专利名称：一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的方法和试剂盒。
背景技术：
干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。干细胞可以从骨髓、脐带血和外周血中分离纯化干细胞，单个核细胞常用的分离方法主要有以下几种6%羟乙基淀粉沉降法、甲基纤维素沉降法、Ficoll分离法、Percoll分离法、3%明胶分离法、氯化铵溶解红细胞法，直接离心法等。常用的单核细胞的分离方法为Ficoll或Percoll直接分离法。即将血液稀释后直接加于分 离液上经密度梯度离心获得单个核细胞。Ficoll和Percoil均为常用的淋巴细胞分离液，有人曾对这两种分离液对比研究，认为Ficoll分离获得的单个核细胞最为纯净。现有技术中从骨髓、脐带血和外周血中分离纯化干细胞的方法存在着干细胞活率及回收率较低等缺点，本研究预实验发现，采用Ficoll和Percoll直接分离法操作时间长、不同批次的Fieoll或Pcrcoll、不同的血液样本、同一样本同样操作，收集的单个核细胞的 数量多少不一，影响单个核细胞的稳定收集。我们的实验通过对比研究认为，采用6%羟乙基淀粉结合Ficoll用于分离血液中单核细胞提高了单核细胞的回收率和活率。
发明内容
本发明提供了一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的方法和试剂盒以及该试剂盒的使用方法。本发明所述的试剂盒包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6%，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。所谓隔离包装是指沉淀液、纯化液和悬浮液各自密封在互不相通的容器中，优选地，各自独立包装。本发明所述的试剂盒，其中所述的沉淀液纯化液悬浮液的体积比为(2-5) (3-9) I。本发明的试剂盒其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤(I)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；(2)用IOml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平。(3)将两个离心管4°C，离心力710xg (转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃
去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。
(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心カ710xg(转速2000rpm) ,20分钟离心,关闭离心机刹车功能。(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C,配平。离心カ400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次。(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。本发明所述的试剂盒，用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞。它利用细胞与无机盐离子联合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分离纯化有核细胞。本发明的试剂盒通常在2-8°C保存。本发明所述的试剂盒，使用的样品类型为骨髓/脐带血/外周血，可以按照通用的 方法收集所需的骨髄/脐带血/外周血样本；确保骨髄/脐带血/外周血收集后转入一次性抗凝血袋；骨髄/脐带血/外周血收集后应在6小时内进行分离纯化有核细胞。本发明所述的试剂盒，回收率可以达到》90%，分离的有核细胞活率> 96%，最大程度地維持了干细胞在体外微环境的恒定。本发明还公开了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤(I)将经过抗凝处理的骨髄/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；(2)用IOml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平。(3)将两个离心管4°C，离心カ710xg (转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃
去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心カ710xg(转速2000rpm), 20分钟离心,关闭离心机刹车功能。(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C,配平。离心カ400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次。(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。本发明的细胞活率是采用如下方法进行检测的I.吸管吸取90微升分离后的有核细胞悬液。2.加入O. 2%的台盼蓝染色液10微升，混匀。3.静置3分钟。4.吸取混合溶液，滴一滴至细胞计数板，均匀铺开后，显微镜下观察。5.显微镜200倍下人エ计数，蓝染的细胞为死细胞(A)，无染色的细胞为活细胞(B)。有核细胞活率=B/(A+B)*100%
具体实施例方式实施例I细胞处理试剂盒(骨髄、脐带血、外周血)SlOO型的制备方法沉淀液的制备羟こ基淀粉2. 40g溶解在生理盐水40ml中，浓度为6%，37°C水浴，从水浴锅温度稳定在37°C开始计时8小吋，37°C水浴8小时后，从水浴锅中取出，室温半小时，保存。纯化液的制备HIST0PAQUE1077液(聚蔗糖泛影钠)60ml，从冰箱温度稳定在4°C开始计时8小吋。4°C 8小时后，从4度冰箱中取出，室温半小时，保存。悬浮液的制备用量筒量取20ml生理盐水，保存。细胞处理试剂盒(骨髄、脐带血、外周血)SlOO型说明书产品名称通用名细胞处理试剂盒英文名CellIsolation Kit包装规格SlOO型沉淀液(羟こ基淀粉2.40g溶解在生理盐水40ml中，浓度为6% )40ml ;纯化液(聚蔗糖泛影钠)60ml ;悬浮液(生理盐水)20ml预期用途用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞作用原理利用细胞与无机盐离子联合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分离纯化有核细胞。主要组成组份沉淀液羟こ基淀粉、生理盐水；纯化液聚蔗糖泛影钠和生理盐水；悬浮液生理盐水贮存条件及有效期2-8°C保存，有效期24个月。适用仪器低温离心机、离心管和移液管要求使用一次性产品(使用者自备，推荐使用无菌产品)。样本要求
本方法推荐的样品类型为骨髄/脐带血/外周血 按照通用的方法收集所需的骨髄/脐带血/外周血样本； 确保骨髄/脐带血/外周血收集后转入一次性抗凝血袋； 骨髓/脐带血/外周血收集后应在6小时内进行分离纯化有核细胞 微生物污染的样本对测定结果的影响尚未确定。试验方法本试剂盒可分离纯化骨髄/脐带血/外周血中有核细胞。细胞活率检测I吸管吸取90微升分离后的有核细胞悬液。2加入O. 2%的台盼蓝染色液10微升，混匀。3静置3分钟。4吸取混合溶液，滴一滴至细胞计数板，均匀铺开后，显微镜下观察。5显微镜200倍下人エ计数，蓝染的细胞为死细胞(A)，无染色的细胞为活细胞⑶。有核细胞活率=BバA+B) *100%操作步骤I将经过抗凝处理的骨髄/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟。2用IOml的移液管将上清液转到两个50ml的离心管中，不要吸到红细胞沉淀，并配平。
3将两个离心管4°C，离心カ7IOxg (转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去
上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。4将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心カ710xg(转速2000rpm) ,20分钟离心,关闭离心机刹车功能。5离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C,配平。离心カ400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次。6将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。正常參考值分离的有核细胞活率彡96%。
注意事项
本品用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞； 操作前应仔细阅读使用说明书，严格按说明书的操作程序进行； 各试剂使用前应观察有无浑浊，如有则应更换试剂，严格控制每步离心的时间和温度。
权利要求
1.一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的试剂盒，包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6 %，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。
2.如权利要求I的试剂盒，其中所述的沉淀液、纯化液和悬浮液各自独立包装。
3.如权利要求2的试剂盒，其中所述的沉淀液纯化液悬浮液的体积比为(2-5) (3-9) I。
4.如权利要求1-3的任一权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤 (1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟； (2)用IOml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平； (3)将两个离心管4°C，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞； (4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心力710xg(转速2000rpm) ,20分钟离心,关闭离心机刹车功能； (5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C，配平。离心力400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次； (6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
5.如权利要求1-4的试剂盒的使用方法，包括如下步骤 (1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟； (2)用IOml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平； (3)将两个离心管4°C，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞； (4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4°C，离心力710xg(转速2000rpm) ,20分钟离心,关闭离心机刹车功能； (5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4°C，配平。离心力400xg(转速1500rpm) ,8分钟离心洗漆细胞两次； (6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
全文摘要
一种用于体外分离纯化有核细胞的试剂盒，包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6％，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。本发明还提供了所述试剂盒的使用方法。
文档编号C12N5/0786GK102747034SQ201110097289
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者蔡云松, 迟明国 申请人:北京同盛颐和生物科技有限公司