专利名称：一种分离脂肪中无脂滴的有核细胞的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外分离纯化脂肪组织中无脂滴的有核细胞的方法和试剂盒。
背景技术：
脂肪组织中的干细胞种类与数量仅次于骨髓组织，是人体的第二大干细胞库。临床采集骨髓和采集腹部的脂肪，两者相比，采集脂肪病人更容易接受，相比而言痛苦也小一点。近年来减肥的吸脂手术后可获得大量的脂肪，这些脂肪为干细胞分离提取提供了非常便捷的来源。本试剂盒采用的方法法可将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排除代谢产物，这样就可以很快得到大量活 细胞，细胞也可以在短时间内生长成片。现有技术中从脂肪中分离纯化干细胞的方法存在着干细胞活率及回收率较低等缺点。
发明内容
本发明涉及一种用于体外分离纯化脂肪组织中无脂滴的有核细胞的试剂盒以及该试剂盒的使用方法。采用本发明的试剂盒从脂肪中分离纯化干细胞干细胞活率高及回收率高。本发明所述的试剂盒包括各自隔离包装的消化液、纯化液和悬浮液，其中消化液是溶于生理盐水的蛋白酶，其重量体积浓度为0. 25% ;纯化液是溶于生理盐水的聚蔗糖，其重量体积浓度为10% ;悬浮液是生理盐水，优选地，各自独立包装。本发明所述的试剂盒，其中所述的消化液纯化液悬浮液的体积比为(20-1500) (10-45) 20。本发明的试剂盒其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤(I)将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀；(2)将混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小时；(3)孵育完成后，用100目的滤网过滤混合溶液；(4)将混合溶液以离心力400xg(转速1500rpm) IOmin的条件下离心，去除上清；(5)用IOOml生理盐水重悬沉淀细胞；(6)将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中，将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心力710xg (转速2000rpm)，20分钟离心；(7)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C,离心力400xg (转速1500rpm), 8分钟离心洗漆细胞两次；(8)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
本发明所述的试剂盒，用于体外分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。本试剂盒利用蛋白酶分解脂肪的原理，采用梯度离心法分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。本发明所述的试剂盒，使用的样品类型为用于体外分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞，可以按照通用的方法收集脂肪样本；脂肪收集后应在6小时内进行分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。本发明所述的试剂盒，回收率可以达到》90%，分离的有核细胞活率> 96%，最大程度地维持了干细胞在体外微环境的恒定。本发明还公开了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤(I)将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀； (2)将混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小时； (3)孵育完成后，用100目的滤网过滤混合溶液；(4)将混合溶液以离心力400xg (转速1500rpm) IOmin的条件下离心，去除上清；(5)用IOOml生理盐水重悬沉淀细胞；(6)将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中，将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心力710xg (转速2000rpm)，20分钟离心；(7)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C,离心力400xg (转速1500rpm), 8分钟离心洗漆细胞两次；(8)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。本发明的细胞活率是采用如下方法进行检测的I吸管吸取90微升分离纯化后脂肪中无脂滴的有核细胞悬液。2加入0. 2%的台盼蓝染色液10微升，混匀。3静置3分钟。4吸取混合溶液，滴一滴至细胞计数板，均匀铺开后，显微镜下观察。5显微镜下计数，蓝染的细胞为死细胞(A)，无染色的细胞为活细胞(B)。有核细胞活率=B/(A+B)*100%
具体实施例方式实施例I细胞处理试剂盒(脂肪)的制备方法消化液的制备125g蛋白酶溶解在50000ml生理盐水中，浓度为0. 25%，37°C水浴，从水浴锅温度稳定在37°C开始计时8小时。37°C水浴8小时后，从水浴锅中取出，室温半小时，用量筒量取500ml，装入试剂瓶中，贴好标签，然后置于包装盒中。纯化液的制备聚蔗糖450g溶解在生理盐水4500ml中，浓度为10%，37°C水浴，从水浴锅温度稳定在37°C开始计时8小时。37°C 8小时后，从水浴锅中取出，室温半小时，用量筒量取45ml，装入试剂瓶中，贴好标签，然后置于包装盒中。悬浮液的制备生理盐水2000ml 37°C水浴，从水浴锅温度稳定在37°C开始计时8小时。37°C 8小时后，从水浴锅中取出，室温半小时，用量筒量取20ml，装入试剂瓶中，贴好标签，然后置于包装盒中。
细胞处理试剂盒(脂肪)F500型说明书广品名称通用名细胞处理试剂盒(脂肪)英文名CellIsolation Kit包装规格F500型消化液500ml纯化液45ml悬浮液20ml预期用途用于体外分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞作用原理利用蛋白酶分解脂肪的原理，采用梯度离心法分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。
