专利号 ZL200810020649.4)，因此，筛选高效脱氮效果、具有生态安全性的微生物菌种具有重要意义。

发明内容
本发明需要解决的问题是为含氮废水的生物处理提供高效的短程硝化一反硝化菌制剂，强化含氮废水的脱氮处理，从自然界中分离出的一株鞘氨醇单胞菌属菌，分离自我国太湖水体，为本土菌种，生物安全性高，能够以(X)2为碳源及能量或者以(X)2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源生长，通过将氨氮转化为亚硝酸盐氮，再将亚硝酸盐氮转化为氮气实现短程硝化一反硝化，对含氮废水具有高效的脱氮作用。在含氮废水脱氮中具有广泛的应用前景。本发明的技术解决方案是，本发明提供的鞘氨醇单胞菌sp. LZff3, 于2011年1月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号 CGMCC No . 4589。该鞘氨醇单胞菌属菌株是从太湖水体水生植物根区、太湖水体敞水区以及太湖沉积物中采集、分离得到。具体筛选步骤如下
用预先灭菌的分层水样采集器，采集太湖沉积物界面以上不同深度的水样0. 25L，分装于预先灭菌的棕色玻璃瓶；用预先灭菌的彼得森采泥器(l/16m2)采集太湖表层沉积物(厚度约为IOcm)，放入已灭菌的不锈钢容器中；用预先灭菌的针管(15cmX 1. 5cm)采集太湖水生植物根区水样，装于预先灭菌的棕色玻璃瓶，上述样品取样后立即封口，作为菌源进行分离，富集培养。在无菌条件下，将水样加到氨氧化细菌富集培养基中(氨氧化细菌培养基成分为(NH4)2SO4 0. 2g, K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g, H2O 100ml, pH值7. 2，其中培养基在121°C湿热灭菌20min后使用)，置于摇床上在条件下培养48h。然后再转到氨氧化细菌的固体培养基中，固体培养基成分为(NH4)2SO4 0. 2g， K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g，琼脂 2g, H2O 100ml, pH 值 7. 2，将扩培后的菌种进行平板划线初步分离，平板在培养48h。根据平板上长出的单个微生物，选择其中长势较好的进行再次富集培养。最后在固体培养基上反复进行平板划线分离，分离出一株对氨氮和亚硝酸盐氮具有高效降解能力的鞘氨醇单胞菌属菌株。该鞘氨醇单胞菌属菌株在pH值6. 5、. 5培养基介质中培养，适合的生长温度为 25^35 0C ；其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.5 1.0X1 3 ym，无鞭毛， 好氧或厌氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，以(X)2为碳源及能量或者以(X)2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源生长。该菌在固体培养基上培养15 20天，菌落小，呈圆形，边缘光滑，表面光滑，菌体呈现淡黄色，极易挑起。依据该菌株形态学以及分子生物学分析，可鉴定其为鞘氨醇单胞菌属的菌株。 用PCR仪(GeneAmp，PCR system 9700 )进行扩增反应。扩增反应体积为10XTaq聚合酶反应缓冲液 5 μ L，dNTP(20mmol/L)5y L,5'端和 3'端引物(25/7mol/μ L)各 2 μ L， Mg2+ (25mmol/L) 6 μ L，菌体 DNA (约 50ng/ μ L) 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 5 μ L，Η2028· 5 μ L，总体积50 μ L。反应条件为首轮循环94°C变形2min ；在接94°C 30s, 50°C 30s， 72°C lmin,30个循环；最后72°C延伸lOmin。1. 5%的琼脂糖凝胶，EB染色后紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与^^i/^oMwas sp.相似度高达99%以上、 可重复性99%。本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株对氨氮的降解能力极强，经该菌株作用后，氨氮在可见光区最大吸收峰(412nm)消失，从而降低废水中的氨氮浓度。该鞘氨醇单胞菌属菌株通过将亚硝酸盐氮转化为氮气，使得亚硝酸盐氮在可见光区最大吸收峰(540nm)消失，从而降低废水中的亚硝酸盐氮。该鞘氨醇单胞菌属菌株既可在富营养培养基中生长，也可在以(X)2为碳源及能量或者以(X)2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源的基础培养基中生长。本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或是固定化菌株对氨氮进行降解处理。