Msh3的表达状态决定癌细胞对使用parp抑制剂和铂药物的化学疗法治疗的响应性的制作方法

专利名称：Msh3的表达状态决定癌细胞对使用parp抑制剂和铂药物的化学疗法治疗的响应性的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及癌症的检测、诊断和治疗领域，并且更具体地涉及结肠直肠癌细胞对于DNA损伤剂的敏感性。
背景技术：
在不限制本发明的范围的前提下，其背景结合用于结肠和胃肠癌症检测的生物标记物进行描述。授权给Pant等人的第7，252，955号美国专利公开了用于结肠癌筛查的免疫检测和试剂盒。从保持了免疫原性的单个样品中提取了粪便糖蛋白。将经纯化的粪便糖蛋白与结肠和卵巢肿瘤抗原(COTA)的抗体进行反应。黏液素抗原COTA特异性地存在于结肠直肠的癌组织中，而不存在于正常的结肠中。测定粪便样品中的COTA的含量，并且该含量用于指示结肠癌的存在与否。授权给Liu等人的第7，575，928号美国专利公开了用于诊断结肠直肠癌的基因。简单地说，本发明通过以下的步骤搜索基因序列，提供了用于诊断结肠直肠癌的基因(1)从正常的肠、肠息肉和结肠直肠的癌组织中得到上皮细胞；(2)通过高度差异基因表达收集基因并且建立文库，所述的高度差异基因表达通过抑制消减杂交(SSH)进行；
(3)从癌组织中得到具有相对高的信号强度的群落；(4)通过RNA印迹杂交(NorthernHybridization)收集更多的癌组织,通过实时聚合酶链式反应(PCT)结合生物信息学的分析确认差异基因表达之间的变化；并且(5)从所述的文库中选择最适用的基因，并且将所述的基因序列用作试剂提供早期诊断，专一性、高度敏感性及安全性的效果。授权给Robbins等人的第7，022，472号美国专利公开了在诊断结肠直肠癌中有用的人类MLHl和人类MSH2基因的突变。也提供了简单地说，发现人类MLHl和MSH2基因的变体可以用于诊断遗传性非息肉病性结肠直肠癌(HNPCC)和/或测定患者对于发生HNPCC的易感性。还提供了用于鉴定MSH2基因的新变体MLHl的方法和组合物。除此之外，提供了包含这些变体基因的遗传性非息肉病性结肠直肠癌的试验模型。最终，由Baker等人递交的第20090305277号美国专利公开描述了基于确定至少一个基因的表达水平，预测被诊断患有癌症的人类患者的可能性的方法，所述的基因选自AURKB、Axin 2、B1K、BRAF、BRCA2、BUB1、C20 orfl、C200RF126、CASP9、CCNE2 变体 1、CDC2、CDC4、CENPA、CENPF、CLICI、CYR61、Cdx2、ChkI、DLCI、DUSPI、E2FI、EGR3、E124、ESPLI、FBX05、 FGF2、FOS、FUT6、GSK3B、GrblO、HES6、HLA-G、HNRPAB, H0XB13、HSPEl、KIF22、KIFCl、KLRKl、Ki-67、LAT、LMYC、MAD2L1、MSH2、MSH3、NR4A1、PDGFA、PRDX2、RAB32、RAD54L、RANBP2、RCCl、R0CK2、RhoB, S100P、SAT、SODl、SOSl、STK15、TCF-U T0P2A、TP53BP1、UBE2C、VCP 和 cMYC,或者其相应的表达，其中一个或者多个上述基因的表达增加与对化学治疗的阳性响应的可能性增加呈正相关。

发明内容
关于MSH3的表达水平在评价预后和/或预测结肠直肠癌的癌细胞对化疗的响应性方面，本发明人在此证明了与之前的发现具有显著的和新的区别。在一个实施方案中，本发明提供了治疗存在患一种或多种腺癌的风险，或者诊断患有一种或多种腺癌的患者的方法，所述的方法包括在得自患者的怀疑为腺癌细胞的细胞内测定MSH3的总体表达，并且预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂治疗的疗效，其中与正常细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明对抗肿瘤剂治疗的响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的抗肿瘤剂给予患者。在上文中所描述的腺癌选自结直肠癌(CRC)、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。在更具体的方面，所述的腺癌是CRC并且所述的腺 癌包括实体瘤。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达、MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。在另一个方面，测定MSH3总体表达水平的步骤包括将得自个体的MSH3核酸进行质谱分析。在再一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将从个体得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括免疫组织化学。在相关的方面，所述的抗肿瘤剂选自1，3_ 二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、马法兰、丝裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和电离辐射。在一个方面，所述的抗肿瘤剂是链间交联剂。在另一个方面，所述的抗肿瘤剂是选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素的链间交联剂。在再一个方面，所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，该抑制剂选自奥拉帕尼(olaparib)、异卩引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。本发明的另一个实施方案提供了治疗具有腺癌的风险或者诊断患有腺癌的患者的方法，所述的方法包括(I)在得自患者的怀疑为腺癌细胞的细胞中，测定MSH3的总体表达；并且(2)预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂治疗的疗效，其中与正常细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明对抗肿瘤剂治疗的响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的抗肿瘤剂给予患者。在一个方面，所述的腺癌选自结直肠癌(CRC)、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。在另一个方面，所述的腺癌是CRC。在再一个方面，所述的腺癌包括实体瘤。如前文所述的测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑为腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达，MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。在一个方面，所述测定MSH3总体表达水平的步骤包括将得自个体的MSH3核酸进行质谱分析。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将从个体得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在再一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括免疫组织化学。
在一个方面，所述的抗肿瘤剂选自1，3_ 二(2-氯乙基)-1_亚硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、马法兰、丝裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和电离辐射。在另一个方面，所述的抗肿瘤剂是链间交联剂。在另一个方面，所述的抗肿瘤剂是选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素的链间交联剂。在再一个方面，所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，该抑制剂选自奥拉帕尼、异11引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。在再一个实施方案中，本发明公开了了治疗具有结肠直肠癌的风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者的方法，所述的方法包括在得自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞内测定MSH3的总体表达，并且预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂治疗的疗效，其中与正常结肠直肠癌细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明对抗肿瘤剂治疗的响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的抗肿瘤剂治疗给予患者。