专利名称：一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备和保存方法
技术领域：
本发明属于微生物纯化、保存技术领域，具体涉及一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法和两种保存方法。
背景技术：
烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是烟草生产中的主要细菌病害之一，在中国大部分产烟区都有发生，而且有逐年加重的趋势。其病原菌是茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，该菌的寄主广泛，现有技术可实现对该菌的分离、培养和保存，见《中国烟草病害》(朱贤朝，王彦亭，王智发，中国农业出版社，2002，152 163页)，其采取的培养方式为将分离的材料表面消毒后，取病组织加入灭菌水后剪碎或磨碎，再取剪碎或磨碎液在 TTC培养基上划线或涂布，27 30°C培养3 4天后，检查培养的菌落，选择病菌菌落转入斜面培养、保存。该方式存在的不足是病菌在人工培养基上转接多次会导致病菌的变异、 一些固有的特性会丧失；而且有可能因为病菌数量少分离不到病菌。方中达编著的《植物病研究方法》(中国农业出版社，1998，187 189页)记载，有关保存烟草青枯病菌菌株的方法有真空冷冻干燥保存、冷冻甘油保存、矿物油保存、斜面保存和无菌水常温保存等方式。 真空冷冻干燥保存烟草青枯病菌虽然保存时间长、保存效果好，但需要配套的昂贵设备、操作烦琐、技术难度大。冷冻甘油保存方式如果长期保存时会出现烟草青枯病菌菌株存活率低、致病力下降的问题。矿物油保存、斜面保存方式的保存时间短、保存效果不佳。无菌水常温保存，烟草青枯病菌菌体会沉淀，外界温度变化大，保存效果得不到保障。为了防止烟草青枯病菌在人工培养基上连续传代，出现致病力迅速下降或其它遗传性状的改变的问题，以及现有技术保存培养物的效果不确定的缺陷，发展一种经济有效的、并保持烟草青枯病致病菌固有特性的分离培养和保存方法，显得尤为必要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法，第二、三目的在于提供两种保存该高纯培养物的方法。本发明的第一目的是这样实现的，导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法，采取以下步骤A、原料的制备选具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆用自来水洗净，经75%的酒精表面消毒2 3分钟后，用无菌水冲洗2 3次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成 3 5cm的小段；B、保湿培养在27 30°C下，将病株茎秆小段的截口暴露于灭菌蒸馏水外，无菌保湿培养12 M小时，有浓稠状液体从截口处流出，浓稠状液体为含茄科雷尔氏菌培养物；C、选择高纯培养物采用半选择TTC法进行培养测定，用移菌环取B步骤所得的浓稠状液体，以含有0. 吐温_80、pH值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径9 IOcm半选择TTC平板培养基上，27 30°C无菌培养3 4天后，选择含有80 120个菌落的培养基，且有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数80%以上的，即接种到该培养基上的浓稠状液体为含菌量在80%以上的含茄科雷尔氏菌高纯培养物。所述的无菌保湿培养是将病株茎秆小段置于灭菌的离心管或量筒中，用封口膜封口，病株茎秆小段的截口高出液面1 2cm。所述的离心管或量筒的内径比病株茎秆粗2 3mm。本发明第二个目的是这样实现的将高纯培养物加入到装有保存液A的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口， 在-20 _40°C恒温保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脱脂奶粉， 加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。本发明第三个目的是这样实现的将高纯培养物加入到装有保存液B的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口，在20°C 恒温保存；所述的保存液B是用1 2g琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。上述两种保存方法中，所述的保存容器为1. 5mL的离心管或2. OmL的菌种保存管。本发明相对于现有技术具有以下技术效果1、获得高纯培养直接、快速、纯度高、性状稳定。利用目标菌的寄主植物——烟草， 其茎秆微管系统发达的特性，直接将具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆进行保湿培养， 从而获得高纯培养物。这种方法避免了人工培养基导致病株传代中致病力下降或遗传性状改变的问题。配合半选择 TTC培养基(Granada G A, Sequeira L. Survival of Pseudomonas solanacearum in soil, rhizosphere and plant roots. Can. J. Microbiol. ,1983,29 433 440.)进行稀释分离、筛选高纯培养物，可经济、有效地获得固有特性保持良好的菌株。2、保存方法简便易行、保存效果好。保存目标菌的高纯培养物，可根据需要选择采用两种方法，即利用保存液A在-20 _40°C冷冻保存和利用保存液B在20°C恒温保存。冷冻保存将培养物作为菌种资源长期保存，如不反复冻融，可有效保存病菌10年以上；采用恒温保存，培养物中菌体存活率高，转接方便，可以有效保存病菌至少5年。
