专利名称：一种乳酸乳球菌和该乳酸乳球菌产生的抗菌肽以及该抗菌肽的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于 微生物资源利用领域，具体涉及一种乳酸乳球菌和该乳酸乳球菌产生的抗菌肽以及该抗菌肽的用途。
背景技术：
食源性病原菌和食品腐败菌不仅严重影响人类健康，而且造成粮食的大量浪费。 一些细菌产生的细菌素是一类蛋白质性质的抗菌肽，目前普遍认为利用食品安全级乳酸菌细菌素替代化学防腐保鲜剂是提高食品安全和保障粮食安全的关键，因而筛选新的细菌素产生菌株以及抗菌肽的制备技术对国民经济的发展具有重要的意义。乳酸菌自古以来就广泛用于食品的防腐保鲜，在乳酸菌产生的众多抑菌物质中小分子肽类物质细菌素，由于可被人体分泌的酶降解，更凸显了它的安全性和在食品保鲜中的应用价值。乳酸乳球菌产生的细菌素Msin是FAO批准的唯一一个可用于食品保鲜的细菌素，Nisin的毒性极低(LD50约为7g/kg体重)，在唾液中IOmin内可被完全降解，不会引发过敏反应，因而广泛应用于乳制品、肉制品、酸性罐头食品和发酵食品的防腐保鲜。但由于Nisin只能在酸性条件下呈可溶性状态，在中性条件下溶解性低，稳定性差，且易被肉类蛋白吸附，这些特性极大地影响了 Nisin在肉制品保鲜中的应用，因此有必要开发新的多肽抗菌剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳酸乳球菌。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518,已于2011年1月26日保藏于中国微牛物菌种保藏管理委员会普通微牛物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No. 4584。本发明中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis)LLC518是从市售黄瓜制备的富集液中筛选获得的，具体筛选方法为用含0. 01%溴甲酚紫的MRS选择性培养基先筛选产酸菌株，再通过将筛选菌点种在MRS固体培养基表面，待生长形成明显的菌斑后， 上面再倒一层含指示菌乳杆菌(Lactobacillus sp.)LSX801的上层培养基，28°C培养，将产生抑菌圈的菌株进一步经过发酵，获得发酵上清液，并通过排除发酵液中有机酸、过氧化氢的抑菌作用，进一步通过糜蛋白酶和木瓜蛋白酶可消除抑菌活性从而证明菌株的发酵液中含有蛋白质类的抑菌物质。通过形态学特征、生理生化学特征以及16SrDNA序列分析，依据 《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，表明该菌株属于乳酸乳球菌乳酸亚禾中(Lactococcus lactis subsp. lactis),编号为 LLC518。本发明的第二个目的是提供一种上述乳酸乳球菌产生的抗菌肽以及抗菌肽的生
产方法。本发明所述的抗菌肽，是通过发酵乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp.lactis)LLC518CGMCC No. 4584 而得到的抗菌肽，命名为 LacticinLLC518。抗菌肽的制备方法可以通过两种途径 第一个途径首先从MRS斜面培养基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接种于 MRS 种子培养基中，28°C摇床培养 12 小时，再将种子液按2 6%的接种量接种于MRS发酵培养基中，28°C静置培养24h即可得到发酵液；再将得到的发酵液离心；取上清液，0.45 μ m滤膜过滤，对滤过液进行硫酸铵沉淀；然后离心，取沉淀得到的沉淀蛋白；将沉淀蛋白溶解在水中，采用截留分子量2000Da 的透析袋透析处理，真空冷冻干燥透析液获得粗制干粉；再将粗制干粉溶解于水中，并经 Sephadex G-50凝胶层析，收集活性峰进行反相HPLC处理，以获得抗菌肽纯品。抗菌肽的上述纯化步骤的具体条件如下将所述的发酵液经4°C、8000r/min离心25min，取上清液经孔径0. 45 μ m的滤膜过滤，所得滤液以30 50 %的饱和度进行硫酸铵沉淀，12h后，4°C，8000r/min离心45min得到沉淀蛋白，取沉淀蛋白溶解在水中后于截留分子量2000Da的透析袋中透析4h，将透析液放入_20°C冰箱冷冻后用冷冻干燥机制成所述的粗制干粉；将粗制干粉溶解在水中并经孔径0.45μπι的滤膜过滤后，经S印hadex G_50凝胶层析，收集活性峰，RP-HPLC制备抗菌肽纯品；所述的凝胶层析采用S印hadex G-50柱填料(26 X 100cm)，上样量为5ml，流速为 1. 5ml/min,洗脱液为经0. 22 μ m滤膜过滤二级水，活性峰收集保留时间为70-85min ；RP-HPLC 层析条件为色谱柱C18 柱 SymmetryShield ，规格19X150mm，上样量970μ 1，流速2. 5ml/min，温度25°C，波长215nm，洗脱液A为超纯水，B为色谱纯乙腈。程序:0-6min 0-5% B，6_66min 5-100% B，66_80min 100% B ；活性峰收集保留时间为 32. 