在一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是结肠直肠癌的组织样品的MSH3蛋白表达。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是结肠直肠癌的组织样品的MSH3核酸表达。在再一个方面，测定MSH3总体表达水平的步骤包括将得自个体的MSH3核酸进行质谱分析。在再一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将从个体得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括免疫组织化学。在一个方面，所述的抗肿瘤剂选自1，3_ 二(2-氯乙基)-1_亚硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、马法兰、丝裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和电离辐射。在具体方面，所述的抗肿瘤剂是链间交联剂。在另一个方面，所述的抗肿瘤剂是选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素的链间交联齐 。在再一个方面，所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，该抑制剂选自奥拉帕尼、异R引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4_甲氧基-咔唑的衍生物。本发明进一步提供了为具有结肠直肠癌风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者选择癌症治疗的方法，所述的方法包括测定患者的MSH3的总体表达水平，并且预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂治疗的疗效，其中MSH3的总体表达水平的降低表明DNA交联剂对于患者而言是适合的治疗。在一个方面中，测定MSH3总体表达水平的步骤包括分析怀疑是结肠直肠癌的组织样品的MSH3蛋白表达。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是结肠直肠癌的组织样品的MSH3核酸表达。在再一个方面，测定MSH3总体表达水平的步骤包括将得自个体的MSH3核酸进行质谱分析。在以上所描述的方法的又一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将从个体得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在所述方法的相关的方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者免疫组织化学法。在所述方法的一个具体的方面，所述的抗肿瘤剂是链间交联剂。在另一个方面，所述的抗肿瘤剂选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素的链间交联剂。在另一个方面，所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，该抑制剂选自奥拉帕尼、异口引哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。本文公开的另一个实施方案涉及将患者分类到癌症治疗的临床试验的亚组中的方法，所述的方法包括在得自患者的怀疑为癌细胞的细胞内测定MSH3的总体表达，并且预测使用用于治疗患者的候选药物治疗的疗效，其中与正常细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明对候选药物治疗的响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的候选药物给予患者，并且MSH3的表达水平使得能将患者分类到临床试验的亚组中。在一个方面，癌细胞选自结直肠癌(CRC)、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、 肾癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。在具体方面，所述的癌细胞是结直肠癌细胞并且所述的癌细胞位于实体瘤内。在所述方法的一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是结肠直肠癌的组织样品的MSH3蛋白表达、MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达都分析。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将得自个体的MSH3核酸进行质谱分析。在再一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将从个体得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在又一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括使用等位基因特异性探针或者抗体探针进行杂交。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括免疫组织化学。在一个相关的方面，候选剂是基因毒性剂或者聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂。在再一个实施方案中，本发明描述了通过包括以下步骤的方法将患者分类到结肠直肠癌的亚组中的步骤，所述的方法包括步骤在得自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞内测定MSH3的总体表达，并且预测结肠直肠癌的阶段，其中与正常的结肠直肠癌细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明疾病的进展。在前文所公开的分组方法的一个方面，疾病进展和MSH3表达的减少表明结肠直肠癌对抗肿瘤剂治疗的倾向。本发明还公开了治疗具有结肠直肠癌的风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者的方法，所述的方法包括以下步骤(i)在得自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞中测定MSH3的总体表达，其表明了对于采用一种或者多种DNA交联剂治疗的响应性的倾向；并且( )测定患者中MSH3总体表达的持续的降低，并且(iii)给予治疗上有效量的DNA交联齐U，所述的DNA交联剂的量足以消除MSH3表达降低的结肠直肠癌细胞。在一个实施方案中，本发明涉及进行临床试验从而评价候选药物的方法，所述的候选药物据信在治疗与MSH3基因表达相关的疾病状态中有用，所述的方法包括a)从来自一组患者中怀疑具有结肠直肠癌的组织中测定MSH3的表达水平；b)将候选的药物给予第一亚组的患者，并将安慰剂给予第二亚组的患者，c)在给予所述的候选的药物或者安慰剂的给予之后，重复步骤a)，并且d)测定所述的候选药物是否减少了结肠直肠癌的细胞的数量，所述的细胞具有降低的MSH3表达，该降低与第二个亚组的患者中所发生的任何降低相比具有统计学上的显著性，其中统计学上的显著性降低表明所述的候选药物在治疗所述的疾病状态中是有用的。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测哺乳动物的结肠直肠癌对于DNA损伤剂是否很可能具有抗性或者是有响应的方法，所述的DNA损伤剂用于结肠直肠癌的治疗，该方法包括以下步骤(或多个步骤)在来自该癌症的生物样品中检测MSH3的总体表达的下降，并将该结肠直肠癌鉴定为对该DNA损伤剂具有增强的感受性，其中在对该DNA损伤剂有响应的癌症中，相对于同样的生物标记物的表达或者活性水平，MSH3的表达或者活性降低。
