专利名称：条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域中的鱼类分子标记和遗传性别鉴定技术，尤其涉及一种条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法。
背景技术：
我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在性别差异，如，罗非鱼、鲤鱼、牙鲆、半滑舌鳎等鱼类。因此，开展这些鱼类性别相关基因及性别特异分子标记的研究具有很高的理论指导意义。条石鲷隶属于鲈形目(Perciformes)、石鲷科 (Oplegnathidae)、石鲷属(Oplegnathus)，自然分布于太平洋和印度洋沿岸，我国产于黄海、东海和台湾海峡，是一种暖温性海洋中下层鱼类。它生长速度快、肉质鲜美、抗病力强、 色泽艳丽，具有较高的食用价值和观赏价值。尤其是近年来，条石鲷的人工繁育获得成功， 其养殖也迅速在我国开展起来。在人工繁育及选择育种过程中，为了获得优质的苗种必须做好亲鱼选择的雌雄筛选。条石鲷第一次性成熟需要3 4年，在幼苗时期无法通过外观形态辨别其性别特征。因此，建立一种性别的快速鉴定方法用于幼苗的性别鉴定，不仅对于研究条石鲷的性别决定机制具有很高的理论价值，而且对于其定向选择育种具有重要的指
眉、οAFLP技术是可以快速筛选性状相关分子标记的有效方法，应用AFLP技术在某些动物的基因组中寻找性别标记已有成功报道。英国Mirling大学的肚拟等Q004)用AFLP 技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(0niY425、0niY382、0niY227)和一个 X染色体连锁(0niX420)的AFLP标记，其中0niX420和0niY425证明为等位基因，然而这些标记却不能鉴别没有亲缘关系的个体的性别，达不到鉴定罗非鱼遗传性别的水平。在虹鳟中，Felip等(2005)利用AFLP技术筛选到15个性别相关标记，其中，Omy-163为Y染色体连锁的标记，将其转化为SCAR标记，建立了虹鳟的遗传性别快速鉴定方法。国内学者Chen 等Q007)利用AFLP技术在半滑舌鳎中筛选到7个雌性特异的标记，将其中的5个转化为 SCAR标记，建立快速鉴定其遗传性别的PCR方法。由于不同鱼类之间存在着很大差异，一种鱼类的性别特异分子标记不能在另一种鱼类上应用，因此必须建立不同鱼类各自的性别特异分子标记。有关条石鲷性别特异分子标记及遗传性别检测技术，目前国内外均未见报道。
发明内容
针对现有技术中不易鉴定条石鲷幼鱼的缺陷，本发明提供了一种条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法，本发明筛选出了条石鲷性别特异分子标记，并在此特异分子标记基础上建立了遗传性别鉴定方法，为条石鲷的定向育种提供理论和技术上的指导。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现本发明提供了 4个条石鲷性别特异AFLP分子标记，所述分子标记的引物序列如下
(1)5， -GACTGCGTACCAATTCACA-3，；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’，用所述引物序列扩增出特异AFLP标记经克隆测序如SEQ ID NO=I所示。(2)5' -GACTGCGTACCAATTCAGA-3'；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACTT-3’，用所述引物序列扩增出特异AFLP标记经克隆测序如SEQ ID NO 2所示。(3)5' -GACTGCGTACCAATTCATC-3'；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’，用所述引物序列扩增出特异AFLP标记经克隆测序如SEQ ID NO 3所示。(4)5， -GACTGCGTACCAATTCATG-3，；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACTT-3’。用所述引物序列扩增出特异AFLP标记经克隆测序如SEQ ID NO 4所示。本发明还提供了 SCAR分子标记，根据SEQ ID NO :1序列设计引物进行PCR扩增获得，其引物序列为Op 1240-1 :5，AGACCAAGATCAGGAGCGAAT3，；Op 1240-2 :5，GGAGCATCCCATCCATTCT3，。用所述引物在雄鱼基因组中扩增出MObp的DNA条带，在雌鱼基因组中没有扩增条带。本发明还提供了一种用所述条石鲷性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，它包括以下步骤(1)采集待测的条石鲷的基因组DNA ；(2)用所述SCAR标记的引物对条石鲷基因组DNA进行PCR扩增，扩增得到240bp 的条带所对应的为雄性个体，没有扩增条带所对应的为雌性个体。对技术方案的进一步改进所述步骤(1)中采集条石鲷的鳍条提取基因组DNA。对技术方案的进一步改进所述步骤(1)中所述的基因组DNA的浓度为50 200ng/y L，基因组DNA的纯度要求0拟60/0D280值为1. 76 1. 80。对技术方案的进一步改进所述步骤O)中的PCR反应的体系为DNA模板50 200ng,上下游引物浓度 0. 4 μ M，dNTP 浓度为 0. ImM, 1 X PCRbuffer,MgCl2 浓度为 1. 5mM, Taq 酶1. 25U，补充双蒸水至终体积25 μ L0对技术方案的进一步改进所述步骤( 中的PCR扩增程序为94°C预变性5min， 94°C变性30S，56°C退火30s，72°C延伸60s，共；35个循环，最后72°C延伸lOmin。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是(1)本发明采用AFLP方法首次筛选到条石鲷性别特异的分子标记，并将其转化为 SCAR标记，建立条石鲷遗传性别的鉴定方法，本发明所述分子标记可以无损伤地鉴别条石鲷的遗传性别。(2)本发明所提供的遗传性别鉴定方法具有准确、灵敏、可靠等优点，不仅对鱼类性别机制研究具有重要的科学价值，而且为鱼类性别控制和选择育种具有重要的意义和应用价值。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清林疋。