2-32. 5min。第二个途径首先从MRS斜面培养基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接种于 MRS 种子培养基中，28°C摇床培养 12 小时，再按2 6%的接种量接种于MRS发酵培养基中，28°C静置培养24h即可得到发酵液；再将发酵液经陶瓷膜过滤除菌后，喷雾干燥得到粉末状的抗菌肽成品。喷雾干燥步骤的具体条件如下将发酵液在温度25°C的条件下，通过操作压力为 0. 02Mpa，膜孔径为0. 2μπι的陶瓷膜过滤后得到去除菌体的过滤液，向此过滤液中加入固体食盐，固体食盐的质量占过滤液的体积比为5 20%，待固体食盐完全溶解后进行喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度为130 150°C，出风温度为110 130°C，即得粉末状的抗菌肽成品。由上述任何一种途径制得的抗菌肽也都属于本发明的保护范围。本发明的第三个目的是提供一种上述抗菌肽在肉制品保鲜中用途。本发明中的抗菌肽尤其适用于对猪肉进行保鲜，具体条件为每IOOg猪肉中添加 12ml抗菌肽溶液，抗菌肽的质量百分比的浓度为3. 1%。本发明的有益效果如下1、本抗菌肽Lacticin LLC518与现有的抗菌肽Nisin不同，Nisin可被α -胰凝乳蛋白酶降解，对链霉蛋白酶Ε、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。而本抗菌肽除可被α-胰凝乳蛋白酶降解外，还可被木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E和蛋白酶K降解。
2、本乳酸乳球菌产生的抗菌肽的抑菌谱不同于现有的抗菌肽Nisin，对Nisin敏感的藤黄微球菌无抑制作用。3、本乳酸乳球菌产生的抗菌肽在较广的pH范围内有活性，特别是在碱性条件下仍具有抑菌作用。4、本抗菌 肽的作用方式杀死细菌，且在4°C条件下保藏条件下具有显著的杀菌作用。5、本抗菌肽在肉制品中具有稳定的抑菌作用，当与EDTA、山梨酸钾联合作用时，可使抑菌作用达到最大值。
图1为粗制干粉溶于水并经膜过滤后通过S^hadex G_50的洗脱曲线；图2为S印hadex-G-50分离峰的抑菌作用示意图；图3为抗菌肽高效液相色谱洗脱曲线；图4为抗菌肽质谱图；图5A是37°C下抗菌肽对LSX801的作用方式；图5B是4°C下抗菌肽对LSX801的作用方式；图5C是37°C下抗菌肽对单核增生李斯特菌的作用方式；图5D是4°C下抗菌肽对单核增生李斯特菌的作用方式；图6抗菌肽对猪肉中细菌的抑制作用；图7纯品抗菌肽对指示菌的抑制作用；图8乳酸乳球菌LLC518的形态特征观察图。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1本发明的乳酸乳球菌LLC518采用以下方式得到1、将从安徽合肥市场中购置的新鲜黄瓜洗净切成小块，装满50ml的无菌试管，压实，用塑料皮和牛皮纸密封，30°C，富集培养48h后，取样涂布于含0.01%溴甲酚紫的MRS选
择培养基。2、挑取使含0. 01 %溴甲酚紫的MRS选择培养基变黄的产酸菌株，进一步分离纯化；2、以乳杆菌(Lactobacillus sp. ) LSX801为指示菌，通过平板点种法获得具有抑菌能力的菌株；3、通过发酵培养获取发酵液，离心处理获得上清液，并通过0. 45 μ m滤膜过滤除去菌体，添加40%的硫酸铵处理滤液，并经透析、冷冻干燥制成粗蛋白干粉。将干粉溶于水溶液中，添加至牛沣杯中，采用平板扩散法筛选有抑菌能力的菌株；4.通过糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶处理粗蛋白干粉，确定抑菌物质具有蛋白质性质；
5.通过形态学和生理生化特征以及16SrDNA序列特征的比对分析，确定乳酸乳球菌 LLC518 为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. Iactis)。乳酸乳球菌LLC518的生物学特征如下在MRS平板培养基上菌落呈圆形，中央隆起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，菌落直径0.5 1.0mm。在MRS液体培养基中无菌膜，菌液混浊，有沉淀产生。革兰氏阳性菌，球形，菌体直径约0. 5 0. 8um，无芽孢，无鞭毛，单个或成对存在。在厌氧条件下长势比好氧条件下好，厌氧条件下菌落直径相对好氧条件下增大约0. 5mm,在有氧条件下生长情况也良好，属于兼性厌氧菌。可在20 40°C之间生长，45°C不生长，其中最适生长温度为30°C。在0_7%氯化钠浓度下均可生长。接触酶阴性；可分解葡萄糖产酸，但不产气，也不产生硫化氢，但可水解精氨酸产生氨；可分解七叶苷，但不分解淀粉和明胶；石蕊牛奶实验呈阳性，但不产生蛋白酶，不能使牛奶胨化；乙酰甲基甲醇试验阴性，表明该菌不能发酵葡萄糖生成乙酰甲基甲醇。发酵葡萄糖产酸，但不产气，可发酵木糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸，利用棉籽糖和肌醇但不产酸。