专利名称：一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测水质毒性的菌剂，具体涉及一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂。
背景技术：
费氏弧菌是一种特殊的海洋细菌，它能在海水中存活并发光，当遇到有毒物质时， 其发光能力会减弱。发光强度的变化与毒性物质的毒性大小有关，所以常利用受污染水体与发光细菌接触时发光强度的变化大小判断水质生物急性毒性。采用发光细菌法进行检测具有时间短、灵敏度高等特点，而且还能弥补常规理化监测的不足，因此被广泛采用。国家标准方法(GT/T15441-1995)发光菌毒性检验的检测方法是利用发光菌冻干粉的相对发光强度进行毒性检验，该方法的第一步就是要使发光细菌的冻干粉复苏，即使发光细菌恢复发光，恢复发光的时间至少需要15-30min ；由于这些因素的限制，使该方法只能在实验室中进行。国内外已有许多研究机构利用发光菌毒性检验在水环境监测的优势，尝试研制发光细菌传感器用于现场连续、原位、自动化监测，以下是他们遇到的主要的问题
1)对冻干粉进行复苏的时间至少为15-30min，有的更长，并且在测量的过程中，由于时间的严重滞后性，不能实现对水质的在线监测；
2)复苏后的冻干粉发光稳定性不好，影响毒性监测的准确性。研究表明，费氏弧菌利用群体感应系统进行细胞与细胞之间的交流，并能调节细菌的发光特性。群体感应系统在调节费氏弧菌发光的过程中，荧光素酶由luxCDABE基因编码，LuxI和LuxR蛋白构成群体感应的调控蛋白，其中LuxI为自诱导物合成酶，能合成一种酰基高丝氨酸内酯类化合物(N- (3-氧代-己酰)-高丝氨酸内酯，即AHL)，又将这种化合物成为群体感应的信号分子。LuxR在与AHL结合以后被激活，调控luxICDABE基因的表达。 当细菌密度较低时，IuxI基因表达较少，只能产生少量的自诱导物并自由通过细胞膜分泌到细胞外，使细胞内和细胞外始终含有相同浓度的AHL，这时luxCDABE基因表达的量不足以使菌体发光；随着细菌数量不断地增多，菌密度不断的加大，细胞外的自诱导物达到极限浓度(1_1(^8/!111)时，就能与细胞质中的LuxR蛋白充分结合；结合了自诱导物的LuxR蛋白的DNA结合区域暴露，此时的LuxR蛋白能与luxICDABE基因的启动子结合，从而激活该基因的表达，最终形成生物发光现象。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于群体感应效应信号分子的能快速检测水质毒性的发光细菌菌剂，利用发光细菌培养液上清中含有的信号分子对发光细菌冻干粉的发光情况进行调节，使冻干粉的复苏至稳定的时间从市售产品的15-30min，缩短到 5min，能根据环境变化的刺激所产生的光信号强度的变化能对水生态环境的毒性做出及时的反应，真正的做到在线、实时监测。本发明所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是光细菌冻干粉的成分为浓度为IO9个/ml的费氏弧菌10ml，经离心后的菌泥和Iml冷冻保护剂混合，并经冷冻干燥后制成，共重0. 5g，并置于-20°C的条件保存，保存时间6个月。所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是所述费氏弧菌为经筛选、斜面培养和摇床菌液培养获得发光强度在700mV以上的发光细菌菌液。所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特所述冷冻保护剂的成分为脱脂乳15g、甘油5g、海藻糖12. 5g溶于IOOml信号分子溶液中配制而成。所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述信号分子溶液是将信号分子母液与3%NaCl溶液混合，配制成体积比为信号分子母液3°鄉冗1溶液为30:70 的混合液。
所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其所述信号分子母液通过以下方法制备将培养14h的发光细菌菌液在8500rpm下离心5min，再通过0. 22 μ m的滤膜过滤灭菌，每IOOml滤液加入3gNaCl，即为信号分子母液，置于4°C的条件保存。所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述摇床菌液培养是将发光细菌接种到液体培养基中，置于摇床中调至180rpm，2(TC，震荡培养；液体培养基成分为0. 5g酵母浸出汁、0. 5g胰蛋白胨、3gNaCl、0. 5gNa2HP04、0. IgKH2PO4,3ml甘油，溶于 IOOml蒸馏水中，调pH至6. 8。所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述斜面培养是先将固体培养基(高于40°C时为液态，40°C以下凝结呈固态)在高温时倒入50ml试管中，倒入量应为试管容积的1/4-1/3，将试管倾斜置于室温中，待其冷却即可形成固态的斜面培养基， 将细菌接种到固体培养基即为斜面培养；固体培养基在液体培养基成分的基础上，再加入 2% (质量分数)的琼脂即可。发光细菌的发光原理