主要组成组份L消化液(蛋白酶和磷酸盐缓冲液)2.纯化液(聚蔗糖和生理盐水)3.悬浮液(生理盐水)贮存条件及有效期2-8°C保存，有效期24个月。适用仪器低温离心机、离心管和移液管要求使用一次性产品(使用者自备，推荐使用无菌产品)。样本要求
本方法推荐的样品类型为脂肪； 按照通用的方法收集所需的脂肪样本； 脂肪收集后应在6小时内进行分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞； 微生物污染的样本对测定结果的影响尚未确定。试验方法本试剂盒可分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。细胞回收率和活率检测I吸管吸取90微升分离纯化后脂肪中无脂滴的有核细胞悬液。2加入0. 2%的台盼蓝染色液10微升，混匀。3静置3分钟。4吸取混合溶液，滴一滴至细胞计数板，均匀铺开后，显微镜下观察。5显微镜下计数，蓝染的细胞为死细胞(A)，无染色的细胞为活细胞(B)。有核细胞活率=B/(A+B)*100%操作步骤I将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀。2将混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小时。3孵育完成后，用100目的滤网过滤混合溶液。4将混合溶液以离心力400xg (转速1500rpm) IOmin的条件下离心，去除上清。5用IOOml生理盐水重悬沉淀细胞。6将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中，将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心力710xg(转速2000rpm), 20分钟离心。5离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C,离心力400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次。6将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
正常参考值分离脂肪中无脂滴的有核细胞活率>96%。注意事项
本品用于体外分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞； 操作前应仔细阅读使用说明书，严格按说明书的操作程序进行； 各试剂使用前应观察有无浑浊，如有则应更换试剂，严格控制每步离心的时间和温度。
权利要求
1.一种用于体外分离脂肪中无脂滴的有核细胞的试剂盒，包括各自隔离包装的消化液、纯化液和悬浮液，其中消化液是溶于生理盐水的蛋白酶，其重量体积浓度为0. 25% ;纯化液是溶于生理盐水的聚蔗糖，其重量体积浓度为10% ;悬浮液是生理盐水。
2.如权利要求I的试剂盒，其中所述的消化液、纯化液和悬浮液各自独立包装。
3.如权利要求2的试剂盒，其中所述的消化液纯化液悬浮液的体积比为(20-1500) (10-45) 20。
4.如权利要求1-3的任一权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤 (1)将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀； (2)将混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小时； (3)孵育完成后，用100目的滤网过滤混合溶液； (4)将混合溶液以离心力400xg(转速1500rpm)IOmin的条件下离心，去除上清； (5)用IOOml生理盐水重悬沉淀细胞； (6)将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中，将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心； (7)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C，离心力400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次； (8)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
5.如权利要求1-4的试剂盒的使用方法，包括如下步骤 (1)将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀； (2)将混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小时； (3)孵育完成后，用100目的滤网过滤混合溶液； (4)将混合溶液以离心力400xg(转速1500rpm)IOmin的条件下离心，去除上清； (5)用IOOml生理盐水重悬沉淀细胞； (6)将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中，将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4 °C，离心力710 X g (转速2000rpm)，20分钟离心； (7)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C，离心力400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次； (8)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
全文摘要
本发明涉及一种分离脂肪中无脂滴的有核细胞的试剂盒。本发明所述的试剂盒包括各自隔离包装的消化液、纯化液和悬浮液，其中消化液是溶于生理盐水的蛋白酶，其重量体积浓度为0.25％；纯化液是溶于生理盐水的聚蔗糖，其重量体积浓度为10％；悬浮液是生理盐水。本发明还涉及该试剂盒的使用方法。采用本发明的试剂盒从脂肪中分离纯化干细胞干细胞活率高及回收率高。
文档编号C12N5/0775GK102747031SQ201110097318
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者蔡云松, 迟明国 申请人:北京同盛颐和生物科技有限公司