具体实施例方式下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明的保护范围。一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备方法，采取以下步骤A、原料的制备选具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆用自来水洗净，经75%的酒精表面消毒2 3分钟后，用无菌水冲洗2 3次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成 3 5cm的小段；B、保湿培养在27 30°C下，将病株茎秆小段的截口暴露于灭菌蒸馏水外，无菌保湿培养12 M小时，有浓稠状液体从截口处流出，浓稠状液体为含茄科雷尔氏菌培养物；C、选择高纯培养物采用半选择TTC法进行培养测定，用移菌环取B步骤所得的浓稠状液体，以含有0. 吐温-80、pH值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径9 IOcm半选择TTC平板培养基上，27 30°C无菌培养3 4天后，选择含有80 120个菌落的培养基，且有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数80%以上的，即接种到该培养基上的浓稠状液体为含菌量在80%以上的含茄科雷尔氏菌高纯培养物。上述制备方法中，所述的无菌保湿培养是将病株茎秆小段置于灭菌的离心管或量筒中，用封口膜封口，病株茎秆小段的截口高出液面1 2cm。所述的离心管或量筒的内径比病株茎秆粗2 3_。一种保存上述高纯培养物的方法，将高纯培养物加入到装有保存液A的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口， 在-20 -40°C恒温保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脱脂奶粉， 加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。另一种保存上述高纯培养物的方法，将高纯培养物加入到装有保存液B的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口，在 20°C恒温保存；所述的保存液B是用1 2g琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。上述保存方法中，所述的保存容器为1. 5mL的离心管或2. OmL的菌种保存管，其保存效果更好。实施例1 制备高纯培养物，采取以下步骤A、取具有烟草青枯病典型症状的烟草病株茎秆自来水洗净，经75%的酒精表面消毒3分钟后，用无菌水冲洗2次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成3cm的小段；B、在27°C下，将病株茎秆小段截口暴露于灭菌蒸馏水外1cm，无菌保湿培养12小时，直到有浓稠状液体从病株茎秆小段的截口处流出；C、采用半选择TTC培养测定，用移菌环取浓稠状液体，以含有0. 吐温-80的、 PH值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径IOcm的半选择TTC平板培养基上，27°C无菌培养3天后，培养基上包含有96个菌落，其中有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数的86.对％。配制保存液Al 用IOOOmL甘油和20g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，
摇勻，常规灭菌后制得。采用装有保存液Al的1. 5mL离心管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中， 保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL(采用常规稀释平板菌落计数法测定)，在_20°C 恒温保存；。实施例2 制备高纯培养物，采取以下步骤A、取具有烟草青枯病典型症状的烟草病株茎秆自来水洗净，经75%的酒精表面消毒2分钟后，在无菌条件下用无菌水冲洗3次，然后将病株茎秆截成5cm的小段；
B、在30°C下，将病株茎秆小段截口暴露于灭菌蒸馏水外2cm，无菌保湿培养M小时，直到有浓稠状液体从病株茎秆小段的截口处流出；C、采用半选择TTC培养测定，用移菌环取浓稠状液体，含有0. 1 %吐温-80的、pH 值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径9cm的半选择TTC平板培养基上， 30°C无菌培养4天后，培养基上包含有87个菌落，其中有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数的83. 15%。配制保存液A2 用200mL甘油和40g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。采用装有保存液A2的2. OmL菌种保存管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中，保存时细菌浓度为ι千万 10亿CFU/mL(采用常规稀释平板菌落计数法测定)， 在-40°C恒温保存。实施例3制备高纯培养物采取的方法中病株茎秆小段截口暴露于灭菌蒸馏水外1. 5cm, 无菌保湿培养18小时，其他均与实施例1相同。半选择TTC培养测定后，培养基上包含有 116个菌落，其中有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数的82. 32%。配制保存液A3 用150mL甘油和30g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。装有保存液A3的1. 5mL离心管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL(采用常规稀释平板菌落计数法测定)，在_30°C恒温保存。实施例4制备高纯培养物，采取的方法与实施例2相同。配制保存液A4 用ISOmL甘油和25g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。采用装有保存液A4的2. OmL菌种保存管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中，保存时细菌浓度为ι千万 10亿CFU/mL(采用常规稀释平板菌落计数法测定)， 在-30°C恒温保存。实施例5制备高纯培养物采取的方法与实施例1相同。配制保存液Bl 用1. 5g的琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。采用装有保存液Bl的1.5mL离心管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中， 保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL (采用常规稀释平板菌落计数法测定)，在20°C恒