不同发光细菌的发光机理是相同的是特异性的荧光素酶(LE)在有氧(O2)参与的条件下，将还原性的黄素核苷酸(FMNH2)和八碳以上长链脂肪醛(RCHO)氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450 490nm处的蓝绿光的过程。历程如下
FMNH2+LE —FMNH2 ·Ι +02 —LE 'FMNH2 O2+RCH^LE .FMNH2 .02 'RCHO^ LE+FMN+H20+RC00 H+光
本发明和现有技术相比具有以下的优点
(1)在发光细菌冻干粉中加入了细菌群体感应的信号分子，该信号分子存在能调节细胞内荧光素酶的合成，而荧光素酶是细菌产生荧光的催化剂。由于信号分子的加入能促进细胞内荧光素酶的合成，使发光细菌冻干粉复苏至发光稳定的时间缩短，从传统的 15-30min达到稳定，缩短到5min即能达到稳定。(2)由于在细菌冻干粉制作过程中需要经历冷冻和干燥两个过程，这两个过程会对细菌结构和活性造成极大的影响。复合冷冻保护剂的加入，能使更多的细菌在冷冻和干燥时保持细胞结构的完整和细胞的活性，并在条件适宜的时候即可复苏。
具体实施例方式本发明所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是光细菌冻干粉的成分为浓度为IO9个/ml左右的费氏弧菌10ml，经离心后的菌泥和Iml冷冻保护剂混合，并经冷冻干燥后制成，共重0. 5g，并置于-20°c的条件保存，保存时间6个月。进一步，所述费氏弧菌为经筛选、斜面培养和摇床菌液培养获得发光强度在700mV 以上的发光细菌菌液。进一步，所述冷冻保护剂的成分为脱脂乳15g、甘油5g、海藻糖12. 5g溶于IOOml 信号分子溶液中配制而成。进一步，所述信号分子溶液通过以下方法制备将信号分子母液与6%NaCl(质量分数)溶液混合，配制成信号分子母液3%NaCl溶液为30:70的混合液。
进一步，所述信号分子母液通过以下方法制备将培养14h的发光细菌菌液在 8500rpm下离心5min，再通过0. 22 μ m的滤膜过滤灭菌，每IOOml滤液加入3gNaCl，即为信号分子母液，置于4°C的条件保存。进一步，所述摇床菌液培养是将发光细菌接种到液体培养基中，置于摇床中调至 180rpm, 20°C，震荡培养；液体培养基成分为0. 5g酵母浸出汁、0. 5g胰蛋白胨、3gNaCl、 0. 5gNa2HP04、0. IgKH2PO4, 3ml 甘油，溶于 IOOml 蒸馏水中，调 pH 至 6. 8。进一步，所述斜面培养是先将固体培养基(高于40°C时为液态，40°C以下凝结呈固态)在高温时倒入50ml试管中，倒入量应为试管容积的1/4-1/3，将试管倾斜置于室温中， 待其冷却即可形成固态的斜面培养基，将细菌接种到固体培养基即为斜面培养；固体培养基在液体培养基成分的基础上，再加入2% (质量分数)的琼脂即可。本发明具体包括步骤 第一步，发光细菌的培养
检测所有的发光细菌为费氏弧菌，为本实验室自主分离保存。冻干粉制作前对发光细菌进行筛选、斜面培养和液体培养获得初始发光强度不低于700mV的新鲜菌液，即为活化好的菌液，备用。液体培养基成分为0. 5g酵母浸出汁、0. 5g胰蛋白胨、3gNaCl、0. 5gNa2HP04、 0. IgKH2PO4,3ml甘油，溶于IOOml蒸馏水中，调pH至6. 8。此为液体培养基；
固体培养基在液体培养基成分的基础上，再加入2% (质量分数)的琼脂即可。第二步，发光细菌冻干粉的制作
将活化好的发光细菌在液体培养基中培养22h，将菌液在8500rpm，20°C下离心，按10 1浓缩收集(每IOml菌液离心后，倒出上清，加入Iml冷冻保护剂)，重悬，分装于无菌安瓿管中，每管0. 5ml，先置于超低温冰箱_70°C预冻lh，然后置于冷冻干燥机_50°C低压干燥10h， 常温干燥2h。冻干粉制作完毕置于-20°C下保存。第三步，发光细菌冻干粉的复苏