图1是引物组合E35M50产生的雄性特异条带0pl286，其中1 15为雌性个体， 16 30为雄性个体。图2是引物组合E39M62产生的雄性特异条带0pl237，其中1 18为雌性个体， 19 38为雄性个体。图3是引物组合E44M58产生的雄性特异条带0pl423，其中1 20为雌性个体， 21 40为雄性个体。图4是引物组合E45M62产生的雄性特异条带0pl2^，其中1 13为雌性个体， 14 沈为雄性个体。图5是引物0pl240_l和0pl240_2在雌性个体和雄性个体基因组中的PCR扩增结果，其中1-9为雌性个体，10-18为雄性个体，M为DL2000marker。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1下面本发明对条石鲷性别特异AFLP分子标记的筛选及遗传性别鉴定方法的建立进行详细说明。筛选条石鲷的性别特异分子标记并建立遗传性别快速鉴定方法的技术方案具体包括条石鲷性别特异分子标记的筛选，性别特异分子标记的序列分析，条石鲷遗传性别鉴定方法的建立。以下对本发明的技术方案作更进一步的阐述。—、条石鲷性别特异分子标记的筛选包括1、提取条石鲷鳍条的基因组DNA，2、基因组DNA的AFLP分析，3、雄性特异分子标记的筛选。1、提取条石鲷鳍条的基因组DNA选择条石鲷成鱼，解剖根据性腺形态辨别雌雄，雄鱼的精巢呈细带状、淡红色，而雌鱼的卵巢呈扁带状，肉红色，很容易进行辨别。剪取20 30mg的条石鲷鳍条，并将其剪碎，然后加入350 μ L的组织裂解液，在裂解液中加入10%的十二烷基硫酸钠(SDQ 40 μ L、 蛋白酶K(20mg/mL)8y L和核酸酶QOmg/mL)4 μ L，放在56°C的水浴锅中消化，一般需要消化2 池；取出离心管低速离心去除管壁水珠，然后加入300 μ L的6mol/L的NaCl溶液，震荡混勻，室温12000r/min离心20 30min，移上清夜至新的离心管中；在上清液中加入等体积的异丙醇(约700μυ，轻轻混勻，置于-20°C中2 3h，室温12000r/min离心15min， 弃去上清液；加入70%的乙醇于离心管中，混勻漂洗沉淀一次，然后室温12000r/min离心 lOmin，弃去上清液；室温下使乙醇挥发，自然干燥；用适当体积(30 50 μ L)的双蒸水或者TE缓冲液(ρΗ8. 0)溶解DNA，将DNA保存在_20°C备用。基因组DNA的浓度应不低于 50ng/y L，基因组DNA的纯度要求O拟60/0D280值为1. 76 1. 80。2、基因组DNA的AFLP分析
基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤(1)对基因组DNA模板进行酶切；(2) 将特异接头连接到酶切片段上；C3)进行PCR预扩增；(4)进行PCR选择性扩增；( 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。(1)对基因组DNA模板进行酶切用1. 25U/ μ L EcoRI/Msel 酶混合物 37 °C 过夜消化 IOOng 400ng 模板 DNA6 8h，再用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于65°C孵育 15min灭火限制性内切酶。(2)将特异接头连接到酶切片段上向上面的酶切反应混合液中加入12. 0 μ L接头混合物和1. 5U T4DNA连接酶，20°C 孵育12 20h保证接头充分连接，然后放置_20°C中保存。接头混合物的序列如下Eadaptorl :CTC GTA GAC TGC GTA CC ；Eadaptor2 :AAT TGG TAC GCA GTC TAC ；Madaptorl :GAC GAT GAG TCC TGA G ；Madaptor2 :TAC TCA GGA CTC AT。(3)进行PCR预扩增将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；预扩增引物的3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)。PCR反应条件为94°C变性40s ；56°C退火40s ；72°C延伸Imin。 30个循环后，72°C延伸10min，4°C保存待用。预扩增引物的序列如下EcoRIOI 5' -GAC TGC GTA CCA ATT C-3'；MseI02 5' -GAT GAG TCC TGA GTA A-3'。(4)进行PCR选择性扩增将预扩增产物稀释30 50倍，作为选择性扩增的模板。用含酶切位点MseI的引物和含酶切位点EcoRI的引物进行扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基。PCR反应分为三步第一步进行1个循环94°C变性40s ；65°C退火40s ；72°C延伸Imin ；第二步进行12个循环94°C变性40s ；65-56°C退火40s ；72°C延伸Imin ；第三步进行25个循环94°C 变性40s ；56°C退火40s ；72°C延伸lmin。扩增产物加入适量的上样液，94°C变性5min，立即置于冰上。