专利名称：新分析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测血红蛋白降解的分析法。
已知有几种寄生虫可通过其蛋白酶降解宿主细胞的血红蛋白，例如人疟疾寄生虫恶性疟原虫(plasmodium falciparum)，它具有一定的能力重新合成或从周围环境中摄取氨基酸。因此，这种寄生虫将宿主红细胞的血红蛋白作为其主要营养来源，在其寄生于红细胞内的短暂生命周期中，将消耗宿主细胞25-75％的血红蛋白。如此大量的分解代谢可能是存在于独特酸性细胞器中地一种规律过程，这种细胞器被称为消化小泡，其最适pH值约为5。目前已知至少有三种空泡蛋白酶(两种天门冬氨酸蛋白酶和一种半胱氨酸蛋白酶)与人血红蛋白的降解成其组成氨基酸有关。其中一种天门冬氨酸蛋白酶——Plasmepsin I存在于血红蛋白降解的初始阶段，使分子发生首次裂解并展开，这样进一步的蛋白水解才能有效进行。另一种天门冬氨酸蛋白酶Plasmepsin II可能以重叠的特异性裂解血红蛋白。半胱氨酸蛋白酶Falcipain也参与了血红蛋白降解的早期步骤。以上三种蛋白酶均可在体外裂解变性的血红蛋白。
如Daniel E.Goldberg等人在“恶性疟原虫中血红蛋白的降解在独特细胞器中的规律过程”，Biochemistry(1990)，872931-2935一文中所述，目前有几种不同的分析法可用于监测血红蛋白被寄生虫蛋白酶降解的情况。
例如，在蛋白水解Centricon分析法中，不同浓度的酶(蛋白酶)提取物被加入到包含放射活性标记[3H]血红蛋白和柠檬酸钠缓冲液(pH＝5)的孵育混合物中，在37℃下孵育1小时后，加入冰冻的盐酸胍中止反应。置于冰上15分钟后，该混合物被加入到Centricon 10kDa的滤器中，在5000g下离心1小时，随后对滤过液进行放射活性分析。该分析法显示与时间和蛋白浓度呈线性相关。
在蛋白水解三氯乙酸(TCA)分析法中，通过测定TCA可溶性片断的产生来评估血红蛋白降解的情况。在不同的pH值下，Centricon分析中的孵育混合物和柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液同时应用。TCA沉淀在加入冰冻未标记血红蛋白及20％冰冻TCA后出现。置于冰上30分钟后，该混合物在16000g下离心15分钟，上清液进行放射活性分析。
血红蛋白的降解还可以通过SDS-PAGE分析法进行评估。人血红蛋白作为Centricon分析孵育混合物中的底物，通过加入SDS样品缓冲液并煮沸3分钟来中止反应。随后样品通过20％的SDS-PAGE处理进行银染。
上述的所有分析系统都有一个缺点，即只能进行终点分析。此外，受其特性所限，上述分析法均非常耗时。
在本领域中还发现了能对寄生虫蛋白酶的蛋白水解活性进行直接连续监测的分析法。这些分析法采用合成底物，通常是寡聚多肽或多肽类似物。这些底物被设计为能刺激特定蛋白酶(如Jeffrey Hill等在“Plasmepsin II的高表达及特征来自恶性疟原虫的一种天门冬氨酸蛋白酶”Federation of European Biochemical Societies(FEBS)Letters(1994)，352155-158一文中所阐述的Plasmepsin II。)的自然裂解位点。
同时，这种采用合成底物的分析法还具有耗时短的优点，其分析速度要快于前述以血红蛋白作为底物的分析法。但合成底物的价格昂贵，且需要高浓度的底物。另外，在相关的配体结合研究中发现，这些分析法只能使用纯配体而不能使用配体混合物。
因此，现在迫切需要开发一种能迅速而有效地检测血红蛋白降解的分析法，以血红蛋白为底物，并在使用各种配体来源时都能可靠运作。
本发明提供了一种检测血红蛋白降解的分光光度分析法，它包括
a)制备包含血红蛋白和血红蛋白降解酶酶原的混合物，pH值范围为7.5-7.6；
b)测定混合物在404-407nm波长(λ)范围的吸光率；
c)酸化混合物以激活血红蛋白降解酶；
d)孵育步骤c)的混合物；
e)测定步骤d)的混合物在404-407nm波长(λ)范围的吸光率；
f)向步骤e)的混合物中加入碱，使未降解的血红蛋白复性；
g)孵育步骤f)的混合物；
h)测定步骤g)的混合物在404-407nm波长(λ)范围的吸光率。
