专利名称：一种提高微生物底物利用率的发酵方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程领域，具体地是利用细菌其特有的不同糖间的相互协同作用来提高细菌的底物利用率，从而提高产物生成率。
背景技术：
利用微生物进行工业大规模发酵有着悠久的历史，如利用微生物发酵产乙醇酿酒、产醋酸制食醋等。近年来，随着世界经济的高速发展，全球对能源的需要与日俱增，传统的不可再生的化石能源的日益枯竭，以可再生纤维素为碳源，利用微生物发酵产液体燃料如乙醇、丁醇等已成为发展可再生能源的一个重要方向。燃料乙醇是生物质能源中最容易实现产业化的品种之一，它作为一种新型的清洁能源，是正在使用的汽车燃料的理想替代品。目前，以纤维素为原料，利用微生物发酵产乙醇是生物能源的重要发展趋势。纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生资源之一，每年仅陆生植物就可以产生纤维素约500亿吨， 应用纤维素作为原料可以有效地避免乙醇生产和人类粮食供给的矛盾。同时，纤维素乙醇的生产和利用，并不会引起环境中(X)2总量的增加。因此，纤维素生物质已成为大规模燃料乙醇生产中极具吸引力的原料。由纤维素生物质到燃料乙醇的转化，目前有四种策略可以实现分步水解和发酵 (SHF)、同步糖化与发酵(SSF)、同步糖化与共酵解(SSCF)和联合生物加工(CBP)。其中，CBP 将纤维素酶生产、水解糖化和戊糖己糖共发酵整合在同一反应器内由同一微生物或微生物群落完成[Lynd LR, van Zyl WH,McBride JE,Laser M(2005)Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass :an update. Curr Opin Biotechnol 16 :577-583. ]> [Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH, Pretorius IS(2002)Microbial cellulose utilization fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577·]。这大大减少了工艺步骤；降低了工艺的复杂性；不需要为纤维素酶的生产或购买投入资金，因此可以大幅度降低生产成本，其被公认为是最理想的纤维素乙醇生产路线。热纤梭菌 (Clostridium thermocellum)嗜热厌氧产乙醇菌(Thermoanaerobacter)等革兰氏阳性菌由于分别具有降解纤维素和广谱的单糖发酵能力而有望应用于CBP过程。然后无论是传统的食品微生物发酵(如酿酒、制食醋以及酸奶等)，还是近年来发展的应用于CBP的微生物发酵，都面临着一个重大的瓶颈问题，即微生物的底物利用率偏低，从而严重影响了目标产物的产量[Demain AL，Newcomb M, Wu JH(2005)Cellulase, Clostridia,and ethanol. Microbiol Mol Biol Rev 69:124-154·]。目前对这一问题并没有一套有效、快速的解决方案。主要是依靠不断的从自然界中筛选具有优良表型的野生型菌株。但这一策略具有耗时长、操作繁琐、结果不确定等许多缺点，严重限制了微生物工业发酵的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高微生物底物利用率的发酵方法。
为实现上述目的，本发明提供的发酵方法，是采用微生物的不同糖间相互协同作用来提高底物利用率；其主要步骤为a)将不同糖在其细胞中具有协同作用的细菌接种于发酵培养基中进行活化；b)将活化后的细菌液接种于含不同糖的发酵培养基中发酵，以提高细菌的底物使用率；或者c)将活化后的细菌菌液转接至以单糖为底物的发酵培养基中培养至特定前期，再加入另外一种能与之相互协同的单糖进行发酵，以提高细菌的底物使用率。所述的方法，其中，步骤a所述的细菌包括嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧细 |if (Thermoanaerobium brockii)、^ M ￠11 IK H If lif (Thermoanaerobacterium xyIanoIyticum) >^m^JXM.M^W^fM (Thermoanaerobacterium polysaccharoIyticum)、 凯氏乳杆菌(Lactobacillus casei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)以及在它们基础上进行的任何突变株。所述的方法，其中，所述的发酵培养基为=CaCl2 · 2Η20 0. 08_2g/L、NH4Cl
1.0-2. Og/L、MgCl2 · 6H20 0. 2-0. 6g/L、NaCl 1. 0-10. Og/L、HEPES 7. 2-7. 4g/L、NaHCO3