在再一个实施方案中，本发明公开了用于结肠直肠癌疾病进展的生物标记物，其中所述的生物标记物是MSH3，并且与正常的结肠直肠癌细胞，或者在更早的时间点得自同一患者的结肠直肠癌细胞相比，从患者中得到的结肠直肠癌细胞内MSH3的总体表达的减少意味着结肠直肠癌疾病的进展。在一个方面，所述MSH3的总体表达水平包括分析怀疑为结肠直肠癌的组织样品的MSH3蛋白的表达。在另一个方面，MSH3的总体表达水平包括分析怀疑为结肠直肠癌的组织样品的MSH3核酸的表达。在另一个方面，MSH3的总体表达水平包括将得自个体的MSH3核酸进行质谱分析。在再一个方面，MSH3的总体表达水平包括将从个体得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在另一个方面，MSH3的总体表达水平包括使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交。本发明还描述了用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，所述的试剂盒包括用于测定MSH3的差异表达水平的生物标记物检测试剂和针对其在诊断结肠直肠癌风险中的应用的说明。在一个方面，与正常的受试者相比，在来自存在结肠直肠癌风险的患者的样品中，MSH3mRNA和蛋白质表达水平均显著降低。在另一个方面，与正常的受试者相比，在具有结肠直肠癌风险的患者中，MSH3mRNA表达水平降低。在再一个方面，与正常的受试者相比，在具有结肠直肠癌风险的患者中，MSH3蛋白质表达水平降低。最后，本发明提供了用于在人类受试者中，诊断或者检测结肠直肠癌进展的方法，该方法包括步骤(i)鉴定怀疑患有结肠直肠癌的人类受试者，(ii)从该受试者得到一个或多个的生物样品，其中所述的生物样品选自组织样品、粪便样品、细胞匀浆和包含一种或更多种生物流体，(iii)在来自受试者的生物样品的一个或者多个细胞中，测量MSH3的总体表达特征，并且(iv)将来自怀疑患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中的MSH3总体表达特征与来自正常的受试者的生物样品的MSH3的总体表达特征进行比较，其中所述正常的受试者是未患有结肠直肠癌的健康受试者，其中在受试者的生物样品中，MSH3的总体表达特征的下降意味着存在结肠直肠癌、具有发生结肠直肠癌的风险或者同时存在结肠直肠癌和具有发生结肠直肠癌的风险。在前文所公开的诊断方法的一个方面，MSH3mRNA、MSH3蛋白质或者MSH3mRNA和MSH3蛋白质两者表达水平的显著下降预示着存在侵袭性结肠直肠癌、具有发生侵袭性结肠直肠癌的风险或者同时存在侵袭性结肠直肠癌和具有发生侵袭性结肠直肠癌的风险。在另一个方面，测定MSH3的总体水平的步骤包括分析来自生物样品中的一个或多个细胞的MSH3核酸表达。在另一个方面，测定MSH3总体表达水平的步骤包括将得自受试者的MSH3核酸进行质谱分析。在再一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括将从受试者得到的MSH3核酸的一部分进行滚环扩增。在一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交。在另一个方面，测定MSH3的总体表达水平的步骤包括免疫组织化学。在再一个方面，该方法用于治疗有结肠直肠癌的风险或者患有结肠直肠癌的患者，用于选择具有结肠直肠癌的风险或者患有结肠直肠癌的患者的DNA交联剂治疗，用于将患者分类为结肠直肠癌的亚组中或者用于结肠直肠癌治疗临床试验，用于确定对结肠直肠癌治疗具有抗性或者响应性，用于开发用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，或者它们的任何组合。


为了更完全地理解本发明的特征和优点，现参考本发明的详述以及所附的图，其中图I显示了在由MSH3shRNA稳定地感染的得自HCTl 16+3+5的克隆中，MSH3的表达受到tet-off系统的控制(1A)在HCTl 16、HCTl 16+3、HCTl 16+3+5以及三个得自HCTl 16+3+5的克隆、GU G2和G5细胞中MSH3，MLHl和β -肌动蛋白的蛋白质印迹分析；(IB)在此1116+3+5、61、62和65细胞中，1013以及β -肌动蛋白的蛋白质印迹分析，其中所述的细胞在具有和不具有I μ g/ml的强力霉素的培养基中培养。按照密度计量学计算相关的MSH3表达，并且结果得自三次或更多次的独立研究。图2显示了与富含MSH3的细胞(MSH3_prof icient cell)相比，缺乏MSH3的细胞对于顺钼和奥沙利钼更为敏感(2A)使用顺钼处理的HCT116、HCT116+3、HCT116+3+5和G5细胞的无性系存活部分，(2B)使用含有或者不含I μ g/ml的强力霉素的培养基培养的G5细胞的无性系存活部分，该细胞使用顺钼处理，(2C)使用奥沙利钼处理的HCT116、HCT116+3、HCTl 16+3+5和G5细胞的无性系存活部分，(2D)使用含有或者不含I μ g/ml的强力霉素的培养基培养的Gl、G2和G5细胞的无性系存活部分，该细胞也使用奥沙利钼进行处理，(2E)S期的群体的减少，以及(2F) HCTl 16+3+5和Gl细胞的sub_Gl群体的增加，(2G)与未经处理的对照相比，相对的BrdU掺入的减少，以及(2H)在HCT116+3+5和G5细胞的免疫荧光中显示出的抗-活性半胱天冬酶3阳性细胞的增加。将数据表示为来自三个或者更多个独立的研究的平均值土平均值的标准误(SE)。统计上的差异按照双侧Student t检测确定(two-sided Student’ s t test)。星号 *、** 和 *** 分别代表 p < O. 05、p < O. 01 和 p< 0.001。NS代表P = O. 05或者P > 0.05。在此图中显示了来自三个缺乏MSH3的克隆之一的代表性数据。图3显示了 siRNA导致的MSH3的短暂耗尽也使得HCT116+3+5细胞对顺钼和奥沙利钼敏感(3A)通过短暂的siRNA转染得到的MSH3耗尽的HCT116+3+5细胞中MSH3和β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析。在使用非靶向(对照)siRNA和使用MSH siRNA转染之后，使用顺钼(3Β)以及奥沙利钼(3C)处理的HCT116+3+5细胞系的无性系存活部分的比较。在siRNA转染72小时之后提取细胞。在使用对照siRNA和MSH3siRNA进行转染之后，使用顺钼(3E)和奥沙利钼(3F)处理HT29细胞的无性系存活部分的比较。数据表示为来自五次独立的试验中的平均值土SE。统计上的差异按照双侧Student t检测确定。星号*和**分别代表P < O. 05和P < O. 01 ；NS表示P彡O. 05。图4显示了使用siRNA短暂地耗尽MLHl不影响富含及缺少MSH3的细胞对于顺钼和奥沙利钼的抗性(4A)短暂的siRNA转染之后，在MLHl耗尽的HCT116+3+5和G5细胞中MLHl和β -肌动蛋白的蛋白质印迹分析；(4Β)在使用对照的siRNA或者MLHlsiRNA转染之后，使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍处理的HCT116+3+5和G5细胞的无性系存活部分。在使用顺钼(4C)和奥沙利钼(4D)处理的MLHl耗尽的HCTl 16+3+5和G5细胞之间，无性系存活部分的比较。数据表示为来自四次或更多次独立试验的平均值土SE。统计差异按照双侧Student t检测确定。星号*和**分别代表P < O. 05和P < O. Ol ；NS表示p^O. 05。图5证明了缺少MSH3的细胞显示出DNA双链断裂修复效力的下降(5A)在使用强力霉素的HCTl 16+3+5、G5和不使用强力霉素的G5细胞中针对pH2AX核灶形成的荧光染色。所述的细胞使用5 μ M的奥沙利钼处理6小时,并在所指示的小时数后通过免疫荧光进行分析。上方的图；DAPI，下方的图pH2AX ;(5B)在缺少MSH3的细胞中，pH2AX阳性细胞的低效率地减少，(5C)在使用强力霉素的G5以及无强力霉素的G5细胞中，针对53BP1核灶形成的免疫荧光染色。所述的细胞使用5 μ M的奥沙利钼处理6小时，并在48小时后通过免疫荧光进行分析(5D)。在各个载玻片上至少数出100个细胞。数据表示为来自三次或四次独立的试验的平均值土SE。在缺少MSH3的G5和富含MSH3的G5之间的统计差异按照双侧Student t检测确定。星号*和#分别代表p < O. 05和p < O. 01 ；NS表示p彡O. 05。图6显示了缺少MSH3细胞对于奥拉帕尼，一种PARP抑制剂，以及其与奥沙利钼的组合是敏感的^A)HCT116+3+5、不含强力霉素的G5和含有强力霉素的G5细胞的无性系存活率，该细胞使用2 μ M的奥沙利钼，2 μ M的奥拉帕尼及这两种药物的组合处理，以及(6Β)是ΗΤ29细胞的无性系存活率，该细胞使用I μ M的奥沙利钼，2 μ M的奥拉帕尼及这两种药物的组合处理。数据表示为来自三次或更多次独立的试验的平均值土SE。统计差异按照双侧Student t检测确定。星号*、#和林*分别代表p < O. 05、p < O. 01和p < O. 001。发明描述尽管在下文中详细讨论了制备和应用本发明的不同的实施方案，应该认识到本发明提供了多个可实施的发明构思，所述的发明构思可以在具体上下文的大范围内实施。在此讨论的具体实施方案仅仅说明了制备和使用本发明的特定方式，而不限制本发明的范围。为了便于理解本发明，在下文中定义了多个术语。在此定义的术语与本发明相关领域具有普通技术人员所一般地理解的意义。术语如“一个”、“一种”以及“该”无意于仅指单个的实体，而包括可以用作说明的具体例子的大类。该术语在此用于描述本发明的特定实施方案，但是其使用不限制本发明，除非在权利要求中概述。在此使用的缩写包括MMR，错配的修复；MSI，微卫星不稳定性；CRC，结肠直肠癌；MeG，06-甲基鸟嘌呤；ICL，链间交联；NER，核苷酸剪切补修复；HR，同源重组；PARP，聚(ADP-核糖)聚合酶；EMAST，在四核苷酸重复处的上升的微卫星改变；DSB，双链断裂；BrdU,溴脱氧尿苷；pH2AX，磷酸化的H2AX。如本文使用的，术语“结肠直肠癌”包括广泛接受的医学定义，该定义规定结肠直肠癌是医学疾病，特征在于小肠下方(即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、 S形结肠以及直肠)的肠道细胞的癌变。