专利名称：一种诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法
技术领域：
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种效果好、效率高、污染率低的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法。
背景技术：
慨I後霉(Fhytophthora parasitica var. flicoiiaaae)是烟草黑胫病的病原， 在自然条件下，主要通过游动孢子从烟株的根部或茎基部侵染，人工培养时，可以经过培养菌丝、诱导产生游动孢子囊、低温处理让游动孢子囊释放游动孢子，从而获得数量更多的游动孢子。常用的诱导方法是利用燕麦平板培养菌丝、0.1% KNO3溶液浸润，可以诱导烟草疫霉产生游动抱子囊[Gooding G V, Lucas G B. Factors influencing sporangail formation and zoospore activity in Phytophthora parasitica var. nicotianae. Phytopathology, 1959，49:277-281;刘延荣，谢成颂，王智发等.烟草黑胫病菌孢子囊形成和游动孢子释放条件的研究.山东农业科学，1987(1) :28-30.]，但对于不同来源的菌株，诱导后低温处理释放游动孢子的差异较大，有些菌株甚至不释放游动孢子。还可以采取烟草疫霉在燕麦培养基上生长菌丝后，滴加土壤浸出液的皮氏培养液诱导产生游动孢子囊，经低温处理后，再适温培养、产生大量游动孢子[杨建卿，江彤，陈学平. 烟草疫霉菌的培养及大量产生游动孢子囊和游动孢子方法的研究.植物保护，2001， 27 ) :12-14.]，但是由于土壤浸出液未经严格灭菌、皮氏培养液湿热灭菌，诱导产生游动孢子囊的效果不稳定、也容易污染。中国发明专利ZL 200410040934. 4还公开了一种烟草疫霉的产孢培养方法，所采用的是在分离烟草疫霉时，选择芝麻培养基或黑麦培养基为烟草疫霉的孢子囊培养基，在芝麻培养基、黑麦培养基平板上接种活化的烟草疫霉，温箱中培养14天后，刮取菌丝，用0. 1%KN03浸润，5、天后测孢子囊数量、孢子囊大小，孢子囊在6 11°C下处理15 25min释放游动孢子，但该方法的诱导时间偏长、游动孢子释放率有待提尚。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种效果好、效率高、污染率低的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法。本发明的目的是这样实现的，诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法包括以下步骤
A、烟草疫霉菌丝培养取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于l(Tl5mL燕麦培养基平板上， 在26l8°C下培养1(Γ12天;
B、制备产生游动孢子囊的诱导液选择感黑胫病烟草品种6 7片真叶完全展开的烟草幼苗，完整地取出烟苗的根系，用自来水冲洗去除根系上的土壤或育苗基质，甩干或吸干明水；按20ml自来水加新鲜根系广2g的比例制成根水混合物，捣碎或研磨成可过40目流体筛的悬浮物，用5倍体积的自来水冲洗筛网、稀释滤液，混勻；初滤后，再依次用0. 45 μ m、0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，即获得所述的诱导液，其质量百分比浓度为；
C、诱导产生游动孢子囊向已经培养1(Γ12天的菌丝平板上加入纩IOmL诱导液浸润菌丝，在^ 28°C、12(Tl50r/min下振荡培养2 3天，即可诱导产生游动孢子囊；
D、诱导释放游动孢子取出诱导培养2 3天的菌丝平板，放置于冰箱2(T30min 后将平板取出，放置于M 26°C培养箱静止3飞小时，即可释放游动孢子。作为优选方式
所述的步骤A中采用的是IOOmL或150mL细口三角瓶制成的燕麦培养基。所述的步骤B中采用的初滤为滤纸过滤或抽滤。所述的步骤B中微孔滤膜过滤采取抽滤或针管压滤的方式。所述的诱导液可在2、°C冰箱中保存30天。所述的感黑胫病的烟草品种是根据GB/T 23224-2008《烟草品种抗病性鉴定》中的方法进行的测定。本发明相对于现有技术，具有以下技术效果
1、优选产生游动孢子囊的诱导液，提高了诱导效果和效率。烟草本身是烟草疫霉的寄主植物，特别是感黑胫病烟草品种更容易与烟草疫霉发生亲和反应，采用感黑胫病烟草品种幼苗根系组织滤液可高效诱导游动孢子囊的产生，试验证明每平方厘米的菌丝块的平均产孢量在10万个以上，游动孢子释放率在60%以上，游动孢子释放短而集中、活动能力强。2、优化了培养方式。采用细口三角瓶培养基进行菌丝培养，利用通气振荡培养方式直接诱导平板上的菌丝，不采用刮取菌丝的培养方式，避免了培养过程中污染的产生；同时，制作诱导液的过程中经过了过滤灭菌，从而大大减少了污染的机会。试验证明严格按本发明技术方案操作，可以实现零污染，也就说明本发明方法的重复性好、效果稳定。3、提高了工作效率。采用本发明方法培养菌丝、诱导产生游动孢子囊的时间明显缩短，良好的通气条件保证了菌丝的充分生长，培养菌丝的时间比常规缩短2 3天；诱导产生游动孢子囊的时间为2 3天，4 6°C处理2(T30min，取出放置于M 26°C培养箱静止3飞小时，即可获得游动孢子，浓度在1000万个/mL以上。