2.52-3. 52g/L、L-cysteine · HCl 0. 02-0. 05g/L、微量元素溶液 0. 5-lml/L 和维他命储液 0. 5-lml/L, pH 值为 7· 0-7. 5。所述的方法，其中，所述的发酵培养基中所用的微量元素溶液每升包括25% (w/ w)盐酸 5-10ml,FeCl2 1. 2-1. 5g、CoCl2 0. 19-0. 29g,MnCl2 0. 1-0. 2g,ZnCl2 50_70mg、H3B03 3-6mg、Na2MoO4 36_56mg、NiCl2 24_48mg、CuCl2 2_4mg、Na2SeO3 4_6mg、Na2WO4 4_8mg、NaOH 0. 5-1. Og0所述的方法，其中，所述的发酵培养基中，维他命储液每500ml包括=Biotin 20. Omg> p-Aminobenzoic acid 50. Omg> Folic acid 20. Omg> Pantothenic acid calcium salt 50. Omg> Nicotinic acid 50. Omg> Vitamin B12 1. Omg、Thiamine HCl 5. Omg> Pyridoxine hydrochloride 100. Omg、Thioctic acid 50. 0mg> Riboflavin 5. Omg0所述的方法，其中，步骤b和c所述的发酵包括单一菌株纯种发酵和多菌株混合发酵。所述的方法，其中，步骤b和c所述的活化后的细菌液接种比例为体积比1 10 1 100。所述的方法，其中，发酵培养基中糖的初始浓度为40 100mM。所述的方法，其中，步骤c中再加入的单糖的初始浓度始为10 50mM。所述的方法，其中，步骤c中再加入的单糖，是于接种时加入，或待细菌生长至不晚于对数中期前加入。本发明不需经过反复菌株筛选、具有耗时短、操作简便等众多优点，并能直接应用于微生物工业发酵。本发明为改善微生物底物利用率提供了有效的解决方案和思路。
图1为嗜热厌氧乙醇杆菌(Themroanaerobacter ethanolicus)X514葡萄糖与木糖混合糖的利用及细胞生长情况。图2为利用嗜热厌氧乙醇杆菌(Themroanaerobacter ethanolicus)X514的葡萄糖及木糖相互合作的特性，通过优化加入木糖的浓度和时间来提高其乙醇产量的情况；其中A为嗜热厌氧乙醇杆菌在混合碳源条件下的生长及碳源使用情况，B、C和D为嗜热厌氧产乙醇杆菌在不同碳源组合下乙醇产量情况。
具体实施例方式本发明在前期采用基因芯片技术得到全局嗜热厌氧乙醇杆菌各种己糖、戊糖代谢的转录组数据后，利用任意矩阵理论[Luo F，Yang Y,Zhong J，Gao H, Khan L，et al. (2007) Constructing gene co-expression networks and predicting functions of unknown genes by random matrix theory. Bioinformatics 8 :299.]构建了口誉热厌氧乙酉享杆菌在不同己糖、戊糖条件下的基因共表达网络。通过对不同底物的代谢网络的分析，发现在嗜热厌氧菌细胞内己糖和戊糖具有相互协同作用，并能用于改善底物利用率。根据这一特性，提出了通过在培养的不同时期添加不同的糖源来提高微生物的底物利用率，从而提高目标产物产量的发酵方法。本发明提供的提高细菌底物利用率的发酵方法，是利用细菌其特有的不同糖间的相互协同作用来提高细菌的底物利用率，从而提高产物生成率。其主要步骤为a)将细菌接种于发酵培养基中进行活化；培养基为=CaCl2· 2Η20 0. 08_2g/L、NH4Cl 1. 0-2. Og/L、MgCl2 · 6H20 0. 2-0. 6g/ L、NaCl 1. 0-10. Og/L, HEPES 7. 2-7. 4g/L、NaHCO3 2. 52-3. 52g/L、L-cysteine · HCl 0. 02-0. 05g/L、微量元素溶液0. 5-lml/L和维他命储液0. 5-lml/L, pH值为7. 0-7. 5。b)将活化后的菌液接种于添加一定浓度的不同糖(如己糖和戊糖)的发酵培养
基中培养；或者c)将活化后的细菌菌液按一定比例转接至以单糖(如己糖)为底物的发酵培养基中培养至对数中前期后，再按比例加入一定浓度的能与前一种单糖相互协同的另外一种单糖(如戊糖)进行发酵。本发明的细菌是指不同糖在其胞内具有协同作用的微生物，如包括嗜热厌氧产 Zi If If lif (Thermoanaerobacter ethanolicus) > 1 ^m ^ BiMiMM (Thermoanaerobium brockii)、嗜热厌氧解木聚糖杆菌(Thermoanaerobacterium xyIanoIyticum)、嗜热厌氧解多Hlflii (Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)lif (Lactobacillus casei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、罗伊氏乳杆菌(LactcAacillus reuteri)等，以及在它们基础上进行的任何突变株。但不仅仅只限于上述菌株及其突变菌株。本发明的发酵方式包括单一菌株纯种发酵和多菌株混合发酵。本发明发酵培养中的菌种接种比例为1 10 1 100(体积比)。本发明的己糖和戊糖的浓度始终控制在10 50mM。本发明的方法中，戊糖可于接种时加入，也可以待细菌生长至对数生长中前期加入。