除此之外，如本文所使用的，术语“结肠直肠癌”还进一步地包括这样的医学疾病，其特征在于十二指肠和小肠(空肠和回肠)内细胞的癌变。术语“组织样品”(术语“组织”与术语“组织样品”可交换地使用)应该理解为包括由一个或者多个细胞所组成的任意材料，其是单独的或者与任意的基质复合，或者与任意的化学物质结合。该定义应包括任意的生物或有机材料，以及任意的细胞的亚部分，其产物或者副产物。“组织样品”的定义应该理解为包括但不限于精子、卵子、胚胎和血液的组分。为了本发明的目的，术语“组织”还包括的是特定的非细胞结构如皮肤的真皮层，该真皮层来自于细胞但是不再具有细胞的特征。如本文所使用的术语“大便”是临床术语，指人类排出的粪便。在本文使用的术语“基因”指编码功能蛋白质、多肽或者肽的单元。如本领域的技术人员所理解的，这一功能性的术语包括两个基因组序列、cDNA序列或者其片段或组合，以及基因的产物，包括可以经人工改变的那些。经纯化的基因、核酸、蛋白质等等用于指从至少一种通常与其相关的污染核酸或者蛋白质中鉴定并分离出来的这些实体。术语“等位基因”或者“等位基因形式”指编码同样的功能性蛋白的基因的可选择的形式，但是含有与同一基因的其他形式相关的核苷酸序列上的差异。如本文所使用的，“核酸”或者“核酸分子”指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)所产生的片段以及通过任意的连接、 剪切、核酸内切酶和核酸外切酶活动产生的片段。核酸分子可以由天然产生的核苷酸的单体组成(例如DNA和RNA)，或者由天然产生的核苷酸的类似物组成(例如天然产生的核苷酸的α-对映体形式)，或者两者的组合组成。经修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或者嘌呤碱基部分上有改变。糖的修饰包括，例如将一个或者多个羟基以卤素、烷基、胺和叠氮基团替代，或者可以将糖功能化成为醚或者酯。除此之外，整个的糖部分可以用空间上和电子上类似的结构替换，如阿扎糖以及碳环的糖类似物。在碱基部分上修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或者其他公知的杂环替代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者该连接的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代憐酸酯、硒代憐酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代憐酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroaniIothioate> phosphoranilidate、氨基憐酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括连接到聚酰胺骨架上的天然产生的或者经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或者双链的。如本文所使用的，术语“杂交”指两个单链的多核苷酸非共价结合，形成稳定的双链多核苷酸的过程；三链的杂交在理论上也是可能的。所产生的(通常是)双链的多核苷酸是“杂交物”。形成稳定的杂交物的多核苷酸的群体的比例在本文中称作“杂交度”。杂交通常在严格的条件下进行，例如在盐浓度不多于IM并且温度为至少25°C下进行。例如，5XSSPE 的条件(750mM NaCl，50mM 磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4)以及 25_30°C的温度对于等位基因特异性的探针杂交而言是合适的。对于严格的条件，参见例如Sambrook, Fritscheand Maniatis. “Molecular Cloning A laboratory Manual ”第二版· Cold Spring HarborPress (1989)，其由于前述的所有目的，以全文的方式并入作为参考。如本文所使用的，术语“滚环扩增(RCA) ”描述了 DNA的复制和扩增的方法，该方法导致包括序列的一个或者多个拷贝的与原始环状DNA的序列互补的核酸链。该扩增过程(产生互补的拷贝)包括将寡核苷酸引物杂交到环状的靶DNA上，随后进行等温循环(例如，在连接酶和DNA聚合酶的存在下)。使用RCA的单轮扩增导致在环靶中产生大量序列的扩增，从而得到高浓度的所期待的位于核酸的单链上的寡核苷酸。由于所期待的核酸序列成为混合物中主要的序列(在浓度的意义上)，这称作“RCA扩增的”。通过RCA，可能将一个拷贝的特定的核酸序列扩增到可以通过几种不同的方法检测的程度(如与经标记的探针杂交；在抗生物素蛋白-酶缀合物检测之后加入生物素化的引物；在扩增的片段中加入32P标记的脱氧三磷酸核苷，如dCTP或者dATP)。如本文所使用的，术语“抗体探针”指对于任意靶抗原而言特异性并且与之结合的抗体。该靶抗原可以是抗体能够特异性地结合的肽、蛋白质、碳水化合物或者任意的其他生物聚合物。如本文不同的实施方案中所使用的，术语“生物标记物”指体内的特定生物化学物质，其具有特别的分子结构，从而使其在诊断疾病、测量疾病的进展或者治疗的效果中有用。例如，在人的呼吸中所发现的普通代谢物和生物标记物，以及提供该代谢物的人的相应的诊断状况，所提供的该代谢物包括但不限于乙醛(来源乙醇、X-苏氨酸；诊断中毒)，丙酮(来源乙酰乙酸盐；诊断饮食/糖尿病)，氨(来源氨基酸的脱氨基作用；诊断尿毒症及肝脏疾病)，CO(—氧化碳)(来源CH2C12，升高的％ COHb ;诊断室内空气污染)，氯仿(来源卤化物)，二氯苯(来源卤化物)；二乙胺(来源胆碱；诊断肠道细菌过度生长)，H (氢)(来源肠；诊断乳糖不耐受性)，异戊二烯(来源脂肪酸；诊断代谢压力)，甲硫醇(来源甲硫氨酸；诊断肠道细菌过度生长)，2- 丁酮(来源脂肪酸；诊断室内空气污染/饮食)，邻-甲苯胺(来源癌代谢物；诊断支气管癌)，戊烷硫化物和硫化物(来源脂质过氧化；诊断心肌梗死)，H2S (来源代谢；诊断牙周病/排卵)，MeS (来源代谢；诊断肝硬化)以及Me2S (来源感染；诊断坏死性溃疡性龈炎)。如本文所使用的，术语“免疫组织化学(IHC) ”当用于细胞时，也称作“免疫细胞化学(ICC) ”，其指诊断病理学中的工具，其中可以在未分化的肿瘤的差异诊断中使用多组的单克隆抗体(例如，用于区分淋巴瘤、癌症和肉瘤)，从而显示对特定的肿瘤类型和其他疾病特异性的标记物，从而实现恶性淋巴瘤的诊断和分类，并且证明病毒性抗原、癌基因蛋白、荷尔蒙受体和增殖相关的核蛋白的存在。如本文所使用的，术语“临床试验”包括设计用于收集特定的治疗带来的临床数据的任意研究，并且包括但不限于一期、二期及三期临床试验。为了限定患者群体并入选受试者，使用了标准的方法。术语在研究组之间的“统计学上的显著性”差异指在使用合适的统计分析(例如卡方检验，t-检验)时，各组是一样的概率小于5%的情形，例如P <0.05。换言之，在完全随机的情况下，在100次尝试中得到相同结果的概率少于5次。如本文所使用的，术语“候选的药物”指任意来源的任意化合物，根据本发明的方法，其适用于筛选其在使MSH3表达降低的结肠直肠细胞数量减少上的活性。如本文所使用的，术语“基因毒性剂”定义为能够引起人类的DNA或者基因损伤的化学试剂及物理试剂。致癌剂和诱变剂是化学的基因毒性剂的常见实例，而UV照射，y及X射线等等当其产生氧化的DNA产物时，是物理的基因毒性剂的常见实例。如本文所使用的，术语“抗肿瘤剂”指具有抑制哺乳动物，如人的肿瘤的发生或者进展的功能特性的药剂，并且也指对转移或者转移可能性的抑制。 术语“试剂盒”或者“试验试剂盒”指分析所需的试剂和佐剂的组合。尽管试验试剂盒在大多数的情况下由数个单元组成，也可以使用单件的分析单元，这类似地被认为是试验试剂盒。MSH3基因(保藏编号P20585)是DNA错配修复(NMR)基因之一，其在缺少NMR的癌症中频繁地经历体细胞突变。MSH3与MSH2 —起形成MutS β异源双链核酸分子，其与药物诱导的链间交联(ICL)相互作用，所述的药物如顺钼和补骨脂素。但是，MSH3在介导ICL诱导剂的细胞毒性作用中的确切作用仍然知之甚少。本发明人在此证明了缺少MSH3对于由顺钼和补骨脂素，其他的ICL诱导钼药物引起的细胞毒性的作用。