具体实施例方式下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明的保护范围。本发明所述的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，包括以下步骤
A、烟草疫霉菌丝培养取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于l(Tl5mL燕麦培养基平板上， 在洸 28°C下培养10 12天；
B、制备产生游动孢子囊的诱导液选择感黑胫病烟草品种6 7片真叶完全展开的烟草幼苗，完整地取出烟苗的根系，用自来水冲洗去除根系上的土壤或育苗基质，甩干或吸干明水；按20ml自来水加新鲜根系广2g的比例制成根水混合物，捣碎或研磨成可过40目流体筛的悬浮物，用5倍体积的自来水冲洗筛网、稀释滤液，混勻；初滤后，再依次用0. 45 μ m、 0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，即获得所述的诱导液，其质量百分比浓度为；
C、诱导产生游动孢子囊向已经培养1(Γ12天的菌丝平板上加入纩IOmL诱导液浸润菌丝，在^ 28°C、12(Tl50r/min下振荡培养2 3天，即可诱导产生游动孢子囊；
D、诱导释放游动孢子取出诱导培养2 3天的菌丝平板，放置于Γ6 冰箱2(T30min 后将平板取出，放置于M 26°C培养箱静止3飞小时，即可释放游动孢子。所述的步骤A中采用的是IOOmL或150mL细口三角瓶制成的燕麦培养基。所述的步骤B中采用的初滤为滤纸过滤或抽滤。所述的步骤B中微孔滤膜过滤采取抽滤或针管压滤的方式。所述的诱导液可在2、°C冰箱中保存30天。实施例1
诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，采取以下步骤
A、烟草疫霉菌丝培养取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于100mL细口三角瓶制作的 IOmL燕麦培养基平板上，在^T28°C下培养10天；
B、制备产生游动孢子囊的诱导液选用感黑胫病烟草品种(红花大金元)6^7片真叶完全展开的烟草幼苗，完整地取出烟苗的根系，用自来水冲洗去除根系上的土壤或育苗基质， 甩干或吸干明水；按20ml自来水加新鲜根系Ig的比例制成根水混合物，捣碎或研磨成可过 40目流体筛的悬浮物，用5倍体积的自来水冲洗筛网、稀释滤液，混勻；用滤纸过滤后，再依次用0. 45 μ m、0. 22 μ m的微孔滤膜抽滤，即获得所述的诱导液，其质量百分比浓度为1% ；
C、诱导产生游动孢子囊向已经培养10天的菌丝平板上加入SmL诱导液浸润菌丝，在 26^28°CU20r/min下振荡培养2天，即可诱导产生游动孢子囊；
D、诱导释放游动孢子取出诱导培养2天的菌丝平板，放置于4°C冰箱20min后将平板取出，放置于M 26°C培养箱静止3小时，即可释放游动孢子。经测定，游动孢子囊浓度在12万个/cm2，游动孢子释放率在65%。实施例2:
诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，采取以下步骤
A、烟草疫霉菌丝培养取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于150mL细口三角瓶15mL燕麦培养基平板上，在26 28°C下培养12天；
B、制备产生游动孢子囊的诱导液选用感黑胫病烟草品种(KRD6)的6 7片真叶完全展开的烟草幼苗，完整地取出烟苗的根系，用自来水冲洗去除根系上的土壤或育苗基质，甩干或吸干明水；按20ml自来水加新鲜根系2g的比例制成根水混合物，捣碎或研磨成可过 40目流体筛的悬浮物，用5倍体积的自来水冲洗筛网、稀释滤液，混勻；用滤纸抽滤后，再依次用0. 45 μ m、0. 22 μ m的微孔滤膜针管压滤，即获得所述的诱导液，其质量百分比浓度为 2% ；
C、诱导产生游动孢子囊向已经培养12天的菌丝平板上加入IOmL诱导液浸润菌丝，在 26^28°CU50r/min下振荡培养3天，即可诱导产生游动孢子囊；
D、诱导释放游动孢子取出诱导培养3天的菌丝平板，放置于6°C冰箱30min后将平板取出，放置于M 26°C培养箱静止6小时，即可释放游动孢子。经测定，游动孢子囊浓度在25万个/cm2，游动孢子释放率在70%。实施例3
诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，采取以下步骤