乳酸乳球菌LLC518的16SrDNA的序列为GCAGGCACGCTGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGA TGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAAT ACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGT ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTG GGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAG CAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAA GCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCC GAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCA ACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGG GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCT CTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCG TGCTATTC CTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACG AGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACAC GTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGG ATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCOGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGG AGGGCGCTCCTAAGTAAGACCGAGCTTC实施例2抗菌肽的制备步骤如下A、抗菌肽的发酵从MRS斜面培养基上挑取已活化的乳酸乳球菌(LactococcusIactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接种于 MRS 种子培养基中，28°C摇床培养 12 小时，再将种子液按4%的接种量接种于MRS发酵培养基中，28°C静置培养24h即可得到发酵液；B、抗菌肽的分离与纯化将所述的发酵液经4°C、8000r/min离心25min，取上清液经孔径0. 45 μ m的滤膜过滤，所得滤液以30 50%的饱和度进行硫酸铵沉淀，12h后，4°C， 8000r/min离心45min得到沉淀蛋白，取沉淀蛋白溶解在水中后于截留分子量2000Da的透析袋中透析4h，将透析液放入_20°C冰箱冷冻后用冷冻干燥机制成所述的粗制干粉；将粗制干粉溶解在水中并经孔径0. 45 μ m的滤膜过滤后，经S印hadex G-50凝胶层析，收集活性峰，RP-HPLC制备抗菌肽纯品； 所述的凝胶层析采用S印hadex G-50柱填料(26 X 100cm)，上样量为5ml，流速为 1. 5ml/min,洗脱液为经0. 22 μ m滤膜过滤二级水，活性峰收集保留时间为70-85min ；RP-HPLC 层析条件为色谱柱C18 柱 SymmetryShield ，规格19X150mm，上样量970μ 1，流速2. 5ml/min，温度25°C，波长215nm，洗脱液A为超纯水，B为色谱纯乙腈。程序:0-6min 0-5% B，6_66min 5-100% B，66_80min 100% B ；活性峰收集保留时间为 32. 2-32. 5min。粗制干粉溶于水并经膜过滤后通过S印hadex G-50的洗脱曲线如图1所示，且 Sephadex-G-50分离峰的抑菌作用如图2所示，图2中1为S印hadex-G_50第一峰，2为 Sephadex-G-50 第二峰。RP-HPLC的洗脱曲线如图3所示。实施例3抗菌肽的制备步骤如下A、抗菌肽的发酵从MRS斜面培养基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接种于 MRS 种子培养基中，28°C摇床培养 12 小时，再将种子液按4%的接种量接种于MRS发酵培养基中，28°C静置培养24h即可得到发酵液；B、将发酵液在温度25°C的条件下，通过操作压力为0. 02Mpa，膜孔径为0. 2 μ m的陶瓷膜过滤后得到过滤液，向此过滤液中加入固体食盐，固体食盐的质量占过滤液的体积百分比为5 20 %，待固体食盐完全溶解后进行喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度为130 150°C，出风温度为110 130°C，即得粉末状的抗菌肽成品。固体食盐的质量比对抗菌肽活力的影响在150ml乳酸乳球菌LLC518的发酵上清液中分别加入5%、10%、15%、20%的食盐，进风温度设为140°C，出风温度设为120°C，喷雾干燥处理后，取各个条件下的样品0. 1克于5ml水中，测定其活力，所得样品的活力如表 1所示，同时可以得到在加入15%食盐时，总活力最大。表1辅料比对产品活力的影响