使用得自HCTl 16的克隆发现了 MSH3缺乏使得细胞对临床相关剂量的顺钼和奥沙利钼敏感化，所述的得自HCT116的克隆中MSH3的表达受到tet-off系统中的shRNA控制。有趣的是，siRNA所诱导的MLHl蛋白下调不影响这些药物的MSH3-依赖性毒性，这说明了该方法不需要正确的MMR途径的参与。除此之外，与富含MSH3的细胞相比，缺少MSH3的细胞在奥沙利钼处理之后，保持了更高水平的磷酸化的H2AX和53BP1，这说明了 MSH3在修复DNA双链断裂(DSB)中起到了重要的作用。MSH3的这一作用进一步地受到在此的发现支持，在此发现中缺少MSH3的细胞对于奥拉帕尼，一种聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂具有敏感性。除此之外，奥沙利钼和奥拉帕尼的组合与它们中任一种单独地处理相比，呈现出协同作用。这些结果共同地证明了，通过不充分的DSB修复，MSH3的缺少增强了钼药物的细胞毒性。这些数据使得能够对具有MSH3缺少的癌症进行有效的预测和治疗。关于基因(包括MSH3)和基因的系列在评价预后和/或预测癌症对化学治疗的响应中的有用性，本发明的发现与此前的发现相比显示出了显著的及新颖的变化。由Baker等人递交的第20090305277号美国专利申请描述了基于测定至少一个基因的表达水平，预测被诊断为癌症的人类患者的可能性的方法，该方法与本发明相反，也就是说包括MSH3的特定基因表达的上升与对化学治疗的阳性响应上升的可能性呈正相关。然而该申请不包括细胞或者组织数据，却使用了一般性的基因挖掘方法得到了他们的结论。DNA错配修复(MMR)系统由几个蛋白组成，所述的蛋白如MLH1、MSH2、MSH6、MSH3和PMS2，消除了复制的错误并保持基因组的稳定性。MutS α，一种MSH2/MSH6的异质二聚体，识别单个的碱基错配，然而MutS β，一种MSH2/MSH3异质二聚体主要地识别2_4个bp的插入-缺失环(1,2)。MutL复合物，主要地为MutL α，一种MLH1/PMS2异质二聚体，与一种MutS异质二聚体形成四聚体复合物，该四聚体复合物在复制期间结合于DNA的错配，并且导致募集其他蛋白质，从而完成DNA MMR的过程。在MMR基因中的种系突变导致林奇综合征(Lynch syndrome),该病的特征在于遗传地易患微卫星不稳定(MSI)的癌症,所述的癌症位于结肠、子宫内膜、卵巢及尿道(3，4)。与此相反，MLH启动子的甲基化所导致的MMR缺少导致偶发的MSI肿瘤，其包括结肠直肠癌(CRC)( 15% )，子宫内膜癌(20 25% )和卵巢癌( 12% ) (4-6)。MMR系统也参与DNA损伤剂所产生的特定DNA加和物的修复，所述的DNA损伤剂如烷基化剂和6-硫鸟嘌呤。烷基化剂所产生的主要的细胞毒性损伤是O6-甲基鸟嘌呤CfeG),其导致sfeG-C或者sfeG-T的错配(7)。MutSa识别这些错配，并募集用于随后的修复反应的MutL a (8,9) ο MutSa或者MutL α的丢失导致细胞对这些药物的细胞毒性作用具有耐受性，这说明了这两种复合物也与导致细胞生长抑制或者细胞死亡的信号转导途径有联系(10，11)。另一方面，MutS β识别由DNA交联剂所产生的链间交联(ICL)，所述的DNA交联剂如补骨脂素和顺钼。哺乳动物提取物中，补骨脂素所诱导的ICL的识别和分开涉及MutS β (12)。最近已经显示MutS β与XPA-RPA或者XPC-RAD23B相互作用，这两者均涉及核酸切除修复(NER)，补骨脂素ICL的识别，并且促进NER过程(13，14)。修复ICL的同源重组(HR)的水平也取决于MutSP，而非MutSa或者MLH1。这些结果说明，MutSP可以与NER、HR和Fanconi贫血症蛋白协同作用，修复由补骨脂素诱导的ICL(15)。除此之外，MutS β还与PARP-1、DNA连接酶111、XRCC_1、Ku80和Ku70 —起结合于顺钼诱导的ICL，这说明MutSii也可以与其他的修复路径协同作用，从而识别并修复钼药物所诱导的ICL。(16)奥沙利钼，第三代的钼药物，是当前用于治疗CRC患 者的主要药物之一。与顺钼类似，奥沙利钼也形成链内交联及ICL (17)。然而，奥沙利钼所诱导的加成物，尤其地ICL的修复和细胞毒性作用中所涉及的详细分子机制仍然未得到广泛探索。考虑到MutS β复合物在ICL的修复中起作用，本发明人认识到MSH3的缺乏可以使钼药物所诱导的ICL的修复停止，这导致这些药物在癌症患者中的细胞毒性增强。除此之外，由于MSH3的缺乏导致抑制的HR(15)，并且缺少HR的细胞对于聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂具有高度敏感性(18，19)，本发明人进一步地认识到MSH3的缺乏还可以导致细胞对PARP抑制剂的敏化。在MSI CRC中，在MSH3的外显子中单核苷酸[八]8重复之内的频繁的移码突变(20-50%)导致MSH3的丢失或者减少(20-22)。最近，本发明人发现了MSH3阴性的癌症细胞群体在偶发的CRC组织中存在，所述的细胞群体显示出低的MSI水平和/或在四核苷酸重复位置升高的微卫星改变(EMAST) (23)。如果MSH3的缺少在临床的环境下支配了钼药物和PARP抑制剂的毒性，可以将MSH3的状态在缺少MSH3的患者中用作化学治疗的预测性标记物。为了证明可以将MSH3的状态在具有缺少的MSH3的癌症患者中用作化学治疗的预测性标记物，本发明人使用同基因的细胞系，其中MSH3蛋白质的表达可以通过tet-off系统中的shRNA的表达进行调节，并且研究了 MSH3缺少对于细胞对两种钼药物及一种公知的PARP抑制剂的敏感性的影响。这些研究揭示了新的分子证据，在CRC细胞系中，MSH3的缺少对钼药物的细胞毒性，尤其是作为损伤性的双链断裂(DSB)修复的结果的细胞毒性有贡献。试剂一顺钼，奥沙利钼，N-甲基-V -硝基-N-亚硝基胍(MNNG)及碘化丙唆购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。奥拉帕尼，一种 PARP 抑制剂，购自 SelleckChemicals(Houston,TX)。细胞系和细胞培养物一人类结肠癌细胞系HCT116、HCT116+ch. 3 (HCT116+3)、HCTl 16+ch. 3+ch. 5 (HCT116+3+5)均已在前文描述(10，23)。HCTl 16+3+5 细胞由四环素调节的反转录病毒载体稳定地转染，所述载体为TMP(0pen Biosystems, Huntsville, AL),其编码针对MSH3的shRNA。分离了稳定的缺少MSH3的克隆G1、G2和G5 (参见结果和(23))。在具有 10%胎牛血清的 IMDM(Invitrogen, Rockville, MD)中生长 HCT116、HCT116+3 和HCTl 16+3+5细胞。在含有10%胎牛血清和0. 6 μ g/ml的嘌呤霉素的HffiM中生长G1、G2和G5细胞。为了关闭MSH3shRNA的表达，在培养基中加入I μ g/ml的强力霉素。蛋白质印迹分析一如前所述地，由细胞裂解液制备蛋白质，将该蛋白质分离在SDS-PAGE上，并转移到PVDF膜上(31)。使用抗_hMSH3鼠单克隆抗体(稀释；I 250，Clone 52，BD Pharmingen，San Jose，CA)，抗-hMLHl 鼠单克隆抗体(I 200，G168-728，BDPharmingen)和抗-β-肌动蛋白抗体(I : 10000, Clone AC-15, Sigma-Aldrich)作为特异性蛋白检测的一抗。使用山羊抗鼠抗体(I : 3000, sc-2005, Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA)作为二抗。信号放大和检测通过将膜暴露于ECL试剂(GE Healthcare,Piscataway，NJ)，随后在 Storm成像系统(Storm imaging system) (Amersham, Piscataway,NJ)上可视化来完成。无性系存活率分析一将200个细胞种在六孔板的各个孔中。为了测量顺钼或者奥沙利钼所引起的细胞毒性，一旦细胞附着于板，便使用所述的药物处理细胞24小时。为了测量奥拉帕尼所引起的细胞毒性，在试验中将细胞继续使用该药物进行处理。在8-10天之后，计数群落的数量(大于50个细胞的群落)，并且测定药物处理的与未处理的细胞中无性系存活率的相对变化。细胞周期分析一将一百万个细胞种于IOcm的盘中。一旦附着，将所述的 细胞系使用奥沙利钼处理24小时。在此后的48小时后，将细胞使用冷的PBS洗涤两次，在冷的70%乙醇中-20°C下固定过夜或者持续几天。随后，将经乙醇固定的细胞(2X106)使用PBS洗涤两次并且使用300 μ I的PBS和O. 15% RNase A在37°C下温育15分钟。将该细胞使用75 μ g/ml的碘化丙啶处理30分钟，并随后使用FACSCantoII流式细胞仪(FACSCantoIIflow cytometer) (BD Biosciences, San Jose, CA)分析其 DNA 含量。细胞周期数据使用Flowjo 软件(Tree Star, Ashland, OR)进行分析。增殖分析一增殖指数通过溴脱氧尿嘧啶在HCT116+3+5和G5中的掺入来测定，该测定在最初使用顺钼或者奥沙利钼(Cell Proliferation ELISA, BrdU, RocheDiagnositics, Indianapolis, IN)处理24小时之后48小时时进行。试验进行三次，并且数据从三次或者四次的独立试验中得到。siRNA 处理一MLHl siRNA、MSH3siRNA 和非 IE 向的 siRNA 购自Dharmacon(Lafayette, CO)。将二十万个细胞种在24孔板中。经过夜温育之后，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)按照生产商的说明书，将该细胞使用83nM的靶向siRNA或者非靶向siRNA，进行转染。转染后两天，收获细胞并再次将细胞铺板用于无性系存活率分析。免疫荧光染色一在12孔板中，将一万个细胞在玻璃盖玻片上生长。将细胞使用4%的多聚甲醛(pH 7. 5)在PBS中固定15分钟，使用0. 3% Triton X-100渗透五分钟，并随后使用10%的山羊血清(Invitrogen, Carlsbad, CA)封闭I小时。