A、烟草疫霉菌丝培养取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于IOOmL细口三角瓶15mL燕麦培养基平板上，在26 28°C下培养11天；
B、制备产生游动孢子囊的诱导液选用感黑胫病烟草品种(小黄金1025)的6 7片真叶完全展开的烟草幼苗，完整地取出烟苗的根系，用自来水冲洗去除根系上的土壤或育苗基质，甩干或吸干明水；按20ml自来水加新鲜根系1. 5g的比例制成根水混合物，捣碎或研磨成可过40目流体筛的悬浮物，用5倍体积的自来水冲洗筛网、稀释滤液，混勻；用滤纸过滤后，再依次用0. 45 μ m、0. 22 μ m的微孔滤膜针管压滤，即获得所述的诱导液，其质量百分比浓度为1. 5% ；
C、诱导产生游动孢子囊向已经培养11天的菌丝平板上加入9mL诱导液浸润菌丝，在 26^28°CU35r/min下振荡培养3天，即可诱导产生游动孢子囊；
D、诱导释放游动孢子取出诱导培养3天的菌丝平板，放置于5°C冰箱25min后将平板取出，放置于M 26°C培养箱静止4. 5小时，即可释放游动孢子。经测定，游动孢子囊浓度在18万个/cm2，游动孢子释放率在67%。本发明技术效果的验证
试验证明采用本发明所述的方法，每平方厘米的菌丝块的平均产孢量在10万个以上，游动孢子释放率在60%以上。在良好的通气条件下，经过1(Γ12天就可获得丰厚的培养菌丝，表现为菌丝层厚、密集。诱导菌丝平板产生游动孢子囊的时间为2 3天，冰箱内放置2(T30min，取出放置于M 26°C培养箱静止3飞小时，所获得的游动孢子浓度在1000 万个/mL以上，游动孢子浓度比其他方法高1(Γ50倍，时间缩短了 2飞天。试验同时证明游动孢子在3飞小时大量释放，短而集中、活动能力强。本发明特点
1、改善了菌丝培养方法，缩短了培养时间，培养效果好。2、采用感黑胫病烟草品种最易感病的6 7片真叶的幼苗根系组织滤液作为诱导液，提高了诱导效果和游动孢子的产生效率。3、改善了释放方法，游动孢子释放集中，效果好。4、本发明方法的重复性好、效果稳定、效率高。
权利要求
1.一种诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，其特征是所述的方法包括以下步骤A、烟草疫霉菌丝培养取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于l(Tl5mL燕麦培养基平板上， 在洸 28°C下培养10 12天；B、制备产生游动孢子囊的诱导液选择感黑胫病烟草品种6 7片真叶完全展开的烟草幼苗，完整地取出烟苗的根系，用自来水冲洗去除根系上的土壤或育苗基质，甩干或吸干明水；按20ml自来水加新鲜根系广2g的比例制成根水混合物，捣碎或研磨成可过40目流体筛的悬浮物，用5倍体积的自来水冲洗筛网、稀释滤液，混勻；初滤后，再依次用0. 45 μ m、 0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，即获得所述的诱导液，其质量百分比浓度为；C、诱导产生游动孢子囊向已经培养1(Γ12天的菌丝平板上加入纩IOmL诱导液浸润菌丝，在^ 28°C、12(Tl50r/min下振荡培养2 3天，即可诱导产生游动孢子囊；D、诱导释放游动孢子取出诱导培养2 3天的菌丝平板，放置于Γ6 冰箱2(T30min 后将平板取出，放置于M 26°C培养箱静止3飞小时，即可释放游动孢子。
2.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，其特征是所述的步骤A中采用的是IOOmL或150mL细口三角瓶制成的燕麦培养基。
3.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，其特征是所述的步骤B中采用的初滤为滤纸过滤或抽滤。
4.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，其特征是所述的步骤B中微孔滤膜过滤采取抽滤或针管压滤的方式。
5.根据权利要求1所述的诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，其特征是所述的诱导液可在2、°C冰箱中保存30天。
全文摘要
本发明公开了一种诱导烟草疫霉产生游动孢子囊并释放孢子的方法，包括采用细口三角瓶制成的燕麦培养基完成的烟草疫霉菌丝培养，选用感黑胫病品种的6~7片真叶完全展开的烟草幼苗的根系制备产生游动孢子囊的诱导液，用诱导液诱导产生游动孢子囊，以及诱导释放游动孢子的步骤。本发明利用感黑胫病的烟草品种更容易与烟草疫霉发生亲和反应的特性，以感黑胫病烟草品种幼苗根系组织的滤液作为诱导液，对培养的菌丝体进行诱导，产生游动孢子囊。经试验证明本发明方法诱导时间短、游动孢子释放率高，获得的游动孢子含量高，不需要刮取菌丝培养，污染少，简便易行。
文档编号C12N3/00GK102226167SQ20111014442
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者宋春满, 方敦煌, 晋艳, 王成, 秦西云 申请人:云南省烟草农业科学研究院