专利名称：中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种微生物发酵技术领域的方法，具体是一种中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法。
背景技术：
木霉菌(Trichoderma spp.)是国际上公认的对环境友好的植物病害生物防治微生物。目前国际上已有50余种木霉菌菌剂注册、生产和使用。但是目前商品化的木霉菌制剂主要是以木霉菌分生孢子为主要成分，制剂货架期较短(仅有三个月)，限制了制剂在生产中应用的有效期限。已有研究表明木霉菌在特定的培养条件下可以产生厚垣孢子，厚垣孢子具有耐干燥、耐高温、对土壤抑菌作用不敏感及存活期长等优点，可使孢子易于加工和贮存，有利于在土壤中存活。因此，如何生产出高含量厚垣孢子是提高木霉菌剂贮藏时间和应用时效性的关键技术。然而迄今为止，国内外关于木霉菌产厚垣孢子发酵条件的报导或专利主要是利用葡萄糖、燕麦粉做为碳源在三角产瓶-摇床培养条件下建立的，例如邹勇等U006)通过正交设计研究表明黄绿木霉菌(Trichoderma aureoviride) T-33菌株发酵生产厚垣孢子的优化条件为燕麦粉培养液、30°C、pH 4. 0U40r/min振荡培养，产生厚垣孢子数量为3. 37 X IO7个/mL。但这一研究主要是在三角瓶和摇床条件下和特定菌株下完成的，生产成本较高，并且缺少普遍适用性，不适合后续的工业化大规模发酵生产。此外，利用马铃薯、葡萄糖、蔗糖做为碳源制备木霉菌T-23菌株厚垣孢子(庄敬华等，2005)，同样存在生产成本过高和缺少普适性的难题。因此有必要筛选更为低廉的营养基质制备木霉菌厚垣孢子制剂。经对现有技术的文献检索发现，顾金刚等在《中国生物防治》2008年第M卷第3 期报告中表明“哈茨木霉ACC30371以玉米秆粉培养基为营养基质，在^°C、初始pH 6.0、 250r/min、装瓶量75mL/250mL的条件下培养，10天后厚垣孢子数量达5. 13 X IO8个/mL。说明利用低成本原材料生产厚垣孢子是可行的，但本研究发酵时间过长，需要10天，而且也只是在三角瓶水平上利用特定木霉菌株完成的，很难反映该方法对各种木霉菌生产厚垣孢子的普适性、以及在工业化水平上发酵生产厚垣孢子所需条件。此外，玉米的秸秆粉碎过程也增加了操作的繁锁程度，间接增加了生产成本。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，解决了传统木霉菌厚垣孢子制备成本高、发酵规模小和发酵时间长等问题， 实现了中试发酵水平上，低成本制备木霉菌厚垣孢子产品的目标。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明由以下步骤组成步骤一，取木霉菌(Trichoderma spp.)的三种菌株 Τ· koningiopisis、 Τ. atroviride, Τ. harzianum,分别接种于种子菌培养基PDA上进行常温培养，之后分别接种于种子液中进行发酵培养，得种子菌发酵液；
所述的PDA培养基，其组分及含量为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉25g/L 余量为水，该PDA培养基通过以下方式制备得到将马铃薯去皮后切成块加水并煮沸，然后用纱布过滤并向滤液中加葡萄糖和琼脂粉，最后补水定容。所述的种子液培养基的组分及含量为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，余量为水， 该种子液培养基通过以下方式制备得到将马铃薯去皮后切成块加水并煮沸，然后用纱布过滤并向滤液中加葡萄糖，最后补水定容。所述的常温培养是指在环境下培养3-4天。所述的发酵培养是指在pH 6 7J8°C，溶氧量20-30%以及130-140r/min的旋转环境下发酵7天。步骤二，将种子菌发酵液接种于中试水平的液体培养基中，经二次发酵得到液体发酵物；所述的接种是指按每200L液体培养基添加1. 2L种子菌发酵液的比例进行接种。所述的液体培液基的组分含量为玉米粉40-60g/L，硫酸铵450-550mg/L，余量为无菌水。所述的玉米粉的粒度为40目以下。所述的二次发酵是指在pH 3 4J8.0°C 48.8°C，溶解氧 20-30%，i;35-140r/ min的旋转环境下发酵5-8天。与现有技术相比，本发明具有以下创新点1.本发明所用基本培养基组分为玉米粉，价格低于传统的燕麦粉培养基。其他辅助成分的数量及用量也低于传统的产厚垣孢子培养基。2.本发明厚垣孢子制备方法实现了在300L中试水平上低成本发酵生产厚垣孢子的目标，不再仅限于通过三角瓶-摇床实验产生厚垣孢子。3.本发酵条件不仅适用于单一种属木霉菌产厚垣孢子的液体发酵，对于其他种木霉菌株液体发酵产厚垣孢子也具有普遍适应性。4.本发明解决了利用传统培养基发酵制备厚垣孢子时间过长、操作复杂、产量低等问题。本发明涉及的木霉菌是按照Christian P. Kubicek和Gary E.Harman主编的 ((Trichoderma and Gliocladium》第一卷(Taylor 和 Francis Ltd, 1998)中介绍的土壤稀释法进行分离，并利用木霉菌选择性培养基[Josie Williams, John Μ. Clarkson, Peter R. Mills, and Richard M. Cooper A Selective Medium for Quantitative Reisolation of Trichoderma harzianum from Agaricus bisporus Compost, Appl Environ Microbiol. 2003July ；69 (7) :4190 4191)]培养得到。本发明涉及拟康宁木霉(T. koningiopsis)已经在《李广记陈捷刘铜刘力行*，木霉属中国新记录种T. koningiopisis记述，微生物学通报pl663_1665》公开。