本分析法的原理是利用血红蛋白的光谱特性。血红蛋白的四吡咯核决定了其在400-410nm波长范围的特征性吸收带，该吸收带被称为Soret带。人血红蛋白在原始状态下的吸收波长(λ)范围为405-406nm。在本分析法的步骤a)中，血红蛋白处于原始状态。在步骤c)加入酸后，蛋白酶被转化为活化的血红蛋白降解酶，同时血红蛋白部分变性。活化后的血红蛋白降解酶开始裂解部分变性的血红蛋白，导致血红素部分的清除及405-406nm波长范围吸光率的下降。步骤f)加入碱可使未降解的血红蛋白复性(“未降解血红蛋白”是指未被血红蛋白降解酶裂解的血红蛋白)，导致405-406nm波长范围吸光率的上升。通过监测404-407nm波长范围吸光率的变化，本分析法提供了一种直接评估血红蛋白降解情况的方法。
图1阐明了原始、变性及复性状态下人血红蛋白的光谱特性。
图2阐明了Plasmepsin II介导的蛋白降解对人血红蛋白光谱特性的影响。
图3阐明了如本发明的分析法所测定的，酶抑制剂Pepstatin对Plasmepsin II的抑制作用。
在分析法步骤a)中，优先使用哺乳动物，特别是人的血红蛋白。另外，原则上蛋白酶可采用任何一种能降解哺乳动物血红蛋白的酶，包括天门冬氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶D、胰蛋白酶及糜蛋白酶，但如有可能，应优选Plasmepsin I、Plasmepsin II或Falcipain，其中PlasmepsinII是首选。
步骤a)中混合物的pH值范围是7.5-7.6。应该认识到，在此pH条件下大多数蛋白酶是稳定的，很少或没有血红蛋白降解酶活性。
在步骤c)中，混合物通过加入弱有机酸(如柠檬酸，通常是水溶液)等方法进行酸化，从而使酶原最大程度地转化为活化的血红蛋白降解酶。酸化混合物的pH值最好在4.5-5之间，4.7最佳。
在步骤d)和g)中，孵育最好在20℃-37℃下进行，时间为20-90分钟，如37℃下孵育40分钟。
步骤f)中所用之碱最好是弱有机碱，如非缓冲(unbuffered)Tris(羟甲基)氨基甲烷(aminomethane)(Tris碱)，通常是水溶液。
本发明所采用之分析法可用于筛选血红蛋白降解酶的配体，特别是抑制剂。因此，步骤a)所制备的混合物中还可包含候选配体。由于血红蛋白降解对红细胞疟原虫(如恶性疟原虫)的生长而言不可或缺，故Plasmepsin I、Plasmepsin II和Falcipain为开发抗疟药提供了很好的靶点。在这一点上，应该注意到本分析法具有易于适应机器人自动操作的优点，因此适用于大批量的筛选。
下面将通过说明性的实例对本发明进行进一步的解释。
实施例1
人血红蛋白原始、变性和复性状态下的光谱特性
将20μl人血红蛋白(Hb)溶液(5mg/ml)与180μl10mM的TrisHCl缓冲液同时加入到96孔微量滴定板(microtitre plate)的5孔中。通过SpectraMax190(美国Molecular Devices有限公司出品)分光光度计读取吸收光谱(波长范围350-550nm)，空白缓冲液作为对照。记录原始状态下血红蛋白的光谱后，向孔中加入50μl7.57mM柠檬酸。滴定板在分光光度计中摇动45秒，然后在37℃下进行孵育。孵育40分钟后读取变性血红蛋白的吸收光谱。随后向孔中加入50μl 25mM的Tris碱非缓冲溶液。在37℃下孵育40分钟后读取复性血红蛋白的吸收光谱。在本试验中记录了原始、变性及复性状态下血红蛋白溶液的吸收波长(λmax)，结果见
图1。
图1和表1均显示，原始和复性状态下Hb具有相同的吸收波长，即405-406nm。
表1
本试验清楚地阐明，人血红蛋白的变性与复性可通过分光光度计在λmax＝405-406nm下进行监测。
人血红蛋白在λmax(406nm)下的摩尔消光系数为276069.66cm- 1·M-1，反映人血红蛋白在此波长下有很强的自然吸光率。
实施例2
本发明基于Plasmepsin II的分析法
20μl人血红蛋白溶液(5mg/ml)与180μl 10mM Tris HCl(pH7.5)的缓冲液同时加入96孔微量滴定板的两组孔中(5孔/组)。通过SpectraMax190(美国Molecular Devices有限公司出品)分光光度计读取吸收光谱(波长范围350-550nm)，空白缓冲液作为对照。在此时间点，向一组孔中加入400ng(1μl)Plasmepsin II(酶原形式)，另一组孔中加入1μl缓冲液，然后向每组孔中加入50μl 7.57mM的柠檬酸。滴定板在分光光度计中摇动45秒，然后在37℃下进行孵育。孵育40分钟后读取变性血红蛋白的吸收光谱。随后向各孔中加入25mM Tris碱非缓冲溶液50μl，在37℃下孵育40分钟后读取复性血红蛋白的吸收光谱。所得结果见图2。