以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明利用细菌胞内不同糖间相互协同作用，通过控制在培养基中添加不同单糖的时间及浓度来提高底物利用率和产物生产率的发酵方法。实施例(以嗜热厌氧产乙醇杆菌(Themroanaerobacter ethanolicus)X514为例)1)将嗜热厌氧产乙醇杆菌接种于发酵培养基(按配方Glucose 5_15g/L、 CaCl2 · 2H20 0. 08-2g/L、NH4Cl 1. 0-2. Og/L、MgCl2 · 6H20 0. 2-0. 6g/L、NaCl 1. 0-10. Og/L、 HEPES 7. 2-7. 4g/L、NaHCO3 2. 52-3. 52g/L、L-cysteine 'HCl 0. 02-0. 05g/L、微量元素溶液 0. 5-lml/L和维他命储液0. 5-lml/L, pH值为7. 0-7. 5)中，厌氧条件下50_70°C进行活化。幻将活化好的嗜热厌氧产乙醇杆菌菌液按1 100(体积比)接种到含有50mM葡萄糖和50mM木糖的发酵培养基中，定时取样监测其生长情况和糖消耗情况。发酵结果如图 1所示，图1显示嗜热厌氧产乙醇杆菌能同时使用葡萄糖和木糖。幻将活化好的嗜热厌氧产乙醇杆菌菌液按1 100(体积比)接种到含有50mM葡萄糖和5、10、25和50mM木糖的发酵培养基中培养，检测其乙醇终产量(图2)。4)将活化好的嗜热厌氧产乙醇杆菌菌液按1 100(体积比)接种到含有50mM葡萄糖的培养基中培养至对数中前期，分别加入5、10、25和50mM木糖至发酵培养基中，继续培养，最后检测其乙醇终产量(图2)。幻将活化好的嗜热厌氧产乙醇杆菌菌液按1 100(体积比)接种到含有50mM葡萄糖的培养基中培养至对数中前期，分别加入5、10、25和50mM葡萄糖至发酵培养基中继续培养，检测其乙醇终产量(图2)。6)将活化好的嗜热厌氧产乙醇杆菌菌液按1 100(体积比)接种到含有50mM木糖的培养基中培养至对数中前期，分别加入5、10、25和50mM葡萄糖至发酵培养基中继续培养，检测其乙醇终产量(图2)。7)将活化好的嗜热厌氧乙醇杆菌菌液按1 100(体积比)接种到含有50mM木糖的培养基中培养至对数中前期，分别加入5、10、25和50mM木糖至发酵培养基中继续培养， 检测其乙醇终产量(图2)。乙醇发酵结果如图2显示。图2中，A为嗜热厌氧乙醇杆菌在混合碳源条件下的生长及碳源使用情况。B、C和D为嗜热厌氧产乙醇杆菌在不同碳源组合下乙醇产量情况。 其中“*”表示该碳源为对数中前期加入。图2中的A显示，当嗜热厌氧乙醇杆菌生长在以葡萄糖为起始碳源的培养基中，其能迅速进入对数生长期进行生长。而当嗜热厌氧乙醇杆菌在含有木糖的培养基中生长时，其稳定期相比于葡萄糖下会相对延长。图2中的B、C和 D显示首先以50mM葡萄糖为底物，在起始培养时分别加入5、10、25和50mM木糖，其乙醇产量会增加。在IOmM时乙醇产量达到饱和，其后再提高木糖浓度Q5-50mM)，乙醇产量不会显著性提高(p-value > 0. 05)，此时的乙醇产量高于以IOOmM葡萄糖为底物时的乙醇产量。在以50mM木糖为底物，在起始培养时分别加入5、10、25和50mM葡萄糖下也观察到了相似的情况。该结果表明同时加入葡萄糖和木糖能促进嗜热厌氧产乙醇杆菌的乙醇产量。其次，在以50mM葡萄糖为起始底物，将嗜热厌氧乙醇杆菌培养至对数中前期时，分别加入5、 10、25和50mM木糖，其乙醇产量会随着木糖浓度的增加而增加，在IOmM时达到最高，随后再增加木糖浓度，乙醇产量会下降。50mM葡萄糖+IOmM木糖(对数中期添加)的乙醇产量与50mM葡萄糖+10 50mM木糖的相当。另外，50mM木糖为起始底物，将嗜热厌氧产乙醇杆菌培养至对数中前期时，分别加入5、10、25和50mM葡萄糖，其乙醇产量会随着葡萄糖糖浓度的增加而增加，在IOmM时达到最高，随后再增加木糖浓度，乙醇产量会下降。但是50mM木糖+IOmM葡萄糖(对数中期添加)的乙醇产量要显著性低于50mM木糖+10 50mM葡萄糖的。同时，它也低于50mM葡萄糖+IOmM木糖(对数中期添加)。该结果不仅表明了葡萄糖和木糖能用来提高乙醇产量，更表明了葡萄糖和木糖的合作方式。葡萄糖能迅速启动细胞的生长，而木糖则延长细胞的稳定期，两者相互作用来提高乙醇产量。附件微量元素溶液(IL)包括25% (w/w)盐酸 5-lOml、FeCl2 1. 2-1. 5g、CoCl2 0. 19-0. 29g、MnCl2 0. 1-0. 2g、ZnCl2 50_70mg、H3BO3 3_6mg、Na2MoO4 36_56mg、NiCl2 24-48mg、CuCl2 2_4mg、Na2SeO3 4_6mg、Na2WO4 4_8mg、NaOH 0. 5_L Og0维他命储液(500ml)包括Biotin 20. Omg^p-Aminobenzoic acid 50. Omg,Folic acid 20. 0mg>Pantothenic acid calcium salt 50. Omg、Nicotinic acid 50. Omg、Vitamin B12 1. Omg> Thiamine HCl 5. Omg> Pyridoxine hydrochloride 100. Omg> Thioctic acid 50. Omg> Riboflavin 5. Omg0以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本领域技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围应以权利要求的范围进行界定。
