专利名称：一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法
技术领域：
本发明属于生物催化领域，更具体涉及一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法。
背景技术：
红景天苷是糖的半缩醛羟基与醇羟基脱水形成的醇苷，是一种由葡萄糖与酪醇以糖苷键结合而成的糖苷，酪醇为其苷元，为传统中药红景天中的主要有效成分，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射和抗病毒等多种功能，同时还具有延缓机体衰老、防止老年疾病等功效，尤其在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值。传统获得红景天苷的方式主要为以植物红景天为原料提取制得，植物体中红景天苷的合成可分为两个阶段一是苷元酪醇的合成；二是葡萄糖和酪醇结合形成红景天苷， 由于野生红景天资源匮乏，人工种植因根腐病而未获得成功，此外此法通常需要通过浸泡、 醇提、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、大孔吸附树脂层析等繁琐的处理过程，产率低；以化学法、植物细胞培养以及微生物发酵制备红景天苷的研究已有报道，化学法合成红景天苷存在合成时需要昂贵的糖苷供体，同时必须经过羟基保护和脱保护步骤，同时药物中间体回收处理繁琐等缺陷；植物细胞培养法因设备昂贵，技术难度大，而未能投入到实际生产中； 微生物发酵法因产量低也无法进行产业化生产。酶催化合成红景天苷的方法具有反应条件温和，具有很好的位置选择性和立体专一性，产物结构单一，纯度高等优点，受到国内外科技工作者的青睐。该酶本质上属于水解酶类，但在一定条件下又可催化逆水解反应，因此在水相体系中，该反应受热力学平衡的影响导致红景天苷的转化率难以提高，因此需严格控制反应体系中的水含量。但在传统有机溶剂中酶又容易失活且底物葡萄糖或酪醇的溶解性差，不利于反应进行，因此需要有一种全新的反应介质构成反应体系，离子液体的出现可望在同一反应体系中协调以上困难，实现红景天苷的高效率生物转化。离子液体是常温下呈液态的盐，通过对阴阳离子的设计可调节对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性，因此通过设计可提高反应介质中极性基质葡萄糖和非极性基质酪醇的浓度促使反应有利于合成而非水解，同时离子液体具有较好的生物相容性，酶在离子液体组成的两相或单相体系中能够保持较高的酶活力，有利于反应的不断进行。
发明内容
本发明的目的在于针对现有反应体系的缺陷，提供一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，该方法操作简单，并使酶催化合成红景天苷的效率得以提高。本发明是通过如下技术内容实施的
一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法是将葡萄糖，酪醇和酶与含有缓冲溶液的溶剂中反应，采用常规的方法收集红景天苷，所述的溶剂包含离子液体，有机溶剂中的一种或两种。所述的离子液体采用1，3- 二甲基咪唑硫酸单甲酯，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1-己基_3甲基咪唑四氟硼酸盐，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的任意一种。所述的离子液体的体积含量为0 100%。所述的离子液体的体积含量为14 19%。所述的有机溶剂采用叔丁醇、1，4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的任意一种。所述的有机溶剂的体积含量为0 100%。所述的有机溶剂的体积含量为56 76%。所述反应的转速为100 350 rpm，最佳为200 305rpm，所述反应的温度为40 60°C。所述的酶的浓度为2g/L，所采用的酶为β -葡萄糖苷酶。所述的葡萄糖的浓度为40 180g/L，酪醇的浓度为180 260 g/L。本发明的优点为与现有方法相比，本发明采用由离子液体组成的反应介质作为酶催化直接糖基化合成红景天苷的反应体系，可以保证酶活力和酶的稳定性，提高反应体系中底物的溶解性，降低了反应体系中的水活度，无需使用昂贵的糖苷供体，可一步合成红景天苷，产物分离纯化工艺简单，纯度高，未反应的酪醇可回收利用，降低了生产成本，可满足迅速发展医药行业的需求。
图1为酶催化直接糖基化合成红景天苷反应式。
具体实施例方式一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法是将葡萄糖，酪醇和酶与含有缓冲溶液的溶剂中反应，采用常规的方法收集红景天苷，所述的溶剂包含离子液体，有机溶剂中的一种或两种。所述的离子液体采用1，3- 二甲基咪唑硫酸单甲酯，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1-己基_3甲基咪唑四氟硼酸盐，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的任意一种。所述离子液体的体积含量为0 100%。所述的离子液体的体积含量为14 19%。所述的有机溶剂采用叔丁醇、1，4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的任意一种。所述的有机溶剂的体积含量为0 100%。所述的有机溶剂的体积含量为56 76%。所述反应的转速为100 350rpm，最佳为 200 305rpm。所述的酶的浓度为2g/L，所采用的酶为β -葡萄糖苷酶。所述的葡萄糖的浓度为40 180g/L，酪醇的浓度为180 260 g/L。所述的缓冲溶液的pH为4 8，最佳为5 7，优选采用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐缓冲溶液中的任意一种，反应体系中缓冲溶液体积含量为0 100%，最佳为5 30%。所述反应温度为40 60°C，最佳为50 60°C ； 所述反应时间为1 7天，最佳为2 5天；
反应结束后，利用高效液相色谱仪进行产物红景天苷含量检测，通过简单的萃取工艺， 可从反应液中方便的提取产物红景天苷，同时对未反应的底物酪醇进行回收利用，以降低生产成本。实施例1
在IOml试管中加入55yL的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，396yLl，4-二氧六环和 99 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向反应介质中加入22mg葡萄糖，33mg酪醇，加入 1. Img酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。在预定时间取样550 μ L，加入8. 5ml甲醇终止反应并超声波震荡20min，14000rpm 离心5min，上清液用0. 45um的滤膜进行过滤，利用高效液相色谱仪(LC-10A)对红景天苷产量进行测定。SPD-10A紫外可见检测器；依利特C18 (4. 6mmX250mmX5um)；流动相为甲醇水(15:85)，流速lml/min ；检测波长275nm ；柱温室温；进样量20 μ L。经检测反应体系中红景天苷浓度为3. 6g/L.