本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或是固定化菌株先将氨氮转化为亚硝酸盐氮，然后将亚硝酸盐氮转化为氮气，通过短程硝化一反硝化作用对含氮废水进行高效降解处理。本发明所达到的有益效果是本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株，分离自我国太湖水体，为本土菌种，生物安全性高，能够以CO2为碳源和能量或者以(X)2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或者硝态氮为氮源生长，对氨氮和亚硝酸盐具有较强的转化能力，降解速度快，降解率高达90%以上。该菌株可作为游离生物菌制剂或固定化菌株，投加到现有的废水处理系统中，对含氮废水进行短程硝化一反硝化处理，提高原处理系统的反应效率，降低能耗，缩短反应时间，增强原处理系统的处理能力和效率，在工业水、生活污水处理以及受污染水源水净化中具有广阔的应用潜力。


图1.鞘氨醇单胞菌属菌株去除氨氮能力
一 ▲一进水氨氮浓度(mg/L)，一□一出水氨氮浓度(mg/L)，一 一氨氮去除率 (100%)
图2.鞘氨醇单胞菌属菌株去除亚硝酸盐能力(葡萄糖和(X)2为混合碳源) 一 ▲一进水亚硝酸盐浓度(mg/L)，一 □一出水亚硝酸盐浓度(mg/L)，一 ▼一亚硝酸盐去除率
图3.鞘氨醇单胞菌属菌株去除亚硝酸盐能力(乙酸钠和(X)2为混合碳源) 一 ▲一进水亚硝酸盐浓度(mg/L)，一 □一出水亚硝酸盐浓度(mg/L)，一 ▼一亚硝酸盐去除率
图4.鞘氨醇单胞菌属菌株硝化一反硝化去除氨氮能力
一 ■一进水氨氮浓度(mg/L)，一▲一出水氨氮浓度(mg/L)，一Δ—出水亚硝酸盐浓度 (mg/L)，一·一氨氮去除率
图5.实验反应装置，(1).流化床；(2).取样口 ；(3).转子流量计；(4).空压机； (5).增压泵；(6).循环水槽；(7).加热装置
图6.流化床系统对含氨氮废水短程硝化的应用一· 一进水氨氮浓度，一〇一出水氨氮浓度，一 ▲一亚硝化率，一 一氨氮去除率图7.流化床系统对含亚硝酸盐氮有机废水短程反硝化的应用 -■ 一进水亚硝酸盐浓度，-· 一出水亚硝酸盐浓度，一▲一氮负荷速率图8.流化床系统对含氨氮有机废水短程硝化一反硝化的应用一 ▲一进水氨氮浓度，一〇一出水氨氮浓度，一 一氨氮去除率，一 Δ—出水硝酸盐浓度，一 ■一总氮去除率
图9固定化鞘氨醇单胞菌对太湖水源地总氮的去除应用研究一■一空白，一 一微生物，一▲一植物，一▼一植物+微生物图10固定化鞘氨醇单胞菌对太湖水源地氨氮的去除应用研究一■一空白，一 一微生物，一▲一植物，一▼一植物+微生物。
具体实施例方式实施例1本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株的筛选步骤
用预先灭菌的分层水样采集器，采集太湖沉积物界面以上不同深度的水样0. 25L，分装于预先灭菌的棕色玻璃瓶；用预先灭菌的彼得森采泥器(l/16m2)采集太湖表层沉积物(厚度约为IOcm)，放入已灭菌的不锈钢容器中；用预先灭菌的针管(15cmX 1. 5cm)采集太湖水生植物根区水样，装于预先灭菌的棕色玻璃瓶，上述样品取样后立即封口，作为菌源进行分离，富集培养。在无菌条件下，将水样加到氨氧化细菌富集培养基中(氨氧化细菌培养基成分为(NH4)2SO4 0. 2g, K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g, H2O 100ml, pH值7. 2，其中培养基在121°C湿热灭菌20min后使用)，置于摇床上在条件下培养48h。然后再转到氨氧化细菌的固体培养基中，固体培养基成分为(NH4)2SO4 0. 2g， K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g，琼脂 2g, H2O 100ml, pH 值 7. 2，将扩培后的菌种进行平板划线初步分离，平板在培养48h。根据平板上长出的单个微生物，选择其中长势较好的进行再次富集培养。最后在固体培养基上反复进行平板划线分离，分离出一株对氨氮和亚硝酸盐氮具有高效降解能力的鞘氨醇单胞菌属菌株。该鞘氨醇单胞菌属菌株在pH值6. 5、. 5培养基介质中培养，适合的生长温度为 25^35 0C ；其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.5 1.0X1 3 ym，无鞭毛， 好氧或厌氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，以(X)2为碳源及能量或者以(X)2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源生长。该菌在固体培养基上培养15 20天，菌落小，呈圆形，边缘光滑，表面光滑，菌体呈现淡黄色，极易挑起。