权利要求
1.一种提高微生物底物利用率的发酵方法，其特征是采用微生物的不同糖间相互协同作用来提高底物利用率；其主要步骤为a)将不同糖在其细胞中具有协同作用的细菌接种于发酵培养基中进行活化；b)将活化后的细菌液接种于含一种或几种不同单糖的发酵培养基中发酵，以提高细菌的底物使用率；或者c)将活化后的细菌菌液转接至以单糖为底物的发酵培养基中培养至特定前期，再加入另外一种能与之相互协同的单糖进行发酵，以提高细菌的底物使用率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤a所述的细菌包括嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧细 |if (Thermoanaerobium brockii)、^ M ￠11 IK H If lif (Thermoanaerobacterium xyIanoIyticum) > ^m^JXM.M^W^fM (Thermoanaerobacterium polysaccharoIyticum)、 凯氏乳杆菌(Lactobacillus casei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)以及在它们基础上进行的任何突变株。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的发酵培养基为=CaCl2·2Η20 0. 08_2g/ L、NH4Cl 1. 0-2. Og/L、MgCl2 · 6H20 0. 2-0. 6g/L、NaCl 1. 0-10. Og/L、HEPES 7. 2-7. 4g/L、 NaHCO3 2. 52-3. 52g/L、L-cysteine · HCl 0. 02-0. 05g/L、微量元素溶液 0. 5-lml/L 和维他命储液 0. 5-lml/L, pH 值为 7. 0-7. 5。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述的发酵培养基中所用的微量元素溶液每升包括25% (w/w)盐酸 5-10ml、FeCl2 1. 2-1. 5g、CoCl2 0. 19-0. 29g、MnCl2 0. 1-0. 2g、 ZnCl2 50-70mg、H3BO3 3_6mg、Na2MoO4 36_56mg、NiCl2 24_48mg、CuCl2 2_4mg、Na2SeO3 4-6mg、Na2WO4 4_8mg、NaOH 0. 5-1. Og0
5.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述的发酵培养基中，维他命储液每500ml 包括Biotin 20. Omg、p-Aminobenzoic acid 50. Omg、Folic acid 20. Omg、Pantothenic acid calcium salt 50. Omg、Nicotinic acid 50. Omg、Vitamin B12 1. Omg、Thiamine HCl 5. Omg、Pyridoxine hydrochloride 100. Omg、Thioctic acid 50. Omg、Riboflavin 5. Omg0
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b和c所述的发酵包括单一菌株纯种发酵和多菌株混合发酵。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b和c所述的活化后的细菌液接种比例为体积比 1 10 1 100。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的发酵培养基中，糖的初始浓度为40 IOOmM0
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤c中再加入的单糖的初始浓度始为10 50mM。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其中，步骤c中再加入的单糖是于接种时加入，或待细菌生长至对数中期前加入。
全文摘要
一种提高微生物底物利用率的发酵方法，其主要步骤为a)将不同糖在其细胞中具有协同作用的细菌接种于发酵培养基中进行活化；b)将活化后的细菌液接种于含不同糖的发酵培养基中发酵，以提高细菌的底物使用率；或者c)将活化后的细菌菌液转接至以单糖为底物的发酵培养基中培养至特定前期，再加入另外一种能与之相互协同的单糖进行发酵，以提高细菌的底物使用率。本发明通过在其培养的不同阶段添加不同比例的不同单糖，提高微生物的底物利用率。本发明能够不经过物理或化学的方法，而是直接通过调整不同糖间的添加比例和添加时间来优化微生物的底物利用率。
文档编号C12R1/01GK102286598SQ201110182889
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者宋厚辉, 徐健, 林璐, 秦勇 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所