将安瓿管置于20°C恒温下稳定2-5min，每只安瓿管加入Iml蒸馏水，震荡至溶解。复苏5min即可用于测定。第四步，样品的毒性测定
在原废水中加入固体NaCl配成含3%NaCl (质量分数)的溶液，再用3%NaCl (质量分数)溶液按10倍逐级稀释法将废水样稀释，通过预实验判断水样的中、低限浓度，即粗测一遍当细菌相对发光强度在1%_100%时，废水的浓度落在哪一浓度范围。根据预实验的结果， 将加入固体NaCl的原废水浓度做为最高浓度，将废水落在细菌的相对发光强度在1%_100% 浓度范围的溶液再按等对数间距原则稀释成5-6个待测水样(例如，若当细菌相对发光强度在1%-100%时，废水的浓度落1%_10%之间，则应稀释成10%,6. 31%,3. 98%,2. 51%、1. 58、 1.00%)。稀释好的水样各取ImL加入测试管中，以3%NaCl (质量分数)溶液作对照，将复苏好的发光细菌冻干粉每管加入20 μ L，IOmim后，测定发光强度，并计算发光抑制率。用直线内插法求出相对发光抑制率为50%时所对应的废水浓度，即为该废水对发光细菌半数发光抑制率(EC5Q)。第五步，水质毒性的表示方法
利用原水稀释后的百分比浓度表示其EC5tl，按《百分数等级毒性划分标准》判断水质毒性。百分数等级毒性划分标准_
权利要求
1.一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是光细菌冻干粉的成分为浓度为 IO9个/ml的费氏弧菌10ml，经离心后的菌泥和Iml冷冻保护剂混合，并经冷冻干燥后制成， 并置于-20°C的条件保存，保存时间6个月。
2.根据权利要求1所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是所述费氏弧菌为经筛选、斜面培养和摇床菌液培养获得发光强度在700mV以上的发光细菌菌液。
3.根据权利要求1所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是所述冷冻保护剂的成分为脱脂乳15g、甘油5g、海藻糖12. 5g溶于IOOml信号分子溶液中配制而成。
4.根据权利要求3所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述信号分子溶液是将信号分子母液与质量为6%NaCl+溶液混合，配制成体积比为信号分子母液6%NaCl溶液为30:70的混合液。
5.根据权利要求4所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述信号分子母液为将培养14h的发光细菌菌液在8500rpm下离心5min，再通过0. 22 μ m的滤膜过滤灭菌，每IOOml滤液加入3gNaCl，即为信号分子母液，置于4°C的条件保存。
6.根据权利要求2所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述摇床菌液培养是将发光细菌接种到液体培养基中，置于摇床中调至180rpm，2(TC，震荡培养； 液体培养基成分为0. 5g酵母浸出汁、0. 5g胰蛋白胨、3gNaCl、0. 5gNa2HP04、0. IgKH2PO4,3ml 甘油，溶于IOOml蒸馏水中，调pH至6. 8。
7.根据权利要求2所述的一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是，所述斜面培养是先将固体培养基在高温时倒入50ml试管中，倒入量应为试管容积的1/4-1/3，将试管倾斜置于室温中，待其冷却即可形成固态的斜面培养基，将细菌接种到固体培养基即为斜面培养；固体培养基在液体培养基成分的基础上，再加入质量百分数为2%的琼脂。
全文摘要
本发明公开一种基于信号分子支撑的快速发光菌剂，其特征是光细菌冻干粉的成分为浓度为109个/ml的费氏弧菌10ml，经离心后的菌泥和1ml冷冻保护剂混合，并经冷冻干燥后制成，并置于-20℃的条件保存，保存时间6个月；冷冻保护剂是由脱脂乳15g、甘油5g、海藻糖12.5g溶于100ml信号分子溶液中配制而成。本发明具有以下的优点由于信号分子的加入能促进荧光素酶的合成，使发光细菌冻干粉复苏至发光稳定的时间缩短，从传统的15-30min达到稳定，缩短到5min即能达到稳定；由于复合冷冻保护剂的加入，能使更多的细菌在冷冻和干燥时保持细胞结构的完整和细胞的活性，并在条件适宜的时候即可复苏。
文档编号C12R1/63GK102250771SQ20111014442
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者何强, 叶姜瑜, 李书钺, 王琳, 翟俊 申请人:重庆大学