依据该菌株形态学以及分子生物学分析，可鉴定其为鞘氨醇单胞菌属的菌株。 用PCR仪(GeneAmp，PCR system 9700 )进行扩增反应。扩增反应体积为10 X Taq聚合酶反应缓冲液 5 μ L，dNTP(20mmol/L)5y L,5'端和 3'端引物(25/7mol/μ L)各 2 μ L， Mg2+ (25mmol/L) 6 μ L,菌体 DNA (约 50ng/ μ L) 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 5 μ L， Η2028· 5 μ L，总体积50 μ L0反应条件为首轮循环94°C变形2min ；在接94°C 30s, 50°C 30s， 72°C lmin,30个循环；最后72°C延伸lOmin。1. 5%的琼脂糖凝胶，EB染色后紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与^^i/^oMwas sp.相似度高达99%以上、 可重复性99%。
制备鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物
挑取固体培养基上的鞘氨醇单胞菌属菌株单菌落于装有灭菌的液体培养基中，于 28°C, pH 7.5，80r/min，进行好氧培养48h，取培养好的菌液Iml接种在装有100 ml含氨氮(100 mg/L)的基础培养基的250 ml锥形瓶中，28°C，pH 7. 5，80r/min，进行好氧培养48 h，即为鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物。制备固定化鞘氨醇单胞菌
采用亲水性玻璃态单体丙烯酸羟乙酯(HEA)、甲基丙烯酸β羟乙酯(HEMA)与蒸馏水按照一定的体积比混合均勻，在_63°C _95°C温度条件下，用剂量为1 X IO3Gy 1 X IO6Gy的高能射线辐照形成生物相容性固定化共聚物多孔载体，加入经活化培养进入对数生长期的鞘氨醇单胞菌属菌液，使之吸附于固定化载体表面并通过增殖进入多孔载体内部实现固定化。实施例2
本发明在富营养培养基中对氨氮降解研究的应用，其步骤如下在250ml的锥形瓶中加入50ml富营养培养基(氨氮浓度为100mg/L)。[2]将实施例1制得的鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[1]的锥形瓶中，28°C，80r/min，好氧培养。每隔2小时取样测定。图1为鞘氨醇单胞菌属菌株在富集培养基中降解氨氮情况。从图1可以看出，菌体少量的生长足以使氨氮降解，接种 6小时后，氨氮的去除率接近100 %。实施例3
本发明在以葡萄糖和(X)2为混合碳源，亚硝酸盐为氮源培养基中对亚硝酸盐降解研究的应用，其步骤如下将实施例1中的培养基换为以葡萄糖和(X)2为混合碳源，亚硝酸盐为氮源的基础培养基(亚硝酸盐浓度为100mg/L)将实施例1制得的鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[1]的锥形瓶中，28°C，80r/min，厌氧培养。每隔2小时取样测定。图2为鞘氨醇单胞菌属菌株在富集培养基中降解亚硝酸盐情况。从图2可以看出，菌体少量的生长足以使亚硝酸盐降解， 接种12小时后，亚硝酸盐的去除率接近100 %。实施例4
本发明在以乙酸钠和(X)2为混合碳源，亚硝酸盐为氮源培养基中对亚硝酸盐降解研究的应用，其步骤如下将实施例1中的培养基换为以乙酸钠和(X)2为混合碳源，亚硝酸盐为氮源的基础培养基(亚硝酸盐浓度为100mg/L)将实施例1制得的鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[1]的锥形瓶中，28°C，80r/min，厌氧培养。每隔2小时取样测定。图3为鞘氨醇单胞菌属菌株在富集培养基中降解亚硝酸盐情况。从图3可以看出，菌体少量的生长足以使亚硝酸盐降解， 接种12小时后，亚硝酸盐的去除率接近96 %。实施例5
本发明在以葡萄糖和(X)2为混合碳源，氨氮为氮源培养基中进行硝化一反硝化脱氮的应用，其步骤如下[1]将实施例1中的培养基换为以葡萄糖和ω2为混合碳源，氨氮为氮源的基础培养基(氨氮浓度为100mg/L)将实施例1制得的鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[1]的锥形瓶中，28°C，80r/min，好氧一厌氧培养。每隔2小时取样测定。图4为鞘氨醇单胞菌属菌株在富集培养基中降解氨氮情况。从图4可以看出，菌体少量的生长足以使氨氮降解，接种12小时后，出水中的氨氮浓度很低，亚硝酸盐浓度也低，系统脱氮率达到78. 6 ，实现短程硝化一反硝化，达到脱氮的目的。实施例6