实施例2
在IOml试管中加入55 μ L的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，500 μ Ll-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向反应介质中加入22mg葡萄糖，33mg酪醇，加入1. Img酶引发反应，在200rpm 的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测， 产物浓度可达0. 58g/L。实施例3
在IOml试管中加入55yL的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，396yLl，4-二氧六环和 99 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向反应介质中加入22mg葡萄糖，99mg酪醇，加入 1. Img酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测，产物浓度可达7. 9g/L。实施例4
在IOml试管中加入55yL的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，396yLl，4-二氧六环和 99 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向反应介质中加入22mg葡萄糖，143mg酪醇，加入 1. Img酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测，产物浓度可达7. Og/L。实施例5
在IOml试管中加入165 μ L的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，308 μ Li，4-二氧六环和 77 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向其中加入葡萄糖55mg，酪醇llOmg。加入1. Img 酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测，产物浓度可达4. 5g/L。实施例6
在IOml试管中加入27. 5μ L的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，418 μ Li，4- 二氧六环和 104. 5 μ Ll-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向其中加入葡萄糖55mg，酪醇llOmg。加入 1. Img酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测，产物浓度可达0. 7g/L。实施例7
在IOml试管中加入55yL的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，396yLl，4-二氧六环和 99yLl-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向其中加入葡萄糖99mg，酪醇llOmg。加入1. Img 酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测，产物浓度可达7. 9g/L。实施例8
在IOml试管中加入82. 5 μ L的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，374 μ Li，4- 二氧六环和 93. 5 μ Ll-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向其中加入葡萄糖55mg，酪醇llOmg。加入1. Img 酶引发反应，在305rpm的旋转式摇床上振荡反应2天。采用实施例1相同的检测方法对产物红景天苷进行检测，产物浓度可达15. Og/L。实施例9
在IOml试管中加入82. 5 μ L的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，374 μ L的1，4- 二氧六环和 93. 5 μ L的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向该反应介质中加入55mg葡萄糖，IlOmg酪醇，加入1. Img酶引发反应，在200rpm的旋转式摇床上于60°C下振荡反应2天，采用实施例 1相同的检测方法对产物进行检测，其浓度可达2. 8g/L。实施例10
在IOml试管中加入82. 5 μ L的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，374 μ L的1，4- 二氧六环和 93. 5 μ L的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，向该反应介质中加入55mg葡萄糖，IlOmg酪醇，加入1. Img酶引发反应，在275rpm的旋转式摇床上振荡反应5天，采用实施例1相同的检测方法对产物进行检测，其浓度可达18. 9g/L。实施例11
反应结束后，将反应液(50ml)过滤，滤渣用甲醇洗涤3次(50ml X 3)，弃去滤渣，合并滤液并旋转蒸发除去溶剂，将所得固体用50ml乙醚萃取，离心取上清液，剩余固体用200ml 无水乙醇萃取，离心取上清液，将乙醚部分旋转蒸发除去溶剂，可得未反应的酪醇以循环使用，无水乙醇部分旋转蒸发除去溶剂可得纯度达90%以上的红景天苷白色粉末0. 92g，得率 87. 6%以上。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述方法是将葡萄糖， 酪醇和酶与含有缓冲溶液的溶剂反应，采用常规的方法收集红景天苷，所述的溶剂包含离子液体，有机溶剂一种或两种。
2.根据权利要求1所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的离子液体采用1，3-二甲基咪唑硫酸单甲酯，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，1-己基_3甲基咪唑四氟硼酸盐，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的离子液体的体积含量为0 100%。
4.根据权利要求3所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的离子液体的体积含量为14 19%。
5.根据权利要求1所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的有机溶剂采用叔丁醇、1，4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的有机溶剂的体积含量为0 100%。
7.根据权利要求6所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的有机溶剂的体积含量为56 76%。
8.根据权利要求1所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述反应的转速为100 350rpm，所述反应的温度为40 60°C。
9.根据权利要求1所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的酶的浓度为2g/L，所采用的酶为β-葡萄糖苷酶。
10.根据权利要求1所述的酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，其特征在于所述的葡萄糖的浓度为40 180g/L，酪醇的浓度为180 260 g/L。
全文摘要
本发明涉及一种酶催化直接糖基化合成红景天苷的方法，该方法是将葡萄糖，酪醇和酶与含有缓冲溶液的溶剂中反应，采用常规的方法收集红景天苷，所述的溶剂包含离子液体和有机溶剂。与现有方法相比，本发明采用由离子液体组成的反应介质作为酶催化直接糖基化合成红景天苷的反应体系，可以保证酶活力和酶的稳定性，提高反应体系中底物的溶解性，降低了反应体系中的水活度，无需使用昂贵的糖苷供体，可一步合成红景天苷，产物分离纯化工艺简单，纯度高，未反应的酪醇可回收利用，降低了生产成本，可满足迅速发展医药行业的需求。
文档编号C12P19/44GK102174620SQ20111004917
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者岳磊, 林琼妹, 林磊, 石贤爱, 许格, 郭养浩 申请人:福州大学