温保存。实施例6制备高纯培养物采取的方法与实施例3相同。配制保存液B2 用Ig的琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得采用装有保存液B2的2. OmL菌种保存管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL (采用常规稀释平板菌落计数法测定)，在20°C恒温保存。实施例7制备高纯培养物采取的方法与实施例2相同。配制保存液B3 用2g的琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。采用装有保存液B3的2. OmL菌种保存管保存高纯培养物，将高纯培养物加入到其中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL (采用常规稀释平板菌落计数法测定)，在20°C 恒温保存。本发明技术效果的验证试验1、采用现有技术的半选择TTC培养测定法选择高纯培养物，属于现有技术。观察培养了 3 4天后的培养基，如果直径为9 IOcm的培养基上包含有80 120个菌落，并且有环状螺纹、边缘白色、中央粉红色的较大菌落占总菌落数的80%以上，说明该培养基所接种的浓稠状液体的含菌量在80%以上。选择含菌量大于80%的培养物保存，保证了培养物的高纯度。2、用第一种方法所保存菌株的活力和致病力试验结果1)随机抽取采用保存液A、以-20 _40°C恒温保存了 10年的M株病菌菌株，用半选择TTC培养测定，发现所有供试菌株的存活率均在40%以上，纯度在70%以上。2)从M株病菌菌株中任意抽取12株菌株，采用公知技术的注射法接种苗龄45 55天的K326( —种主栽的烟草品种)烟苗的第3、4片真叶，在M小时内观察过敏性反应， 结果表明所有的菌株致病力保持不变。3)采用Hicks烟草品种(一种测定茄科雷尔氏菌菌株致病力常用的烟草品种)， 用公知技术的湿润育苗灌根法接种另外12株病菌菌株，结果发现病情指数与10年前的相比变化范围为1 3，致病力变化不显著。由此说明，第一种方法保存10年后的菌株活力保持良好，致病力变化不大。3、用第二种方法所保存菌株的活力和致病力试验结果1)随机抽取采用保存液B、以20°C恒温保存了 5年的20株病菌菌株，用半选择TTC 培养测定，发现所有的供试菌株存活率均在35 %以上，纯度在60%以上。2)从20株病菌菌株中任意取10株菌株，采用公知技术的注射法接种苗龄45 55天的1(3 烟苗的第3、4片真叶，在M小时内观察过敏性反应，结果表明所有的菌株致病力保持不变。3)采用Hicks烟草品种湿润育苗灌根法接种另外10株病菌菌株，结果发现病情指数与5年前的相比变化范围为1 3，致病力变化不显著。由此说明，第二种方法保存5年后的菌株活力保持良好，致病力变化不大。本发明特点1、直接进行保湿培养，简便快速，培养物的纯度高，有效保持了菌株的固有特性；2、保存方式易于实施，操作简便，保存时间长，效果好。
权利要求
1.一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的制备方法，其特征是采取以下步骤A、原料的制备选具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆用自来水洗净，经75%的酒精表面消毒2 3分钟后，用无菌水冲洗2 3次，然后在无菌条件下将病株茎秆截成3 5cm的小段；B、保湿培养在27 30°C下，将病株茎秆小段的截口暴露于灭菌蒸馏水外，无菌保湿培养12 M小时，有浓稠状液体从截口处流出，浓稠状液体为含茄科雷尔氏菌培养物；C、选择高纯培养物采用半选择TTC法进行培养测定，用移菌环取B步骤所得的浓稠状液体，以含有0. 吐温_80、pH值为6. 8的灭菌磷酸缓冲液10倍系列稀释后，涂布于直径 9 IOcm半选择TTC平板培养基上，27 30°C无菌培养3 4天后，选择含有80 120个菌落的培养基，且有环状螺纹、边缘白色中央粉红色的较大菌落占总菌落数80%以上的，即接种到该培养基上的浓稠状液体为含菌量在80%以上的含茄科雷尔氏菌高纯培养物。
2.根据权利要求1所述的导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的制备方法，其特征是所述的无菌保湿培养是将病株茎秆小段置于灭菌的离心管或量筒中，用封口膜封口，病株茎秆小段的截口高出液面1 2cm。
3.根据权利要求2所述的导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的制备方法，其特征是所述的离心管或量筒的内径比病株茎秆粗2 3mm。
4.一种保存权利要求1所述的导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的方法，其特征是将高纯培养物加入到装有保存液A的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10 亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口，在-20 _40°C恒温保存；所述的保存液A 是用100 200mL甘油和20 40g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇勻，常规灭菌后制得。
5.一种保存权利要求1所述的导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的方法， 其特征是将高纯培养物加入到装有保存液B的保存容器中，保存时细菌浓度为1千万 10亿CFU/mL，将旋盖或扣盖盖紧后，用封口膜封口，在20°C恒温保存；所述的保存液B是用 1 2g琼脂加入至IOOOmL蒸馏水中融化、摇勻，常规灭菌后制得。
6.根据权利要求4或5所述的保存导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物的方法，其特征是所述的保存容器为1. 5mL的离心管或2. OmL的菌种保存管。
全文摘要
本发明公开了一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备和保存方法，将烟草青枯病典型症状的病株茎秆处置后，27～30℃无菌保湿培养12～24小时，获得含茄科雷尔氏菌培养物；经过TTC法鉴定、筛选含菌量在80％以上的高纯培养物；所获得的高纯培养物可采用保存液A在-20～-40℃恒温保存，或采用保存液B在20℃恒温保存；保存液A为100～200mL甘油和20～40g脱脂奶粉，加入蒸馏水溶解、定容至500mL，摇匀，常规灭菌后制得；保存液B是将1～2g的琼脂加入至1000mL蒸馏水中融化、摇匀，常规灭菌后制得。本发明的制备和保存方法简便、易行，目标菌纯度高、性状稳定，保存效果好。
文档编号C12N1/04GK102229897SQ201110112228
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者余清, 宋春满, 方敦煌, 晋艳, 秦西云, 胡坚 申请人:云南省烟草农业科学研究院