本发明涉及深绿木霉(T.atroviride)已经在《Jun Tang, Lixing Liu, Xiuli Huang, Yingying Li, Yunpeng Chen, and Jie Chen. Proteomic analysis of Trichoderma atro viride mycelia stressed by organophosphate pesticide dichlorvos. Can. J. Microbiol. pl21_127》公开。本发明涉及哈茨木霉(Τ. harz ianum)已经在《唐俊孙文良伍柯瑾刘力行陈捷女，木霉菌发酵液蛋白对玉米弯孢菌叶斑病的诱导抗性作用，安徽农业科学，P8564-8566》公开。上述三株木霉菌株均由上海交通大学农业与生物学院植物病理学实验室保存。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1步骤一随意选取10株木霉菌株，分别接种于PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g， IOOOmL水)平板上培养3天；在平板上菌落周边打取菌饼，接入种子液培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，1000m L水)发酵3天后，转接至200L液体培养基(组分马铃薯 200g，葡萄糖 20g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4O. 0025g, ZnSO4O. 002g, KH2P043. 83g，NaNO3L 42g，(NH4)2SO4L lg，CaCl2Ig,水 1000m L)中，于 300L 液体发酵罐 (FUS30L发酵系统，上海国强生化工程装备有限公司)发酵7天；发酵参数pH6-7、溶氧量 20-30%。步骤二用IM HCL溶液将200L液体发酵培养基(玉米粉10kg，硫酸铵IOOg)酸度调整到 PH4-5之后加入300L(装罐量200L)发酵罐(FUS300L发酵系统，上海国强生化工程装备有限公司)中。将1. 2L的种子菌接种于液体发酵培养基中，设定发酵参数溶解氧量20-30%。 从发酵后第3天开始取样显微镜(40倍物镜)检查厚垣孢子的产量变化。本实施例的效果1、实验设计分别取2个发酵条件下不同木霉菌株的发酵液，利用血球计数板对厚垣孢子数量进行统计。结果表明利用方法二(步骤二)发酵所得的厚垣孢子数量普遍高于利用方法一 (步骤一)发酵所得的厚垣孢子数量。在供试的10株木霉菌中，有9株菌在利用方法一时所得厚垣孢子数量大于利用方法二时。表1不同方法厚垣孢子产生数量(个/mL)不同菌株 1 权利要求
1.一种中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征在于，由以下步骤组成步骤一，取木霉菌的三种菌株T. koningiopsis、T. atroviride或Τ. harzianum,分别接种于种子菌培养基上进行常温培养，之后分别接种于种子液中进行发酵培养，得种子菌发酵液；步骤二，将种子菌发酵液接种于中试水平的液体培养基中，经二次发酵得到液体发酵物。
2.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的PDA培养基，其组分及含量为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉25g/L余量为水，该PDA培养基通过以下方式制备得到将马铃薯去皮后切成块加水并煮沸，然后用纱布过滤并向滤液中加葡萄糖和琼脂粉，最后补水定容。
3.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的种子液培养基的组分及含量为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，余量为水，该种子液培养基通过以下方式制备得到将马铃薯去皮后切成块加水并煮沸，然后用纱布过滤并向滤液中加葡萄糖，最后补水定容。
4.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的常温培养是指在环境下培养3-4天。
5.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的发酵培养是指在PH 6 7J8°C，溶氧量20-30%以及130-140r/min的旋转环境下发酵7天。
6.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的接种是指按每200L液体培养基添加1. 2L种子菌发酵液的比例进行接种。
7.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的液体培液基的组分含量为玉米粉40-60g/L，硫酸铵450-550mg/L，余量为无菌水。
8.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的玉米粉的粒度为40目以下。
9.根据权利要求1所述的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，其特征是， 所述的二次发酵是指在PH 3-4，28. O0C -28. 8°C，溶解氧20-30%，135-140r/min的旋转环境下发酵5-8天。
全文摘要
一种微生物发酵技术领域的中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法，通过取木霉菌的三种菌株T.koningiopisis、T.atroviride、T.harzianum，分别接种于种子菌培养基PDA上进行常温培养，之后分别接种于种子液中进行发酵培养，得种子菌发酵液；再将种子菌发酵液接种于中试水平的液体培养基中，经二次发酵得到液体发酵物。本发明解决了传统木霉菌厚垣孢子制备成本高、发酵规模小和发酵时间长等问题，实现了中试发酵水平上，低成本制备木霉菌厚垣孢子产品的目标。
文档编号C12N1/14GK102154194SQ20111008107
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者张婷, 王秉丽, 陈捷 申请人:上海交通大学