随后，将该细胞与抗活性的半胱天冬酶-3抗体(I : 500, G748, Promega, Madison, WI), —种抗磷酸化的H2AX(pH2AX)抗体(I 5000, JBW301, Millipore Corporation, Billerica, MA)或者一种抗 53BP1 抗体(I : 600, ab21083, Abeam, Cambridge, MA) 一起温育 I 小时，随后与二抗(I : 800, Alexa Fluor 555山羊抗小鼠或者抗兔抗体，Invitrogen) 一起温育40分钟。在封固培养基时使用了 Prolong Gold with DAPI (Invitrogen)。这些图像使用配备有AxioVision软件的AxioSkop2多通道落射突光显微镜(AxioSkop2 multichannelepifluorescence microscope equipped with the AxioVision software)(Carl Zeiss,Thornwood, NY)得到。在缺少MSH3的克隆中，MSH3的表达受到强力霉素的控制。本发明人首次确定了在HCT116 CRC细胞的G1、G2和G5细胞克隆中，MSH3的表达是否受到强力霉素的控制。将HCTl 16和HCTl 16+3细胞用作MSH3表达的阴性对照，以及将HCTl 16+3+5用作MSH3表达的阳性对照。HCT116和HCT116+3未显示出可检测的MSH3蛋白质表达(图1A)，这与在MSH3外显子7的单核苷酸重复中存在纯合子移码突变的HCTl 16细胞一致(23)。通过5号染色体的拷贝的转移由缺少MSH3的HCT116+3产生的HCT116+3+5显示出表达MSH3。尽管在没有强力霉素的G1、G2和G5克隆中未检测到MSH3，在这些克隆中，强力霉素的加入将MSH3的表达恢复到亲代HCTl 16+3+5水平的约40-60% (图IA和1B)。尽管期待在这些细胞系中甚至在强力霉素的存在下完全阻碍MSH3shRNA的产生具有技术挑战性，但在本研究中，在这些结果中的蛋白质水平足以用来分析MSH3对药物敏感性的效果，由于即使考虑到体外的EMAST表型，在G5细胞中的MSH3的该水平足以恢复MSH3的功能(23)。与富含MSH3的细胞相比，缺少MSH3的细胞对于顺钼和奥沙利钼更为敏感。为了测定MSH3的状态是否影响对两种钼药物的细胞敏感性，检查了 HCTl 16和得自HCTl 16的细胞系在顺钼处理的细胞中的无性系存活率情况。在缺少MLHl以及MSH3的HCT116与仅缺少MLHl的HCT116+3细胞系之间没有观察到顺钼敏感性上的显著性差异，然而在富含MSH3的HCTl 16+3+5细胞系中观察到了更高的耐受性(图2A)。在不同的细胞系中，缺少MSH3的G5克隆比其亲代的HCT116+3+5更为敏感(图2A)。为了进一步确认MSH3的存在影响顺钼所诱导的细胞毒性，比较了在强力霉素存在及不存在下，G5细胞的无性系存活率。发现了MSH3表达的恢复使细胞对顺钼的不敏感(5 μ M ;图2B)。这些结果表明，MSH3的耗尽导致细胞对顺钼的敏感。同时还分析了其他克隆，Gl和G2的无性系存活率，并且发现这些克隆与G5表现类似(数据未显示)。这进一步地增强了 MSH3在顺钼导致的细胞毒性中的可能作用。随后，测定了 MSH3的缺少是否也影响到对奥沙利钼的细胞敏感性。出人意料地，缺少MSH3的HCTl 16、HCT116+3和G5显著比亲代的HCTl 16+3+5对奥沙利钼更为敏感，就像顺钼的情况一样(图2C)。此外，观察到了在缺少MSH3的细胞中，MSH3的恢复导致奥沙利钼不敏感性的恢复(图2D)。随后，在缺少MSH3的细胞与经奥沙利钼处理的缺少MSH3细胞之间比较了生长速率的抑制及凋亡水平。通过使用流式细胞仪，本发明人发现在缺少MSH3的细胞中，细胞生长抑制(图2E)的程度和凋亡水平(图2F)显著地比在富含MSH3的细胞中更高。还分别通过BrdU分析和免疫荧光法，确认了在经奥沙利钼处理的缺少MSH3的细胞中细胞增殖降低并且凋亡的部分增加。图2G显示了与未经处理的对照相比，相对的BrdU掺入的减少，并且图2H显示了在HCT116+3+5和G5细胞的免疫荧光中，抗-活性的半胱天冬酶阳性细胞的增加。这些结果与在本文中显示的通过无性系分析所得到的生长抑制结果—致。通过siRNA转染的MSH3的缺少也使细胞对顺钼及奥沙利钼敏感。为了进一步确认与MSH3相关的对顺钼和奥沙利钼的敏感性的作用，测定了短暂地转染了 MSH3siRNA和非靶向的siRNA的细胞的无性系存活率频率。在这些研究中，已知在HCTl 16+3+5细胞中，MSH3蛋白质表达在siRNA转染之后72小时显著地减少(与未处理的细胞相比98%的MSH3表达抑制)(图3A)。将HCT116+3+5细胞用MSH3siRNA进行转染，并且在转染之后48小时，将所述的细胞暴露于顺钼(5 μ M和10 μ Μ)或者奥沙利钼(2 μ M和5 μ Μ)。如图3Β和3C中 所示，MSH3siRNA的转染使得HCT116+3+5细胞与经非靶向的siRNA转染的细胞系相比，变得对顺钼和奥沙利钼更为敏感。为了进一步确认在缺少MSH3的细胞中这种对钼药物的敏感性的增加，将另一个结肠癌细胞系，HT29，使用MSH3siRNA或者非靶向的siRNA进行转染。证实了在HT29细胞中，MSH3基本上被完全抑制(图3D)，并且使用MSH3siRNA处理的HT29细胞变得对顺钼和奥沙利钼两者都更为敏感(图3E和3F)。这些结果进一步加强了 MSH3的缺少使得细胞对顺 钼和奥沙利钼敏感的这一发现。在富含MSH3和缺少MSH3的细胞中顺钼或者奥沙利钼的敏感性是与结肠癌细胞中的MLHl状态独立地发生的。从临床观点来看，确定MSH3状态是否影响MLHl也缺少的癌症患者是否对于顺钼和奥沙利钼的敏感性是重要的。为了解决这一问题，通过诱导siRNA介导的MLH表达的下调，比较了缺少MSH3的G5细胞和富含MSH3的细胞对于顺钼和奥沙利钼的敏感性(图4A)。当MLHl在由MLHlsiRNA转染的HCTl 16+3+5和G5细胞中均下调时，两种细胞系与未经处理的对照细胞系相比，均变得对MNNG更具抗性(图4B)，从而在这些情况下确认了 MLHl的功能抑制(10，11)。有趣的是，在这一情况下，观察到G5细胞与HCT116+3+5相比，对于顺钼和奥沙利钼更为敏感(图4C和4D)。这些结果证明了 MSH3依赖的对顺钼和奥沙利钼的敏感性与MLHl状态是独立发生的。缺少MSH3的细胞证实了在奥沙利钼处理后，持续的PH2AX和53BP1水平。钼药物诱导DNA的链内交联以及ICL，并且一些损伤最终导致继发的DNA双链断裂(DSB)，据推测是解体的复制叉所导致的(24)。为了确定MSH3是否包含在DSB的修复中，使用免疫荧光染色分析了核PH2AX，一种DNA DSB的替代标记物的水平随时间的变化(25)。发现富含和缺少MSH3细胞系在奥沙利钼处理之前和之后，pH2AX核灶阳性的细胞数目没有变化。相反，观察到在缺少MSH3的G5细胞中，与MSH3恢复的G5细胞以及HCT116+3+5细胞系相比，在奥沙利钼处理的48小时和72小时期间，pH2AX核灶阳性的细胞数目减少的速度更低(图5A和5B)，表明DSB修复仅在缺少MSH3的细胞系中受到损害。为了进一步地确认这种DSB修复的效率低下，使用抗-53BP1抗体，另一种检测DNA DSB的标记物进行了免疫荧光测试。证实了在奥沙利钼处理之后，在缺少MSH3的G5细胞中持续的53BP1水平(图5C和5D)。这些结果显示了缺少MSH3的细胞对于奥沙利钼具有的更高的敏感性可能部分由于降低的DNA DSB修复效率，而不是由于处理所诱导的DNA损伤负担的数量上的差异。缺少MSH3的细胞对奥拉帕尼，PARP抑制剂也是敏感的。PARP抑制剂增加单链断裂的数目，其最终导致由HR系统修复的DNA DSB。缺少HR的细胞对PARP抑制剂是高度敏感的，由于它们不能修复这些DSB (18，19)。MSH3在DSB修复中可能的功能从结果(图5A-5D)中得到证明，这促使进一步地调查缺少MSH3的细胞是否也对PARP抑制剂敏感。如图6A中所显示的，缺少MSH3的细胞与恢复了 MSH3的G5细胞系相比，对奥拉帕尼更为敏感。这些数据清楚地支持在CRC细胞中，MSH3在DSB修复中的作用。除此之外，在缺少MSH3的G5细胞中，与亲代的HCT116+3+5相比，奥沙利钼和奥拉帕尼的组合在细胞毒性中显示协同效应。该效应在使用MSH3siRNA的短暂压制系统(knockdown system)中，通过两种其他的结肠癌细胞系HT29(图6B)和SW480(数据未显示)得到证实。这些结果证实了钼药物和PARP抑制剂对缺少MSH3的癌症的联合治疗。本研究阐明了 MSH3的损失影响由钼药物引起的细胞敏感性。该观察可以用于建立诊断和治疗策略，其中在缺少MSH3的肿瘤患者中MSH3的状态可以用作化学治疗结果的预测性标记物。总地来说，通过使用MSH3表达受到tet-off系统调节的同基因结肠癌细胞系，证实了在结肠癌细胞中，MSH3表达的缺失使得所述的癌细胞不仅对顺钼，而且对奥沙利钼及PARP抑制剂敏感化。尽管MSH3牵涉到DNA DSB修复中的确切机理仍待进一步探索，这些数据说明，这些效果可以由缺少MSH3的细胞的降低的修复DSB的能力来很好地解释，所述的DSB是在使用这些药物处理之后引起的。这是首次证实了 MSH3的选择性抑制增加了针对钼药物和PARP抑制剂增强的细胞敏感性。此外，这些结果证实了这种MSH3依赖的针对顺钼和奥沙利钼的敏感性增加不受MLHl下调的影响，并且很可能对于标准的MMR系统是独立的。