在图2中，406nm波长吸光率的降低是由于以下两个现象(1)酸性环境下血红蛋白的变性；(2)Plasmepsin II介导蛋白水解所致的血红蛋白降解。Plasmepsin II所致的血红蛋白降解率可由变性率与复性率之差进行推算。
为了校正此差值以反映真实的降解率，试验分别检测了有或没有Plasmepsin II情况下的血红蛋白复性率。原则上，如果血红蛋白发生降解，它与未加蛋白酶的对照组相比，将不会100％复性，这一点在表2的数据中得到证实
表2
E(-)比色杯中的复性率1.043－0.734＝0.309A＝100％
E(+)比色杯中的复性率0.574－0.463＝0.111A＝35.9％
被Plasmepsin II降解的血红蛋白＝100－35.9＝64.1％
本试验清楚地阐明，Plasmepsin II介导的血红蛋白降解是血红蛋白不能完全复性的原因之一。
实施例3
HTS分析形式
通过改良，采用96孔微量滴定板或384孔微量滴定板，例2中所述之分析法可用于Plasmepsin II抑制剂的大批量筛选(high throughputscreening，HTS)。
在96孔微量滴定板中，16孔作为适当的对照，其余80孔用于配体测试。96孔中均加入195μl包含人血红蛋白缓冲溶液(6μM，pH＝7.6)的混合物，混合物中包含或不包含酶。除0％反应对照组之外，所有的孔中都加入Plasmepsin II(8μl稀释溶液，0.4μg/孔，酶原形式)。在对照孔中，6孔不含Plasmepsin II酶原(0％反应对照)，6孔含Plasmepsin II酶原(100％反应对照)，所有12个对照孔中均含5μl二甲基亚砜(DMSO)。同时，另外4个对照孔中含5μl Pepstatin(标准抑制剂对照)。其余的80孔中分别含有5μl配体DMS0溶液。
在406nm波长读取每孔的初始吸光率(I)，然后向每孔中加入50μl 7.57mM的柠檬酸，以使反应混合物的pH值从7.6降至4.7。滴定板在37℃下孵育40分钟后，再次读取406nm波长的吸光率。随后向每孔中加入50μl 25mM的Tris碱非缓冲溶液，滴定板在37℃下再次孵育40分钟。孵育结束时读取406nm波长的最终吸光率(F)。
活性窗口(Activity Window，AW)是测量血红蛋白降解酶蛋白水解活性的一项指标，可通过以下公式求出
AW＝|平均值(I-F)0％反应对照-平均值(I-F)100％反应对照|
尽管0％反应对照(不含酶)孔和100％反应对照(含酶)孔间最终吸光率之差即可确定活性窗口，但仍需用初始吸光率来校正可能存在于0％反应对照孔和100％反应对照孔之间的初始光密度差。同时，在评估一个候选配体对血红蛋白降解酶的抑制程度(％)时，这一步骤考虑到了候选配体可能的光密度贡献。Plasmepsin II在前述条件下的活性窗口通常为0.4。
图3显示本发明分析法所测定的酶抑制剂Pepstatin对Plasmepsin II的抑制情况。
权利要求
1.一种检测血红蛋白降解的分光光度分析法，该方法包括
a)制备包含血红蛋白和血红蛋白降解酶酶原的混合物，其中混合物的pH值范围为7.5-7.6；
b)测量混合物在404-407nm波长(λ)范围的吸光率；
c)酸化混合物以激活血红蛋白降解酶；
d)孵育步骤c)的混合物；
e)测量步骤d)的混合物在404-407nm波长(λ)范围的吸光率；
f)向步骤e)的混合物中加入碱以使未降解的血红蛋白复性；
g)孵育步骤f)的混合物；
h)测量步骤g)的混合物在404-407nm波长(λ)范围的吸光率。
2.权利要求1的分析法，其中步骤a)的人血红蛋白与Plasmepsin I、Plasmepsin II或Falcipain酶原同时应用。
3.权利要求1或权利要求2的分析法，其中步骤c)加入弱有机酸以酸化混合物。
4.权利要求3的分析法，其中有机酸为柠檬酸。
5.权利要求1-4任一项的分析法，其中步骤c)酸化混合物的pH值范围为4.5-5。
6.权利要求1-5任一项的分析法，其中弱有机碱在步骤f)应用。
7.权利要求6的分析法，其中碱为Tris(羟甲基)氨基甲烷。
8.权利要求1-7任一项的分析法，其中步骤a)的混合物进一步包含候选配体。
9.权利要求8的分析法，其中候选配体为血红蛋白降解酶的抑制剂。
全文摘要
本发明提供一种检测血红蛋白降解的分光光度分析法。
文档编号C12Q1/37GK1339069SQ0080332
公开日2002年3月6日 申请日期2000年2月1日 优先权日1999年2月2日
发明者S·达塔, R·拉尼 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司