权利要求
1.一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis)LLC518,其在中国微牛物菌种保藏管理委员会普通微牛物中心的保藏编号为CGMCCNo. 4584。
2.一种抗菌肽的制备方法，其通过乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584发酵以得到抗菌肽。
3.根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其包括以下制备步骤从MRS斜面培养基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接种于MRS种子培养基中，28°C摇床培养12小时达到稳定期，再按2 6%的接种量接种于 MRS发酵培养基中，28°C静置培养24h达到稳定期，即可得到发酵液。
4.根据权利要求2或3所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于将得到的抗菌肽按照以下方法纯化将得到的发酵液离心；取上清液，0. 45 μ m滤膜过滤，对滤过液进行硫酸铵沉淀；然后离心，取沉淀蛋白；将沉淀蛋白溶解在水中，采用截留分子量2000Da的透析袋透析处理，将透析液真空冷冻干燥获得粗制干粉；再将粗制干粉溶解于水中，并经Sephadex G-50凝胶层析，收集活性峰进行反相HPLC处理，以获得抗菌肽纯品。
5.根据权利要求4所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于将所述的发酵液经4°C、 8000r/min离心25min，取上清液经孔径0. 45 μ m的滤膜过滤，所得滤液以30 50 %的饱和度进行硫酸铵沉淀，12h后，4°C，8000r/min离心45min得到沉淀蛋白，取沉淀蛋白溶解在水中后于截留分子量2000Da的透析袋中透析4h，将透析液放入-20°C冰箱冷冻后用冷冻干燥机制成所述的粗制干粉；将粗制干粉溶解在水中并经孔径0. 45 μ m的滤膜过滤后，经 Sephadex G-50凝胶层析，收集活性峰，RP-HPLC制备抗菌肽纯品；所述的凝胶层析采用S印hadex G-50柱填料(26 X 100cm)，上样量为5ml，流速为 1. 5ml/min,洗脱液为经0. 22 μ m滤膜过滤二级水，活性峰收集保留时间为70-85min ；RP-HPLC层析条件为色谱柱:C18柱SymmetryShield ，规格19X 150mm，上样量 970 μ 1，流速2. 5ml/min,温度25°C，波长215nm，洗脱液A为超纯水，B为色谱纯乙腈。 程序:0-6min 0~5 % B，6_66min 5-100% B，66_80min 100% B ；活性峰收集保留时间为 32. 2-32. 5min。
6.根据权利要求2或3所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于将发酵液经陶瓷膜过滤除菌后，喷雾干燥得到粉末状的抗菌肽成品。
7.根据权利要求6所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于将发酵液在温度25°C的条件下，通过操作压力为0. 02Mpa，膜孔径为0. 2 μ m的陶瓷膜过滤后得到去除菌体的过滤液， 向过滤液中加入固体食盐，固体食盐的质量占过滤液的体积百分比为5 20%，待固体食盐完全溶解后进行喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度为130 150°C，出风温度为110 130°C，即得粉末状的抗菌肽成品。
8.由权利要求2 7中任一项所述的抗菌肽制备方法得到的抗菌肽。
9.权利要求8所述的抗菌肽在肉制品保鲜中的用途。
10.根据权利要求9所述的抗菌肽的用途，其特征在于抗菌肽用于猪肉的保鲜，具体条件为每IOOg猪肉中添加12ml抗菌肽溶液，抗菌肽的质量百分比的浓度为3. 1%。
全文摘要
本发明涉及一种乳酸乳球菌和该乳酸乳球菌产生的抗菌肽以及该抗菌肽的用途，本发明中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.4584。本发明中的乳酸菌菌株产生的抗菌肽能够抑制四联球菌、苏云金芽胞杆菌、乳酸乳杆菌、英诺克李斯特菌，尤其对能引起严重食物中毒的单增李斯特菌有很强的抑制作用。因此本乳酸菌菌株及其抗菌肽在食品保鲜中有着积极的作用。
文档编号C12R1/46GK102286393SQ20111004891
公开日2011年12月21日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者倪敬田, 别怀周, 张明, 方佳琪, 李瑞胜, 李翠, 祁克宗, 竺德强, 谢继辉, 陈丽园 申请人:安徽农业大学