MutS和MutL同源物在ICL修复中的作用已经通过补骨脂素ICL进行了彻底研究(12-15, 26) 0这些数据说明与其他蛋白如NER和HR蛋白结合，MutSii牵涉到特定类型的ICL的识别及处理中，并且说明了 MutS β与其在MMR中的主要功能独立地也在ICL修复中起作用。此处的这些发现显示，缺少MSH3的细胞对于顺钼和奥沙利钼是敏感的，并且这一事实与MLH功能独立，以上的结果与使用补骨脂素ICL的发现是一致的。这些结果显示了 MutSP牵涉到ICL加成物所导致的有毒性的DSB的修复中。首先，有证据显示MSH3与DSB损伤呈现出共定位，所述的DSB损伤由激光(27)以及由致癌物如六价铬(28)诱导产生。其次，本发明人意识到在奥晒钼处理之后，与富含MSH3的细胞相t匕，在缺少MSH3的细胞中与DSB共同定位的pH2AX和53BP1具有持续的水平。第三，缺少MSH3的细胞对于PARP抑制剂是敏感的，所述的PARP抑制剂诱导DSB。因此，这些数据显示，由于MSH3缺少导致的未修复的DSB是细胞死亡的直接原因。然而，近期的研究显示出，与具有MSH2G674D突变的小鼠中的肿瘤相比，在无MSH2的小鼠中产生的肿瘤对于顺钼，以及对于5-FU和奥沙利钼的组合更具抗性(29)。有趣的是，尽管该错义突变导致MMR活性的损失，其仍然对于DNA损伤是敏感的。这些结果显示出MSH2在MMR活性以及化学敏感性中具有区别的功能(29)。已经证明了在顺钼处理之后，细胞凋亡途径中涉及的不同蛋白如JNK和c-Abl的活化中需要MSH2和MLHl (30)，然而，MutS α或者MutS β，或者MutS α和MutSii两者是否牵涉到顺钼或者奥沙利钼的信号转导途径中还不清楚。然而，由于该结果表明，MSH3的损失增加了对顺钼及奥沙利钼的敏感性，MutS β很可能主要参与DNA损伤的修复中，以及MutSa参与到修复及导致细胞死亡的信号转导途径中。进一步的研究可以解释MutSa或者MutSP在DNA损伤修复以及这些药物导致的损伤信号转导中的具体作用。缺少MSH3的细胞对顺钼和奥沙利钼的敏感性这一结果和此前Vaisman等人的报道(31)不一致。Vaisman等人的研究报道了针对这些药物的敏感性在缺少MSH3的HHUA细胞和与5号染色体互补的富含MSH3的HHUA细胞之间并无不同(31)。在他们的研究中，5号染色体的数百个其他基因的影响未加以排除；因此在本文中所获得的数据更为有力，由于使用了 HCT116结肠癌细胞的同基因的克隆，其中MSH3的表达按照需要选择性地进行了调节。从临床的角度来看，本文中所给出的结果证实了相当大群体的MSI CRC患者可以从基于奥沙利钼的处理方案、PARP抑制剂或者尤其地，两者结合的治疗方法中获益。在CRC中，许多近期的研究显示，三期MSI癌症的患者从5-FU佐剂化学治疗中不获益(32-34)。除此之外，Bertagnolli等人报道了三期MSI癌症的患者从含有5-FU和伊立替康的佐剂化学治疗中获益(35)，然而另一个研究报道了这些患者并不从这一佐剂治疗中获益(36)。这些不一致的结果提高了具有患者的亚组的可能性，在各亚组之间在MSICRC中具有不同的化学敏感性。例如，这些结果显示至少有两个亚群体的缺少MLHl的CRC，富含MSH3的和缺少MSH3的CRC，并且这些可能依据MSH3状态对奥沙利钼、PARP抑制剂及其组合的响应不同。除了 MSH3外，在MSI癌症中使其他几个DNA修复基因发生突变。MREllA和RAD50是在MSI癌症中最经常突变的基因(22)，其产物在DSB修复复合物MREllA-hRAD50-NBSl中产生。已经证明了在MREllA和RAD50中的突变增加了对伊立替康的敏感性，所述的伊立替康在培养的细胞中诱导继发的DSB (37，38)。这些结果显示，MSH3的缺少使细胞对SN-38敏感，所述的SN-38是伊立替康的活性代谢物(数据未显示)。除此之外，磷酸酶和强力蛋白同系物的损失，另一种在MSI中经常发生突变的基因显示出通过HR修复的无效，使得细胞对PARP抑制剂敏感(39，40)。因此，分析这些DSB修复中涉及的基因或者蛋白质对于预测MSI癌症患者的治疗结果是有帮助的。用于验证作为MSI癌症的药物治疗的预测标记物的临床研究得到保证。此前，本发明人证实了 MSH3表达的损失导致EMAST和MSI低的表型，并且在偶发的CRC组织中，MSH3表达的实质减少与EMAST有关(23)。除此之外，多数MSI低的CRC和相当比例的MSS肿瘤显示出EMAST，这表明这些组织可能经历过MSH3的缺少(23)。MSH3缺 少可能与缺少MLHl的CRC(20)的疾病进展，以及MSI低的CRC具有差的预后(41，42)有关，这提高了 MSH3的损失可以与CRC的转移和重现的促进相关这一可能性。在这种环境下，含有MSH3阴性的癌症细胞种群的偶发性CRC使用钼药物或者PARP抑制剂，或者两者处理，可以抑制疾病的进展。总而言之，本文证明了缺少MSH3的细胞对于顺钼、奥沙利钼和PARP抑制剂是敏感的，这可能是由DNA DSB减少的修复造成的。这些发现有助于更好地理解MSH3在DNA修复和药物敏感性中的功能，以及有助于预测及改进具有缺少MSH3的癌症的患者的治疗结果。预期的是，本说明书中所讨论的任何实施方案可以通过关于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。要理解的是，本文所述的具体实施方案是通过举例说明而不是限制本发明的方法来展示的。本发明的主要特征可以在不脱离本发明范围的情况下用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到，或者仅仅利用例行的实验能够确定，本文所述具体步骤的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，且被权利要求所涵盖。本说明书中提到的所有出版物和专利申请指示了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均引入本文作为参考，其引入的程度如同各个独立的出版物或专利申请具体并独立地被指明弓I入作为参考。词语“一个”或“一种”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指供选择物，或供选择物为相互排斥的，尽管公开内容支持仅仅指供选择物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括装置和用来测定所述值的方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。如在本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(以及任何形式的“包含”)，“具有”(以及任何形式的“具有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”)或“含有”(以及任何形式的“含有”)是包括的或开放式的，且不排除额外的，未述及的元素或方法步骤。如本文所使用的，短语“大体上由..·组成”将权利要求的范围限定至指定的物质或步骤和未在实质上影响要求保护的发明的基本和新颖的特征。如本文所使用的，短语“由...组成”不包括在权利要求中指定的任何元素、步骤或者成分，除了例如通常与元素或限制有关的杂质。
本文所使用的术语“或其组合”是指在该术语之前所列举项目的全部排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一种，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明显包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB等等。本领域技术人员将理解的是，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中另外是明显的。 如本文所使用的，表示近似的词语如但不限于“约”、“基本的”或者“基本上”指这样的情况，当这样修饰时理解为并非必须是绝对的或者精确的，而应认为是足够地接近本领域技术人员认为与当前的情况一样可以使用的情况。说明书可以变化的程度取决于进行多大的变化之后，仍然使得本领域技术人员认为经改变的特征仍然具有所需的性质和未经改变的特征所具有的能力。总地来说，与前面的讨论一致地，使用表示近似的词语如“约”修饰的数值可以从所宣称的数值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或者15%。