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含氨氮废水短程硝化的应用，其步骤如下 [1]图5为实验室模拟的流化床反应器。实验在有效容积为1.7L(内径8cm，高50cm)并带有保温夹套(夹套内通30士 1°C的水)的流化床反应器中进行，将实施例1制备的鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化菌株投入反应器中，固定化颗粒的填充率为10%，采用模拟废水间歇式进水，同时进行曝气，调节空气流量，定时从反应器取出水样，分析其中的NH4+-N、NO2--N 和Ν03_-Ν的浓度，并按下式计算氨氮去除速率和亚硝化率
氨氮去除率=(NH/-N进水一 NH4+-N出水)/ NH4+-N进水亚硝化率=NO2--N出水/( NO2--N出水 + NO3"-N^k)/ tX 100% [2]实验进水分别为110、160、210 mg/L三种氨氮负荷条件，在30°C，曝气量为 250ml/min条件下进行反应，M个小时后取样测定。图6是系统进水氨氮浓度、氨氮去除率和氮负荷速率随时间的变化，结果表明，在三种氨氮负荷条件下，氨氮去除率和亚硝化率虽然在每次负荷提升后出现略微下降，但很快上升并稳定在较高水平，分别达到95%和90% 以上。降解的氨氮几乎全部转化为亚硝酸盐氮，亚硝化率维持在90%以上，短程硝化效果明显。实施例7
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含亚硝酸盐氮和有机废水短程反硝化的应用， 其步骤如下图5为实验室模拟的流化床反应器。实验在有效容积为1.7L(内径8cm，高50cm) 并带有保温夹套(夹套内通30士 1°C的水)的流化床反应器中进行，将实施例1制备的鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化菌株投入反应器中，固定化颗粒的填充率为10%，采用模拟废水间歇式进水，调节空气流量为60ml/min，造成一定扰动，定时从反应器取出水样，分析其中的 NH/-N、NO2--N和NO3--N的浓度，并按下式计算氮负荷速率
权利要求
1.一种鞘氨醇单胞菌属菌株，其特征在于鞘氨醇单胞菌属菌株为sp. LZW3，其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.5 1.0 X 1 3 μ m，无鞭毛，好氧或厌氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，以(X)2为碳源及能量或者以(X)2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源的基础培养基中生长，该菌株于2011年1月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No . 4589。
2.根据权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株筛选方法，其特征在于该菌株是从太湖水体的水生植物根区、太湖水体敞水区以及太湖沉积物中采集、分离得到；该菌株在PH 值6. 5、. 5培养基介质中培养，适合的生长温度为25 35 °C。
3.根据权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株，其特征为该菌株是游离生物菌制剂或固定化菌株。
4.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在水处理中的应用。
5.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在废水生物脱氮的短程硝化一反硝化中的应用。
6.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在受污染水源水净化中的应用。
全文摘要
本发明属于环境工程、生物工程技术领域。具体涉及鞘氨醇单胞菌属菌株及其对含氮工业废水、生活污水的短程硝化－反硝化脱氮以及在受污染水源水中的处理应用。本发明涉及的鞘氨醇单胞菌菌株，分离自我国太湖水体，为本土菌种，生物安全性高；该菌株可以以CO2为碳源及能量或者以CO2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源的基础培养基中生长。其菌液、休眠细胞以及固定化菌株均可以将氨氮分解为亚硝酸盐氮，同时可以将氨氮转化为氮气，既能够作为脱氮微生物将氨氮转化为亚硝酸盐氮，又能够将氨氮转化为氮气，实现短程硝化－反硝化，对氨氮的降解速度快，适用于含氮工业废水、含氮生活污水以及受污染水源水处理。
文档编号C12R1/01GK102168054SQ20111004405
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者冯露露, 吴凯, 吴宁梅, 周涛, 周莉, 李正魁, 潘静赟, 王易超, 王月明, 范念文, 赵琳, 陈祈春 申请人:南京大学