总共用了 144对引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94°C变性后用6% 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。(5)电泳分析将变性好的扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件电压1200V， 功率50W，电流50mA，温度45°C，时间1.证。总共用了 144对引物组合对20个条石鲷雄性个体和20个条石鲷雌性个体的基因组DNA进行了 AFLP分析，然后对电泳后产生的DNA条带图谱进行观察，照相和分析，筛选出特异片段的引物组合4个，这4个引物组合共产生了 4条雄性特异的AFLP标记。3、雄性特异分子标记的筛选总共用144对引物组合对20个条石鲷雌性个体和20个条石鲷雄性个体的基因组 DNA进行了 AFLP-PCR扩增，这些引物组合的序列如下
权利要求
1.条石鲷性别特异AFLP分子标记，其特征在于所述分子标记的引物序列如下 5' - GACTGCGTACCAATTCACA -3'；5’- GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’，用所述引物序列扩增出的特异AFLP标记经克隆测序为如SEQ ID NO: 1所示的DNA片段。
2.条石鲷性别特异AFLP分子标记，其特征在于所述分子标记的引物序列如下 5’ -GACTGCGTACCAATTCAGA -3’ ；5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3’，用所述引物序列扩增出的特异AFLP标记经克隆测序为如SEQ ID NO: 2所示的DNA片段。
3.条石鲷性别特异AFLP分子标记，其特征在于所述分子标记的引物序列如下 5' -GACTGCGTACCAATTCATC -3'；5’ -GATGAGTCCTGAGTAACGT -3’，用所述引物序列扩增出的特异AFLP标记经克隆测序为如SEQ ID NO: 3所示的DNA片段。
4.条石鲷性别特异AFLP分子标记，其特征在于所述分子标记的引物序列如下 5' -GACTGCGTACCAATTCATG -3'；5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3’，用所述引物序列扩增出的特异AFLP标记经克隆测序为如SEQ ID N0:4所示的DNA片段。
5.条石鲷性别特异SCAR分子标记，其特征在于所述分子标记根据SEQID NO: 1序列设计引物进行PCR扩增获得，其引物序列为0pl240-l: 5’ AGACCAAGATCAGGAGCGAAT3’ ； Op1240-2: 5 ’ GGAGCATCCCATCCATTCT3’，用所述引物在雄鱼基因组中扩增出240bp的DNA条带，在雌鱼基因组中没有扩增条带。
6.一种根据权利要求5所述的条石鲷性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，其特征在于它包括以下步骤(1)采集待测的条石鲷的基因组DNA；(2)用所述SCAR标记的引物对条石鲷基因组DNA进行PCR扩增，扩增得到240bp的条带所对应的为雄性个体，没有扩增条带所对应的为雌性个体。
7.根据权利要求6所述的一种条石鲷性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，其特征在于所述步骤(1)中采集条石鲷的鳍条提取基因组DNA。
8.根据权利要求6所述的一种条石鲷性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，其特征在于所述步骤(1)中所述的基因组DNA的浓度为50 200ng/^L，基因组DNA的纯度要求 0D260/0D280 值为 1. 76 1. 80。
9.根据权利要求6所述的一种条石鲷性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，其特征在于所述步骤O)中的PCR反应的体系为DNA模板50 200ng，上下游引物浓度0. 4μΜ， dNTP浓度为0. ImM, IXPCRbuffer,MgCl2浓度为1.5mM, Taq酶1. 25U，补充双蒸水至终体积 25μ 。
10.根据权利要求6所述的一种条石鲷性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR扩增程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸60s，共35个循环，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本发明提供了一种条石鲷性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法，它包括雄性特异AFLP标记的筛选和克隆，性别特异的DNA序列分析，遗传性别PCR鉴定方法的建立。本发明从144对引物组合中筛选到4个引物组合能够产生4个雄性特异AFLP标记，将这些AFLP标记克隆测序，筛选到了一个SCAR分子标记，建立了条石鲷遗传性别鉴定的PCR方法。本发明采用AFLP方法首次筛选到条石鲷性别特异的分子标记，并将其转化为SCAR标记，建立条石鲷遗传性别的鉴定方法；所述遗传性别鉴定方法具有准确、灵敏、可靠等优点，不仅对鱼类性别机制研究具有重要的科学价值，而且为鱼类性别控制和选择育种具有重要的意义和应用价值。
文档编号C12N15/11GK102286479SQ20111022837
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者付万东, 史会来, 徐冬冬, 李三磊, 楼宝, 毛国民, 耿智 申请人:浙江省海洋水产研究所