根据本发明的公开内容，在没有不适当的实验下可以制备和实施本文所公开和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管已就优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以改变本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或方法的步骤的顺序。所有这样相似的对本领域技术人员而言明显的取代和修饰被认为是在所附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。参考文献第7，252，955 号美国专利Method of Detecting Colon Cancer.第7，575，928 号美国专利Genes for Diagnosing Colorectal Cancer.第7，022，472 号美国专利Mutations in Human MLHl abd Human MSH2 Genesuseful in Diagnosing Colorectal Cancer.第20090305277号美国专利申请GeneExpression Markers for Prediction ofPatient Response to Chemotherapy.I. Kunkel，T. A.，and Erie, D. A. (2005) Annu. Rev. Biochem. 74，681-7102. Jiricny, J. (2006) Nat. Rev. Mol.Cell Biol. 7，335-3463. Hendriks, Y. M.，de Jong, A. E.，Morreau, H.，Tops，C. M.，Vasen，H. F.，Wi jnen,J. T.，Breuning, M. H.，and Brocker-Vriends, A. H. (2006) CA Cancer J. Clin. 56，213-2254. Boland，C. R.，and Goel, A. (2010) Gastroenterology 138，2073-2087 e20735. Black，D.，Soslow, R. A.，Levine, D. A.，Tomos，C.，Chen, S. C.，Hummer, A. J.，Bogomolniy, F.，Olvera, N.，Barakat, R. R.，and Boyd, J. (2006) J. Clin. Oncol. 24，1745-17536. Pal，T.，Permuth-Wey, J.，Kumar, A.，and Sellers, T. A. (2008)Clin. CancerRes.14,6847-68547. Duckett，D. R.，Drummond, J. T.，Murchie, A. I.，Reardon, J. T.，Sancar, A.，Lilley, D. M.，and Modrich，P. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93，6443-64478. de Wind, N.，Dekker, M.，Claij, N.，Jansen，L，van Klink，Y.，Radman, M.，Riggins，G.，van der Valk, M. , Vanr t Wout, K. , and te Riele，H. (1999) Nat. Genet. 23，359-362
9. Abuin，A.，Zhang, H.，and Bradley, A. (2000)Mol. Cell. Biol. 20，149-15710. Koi，M.，Umar, A.，Chauhan, D. P.，Cherian, S. P.，Carethers, J. M.，KunkeI,T. A.，and Boland，C. R. (1994) Cancer Res. 54，4308-431211. Hawn,M. T. ,Umar, A.，Carethers，J. M.，Marra，G.，Kunkel，T.A.，Boland，C. R.，and Koi，M. (1995) Cancer Res. 55，3721-372512. Zhang, N.，Lu，X.，Zhang, X.，Peterson, C. A.，and Legerski, R. J. (2002)Mol.Cell. Biol. 22，2388-239713. Zhao, J.，Jain, A.，Iyer, R. R.，Modrich, P. L.，and Vasquez, Κ. M. (2009)Nucleic Acids Res. 37，4420-442914. Vasquez, Κ. M. (2010) Environ. Mol. Mutagen 51, 527-53915. Zhang, N.，Liu, X.，Li，L.，and Legerski, R. (2007)DNA Repair (Amst)6，1670-167816. Zhu, G.，and Lippard, S. J. (2009)Biochemistry 48,4916-492517. Chaney, S. G.，Campbell，S. L.，Bassett，E.，and Wu, Y. (2005) Crit. Rev.Oncol. HematoI. 53, 3-1118. Bryant, H. E.，Schultz, N.，Thomas，H. D.，Parker, K. M.，Flower, D.，Lopez,E.，Kyle，S.，Meuth，M.，Curtin，N. J.，and Helleday，T. (2005)Nature 434，913-91719. Farmer, H.，McCabe，N.，Lord, C. J.，Tutt，A. N.，Johnson，D. A.，Richardson，T. B.，Santarosa，M.，Dillon，K. J.，Hickson，I.，Knights，C.，Martin，N. M.，Jackson，S. P.，Smith，G. C.，and Ashworth, A. (2005)Nature 434,917-92120. Plaschke，J.，Kruger，S.，Jeske，B.，Theissig，F.，Kreuz, F. R.，Pistorius，S.，Saeger, H. D.，Iaccarino，I.，Marra, G.，and Schackert，Η. K. (2004) Cancer Res. 64，864-87021. Miquel，C.，Jacob，S.，Grandjouan，S.，Aime, A.，Viguier, J.，Sabourin，J. C.，Sarasin，A.，Duval，A.，and Praz, F. (2007) Oncogene 26,5919-592622. Hewish, M.，Lord，C. J.，Martin，S. A.，Cunningham，D.，and Ashworth,A. (2010)Nat. Rev. Clin. Oncol. 7，197-20823. Haugen，A. C.，Goel，A.，Yamada, K.，Marra, G.，Nguyen, T. P.，Nagasaka，T.，Kanazawa, S.，Koike, J.，Kikuchi，Y.，Zhong，X.，Arita，M.，Shibuya，K.，Oshimura，M.，Hemmi，H.，Boland，C. R.，and Koi，M. (2008) Cancer Res. 68,8465-847224. Hinz, J. M. (2010) Environ. Mol. Mutagen 51，582-60325. Bonner, W. M.，Redon，C.E.，Dickey，J. S.，Nakamura，A. J.，Sedelnikova，0. A.，Solier, S.，and Pommier，Y. (2008)Nat. Rev. Cancer 8，957-96726. Wu, Q.，and Vasquez, Κ. M. (2008)PLoS Genet. 4，el00018927. Hong，Z.，Jiang，J.，Hashiguchi，K.，Hoshi，M.，Lan，L，and Yasui，A. (2008)J. Cell Sci. 121,3146-315428. Reynolds, M. F.，Peterson-Roth，E. C.，Bespalov, I. A.，Johnston，T.，Gurel，V. M.，Menard，H. L，and Zhitkovich，A. (2009) Cancer Res. 69，1071-1079
29. Kuch erlapati，Μ. H.，Lee，K.，Nguyen, A. A.，Clark, A. B.，Hou, H.，Jr.，Rosulek，A.，Li，H.，Yang，K.，Fan，K.，Lipkin，M.，Bronson，R. T.，Jelicks，L，KunkeI,T. A.，Kucherlapati，R.，and Edelmann, W. (2010)Gastroenterology 138，993_1002el00130. Nehme, A.，Baskaran, R.，Nebel，S.，Fink, D.，Howell, S. B.，Wang, J. Y.，andChristen，R.D. (1999)Br. J. Cancer 79，1104-111031. Vaisman, A. , Varchenko,M. ,Umar, A. ,KunkeI, T. A. , Risinger, J. I. ,Barrett,J. C.，Hamilton，T. C.，and Chaney, S. G. (1998)Cancer Res. 58,3579-358532. Ribic，C. M.，Sargent, D. J.，Moore, M. J.，Thibodeau，S. N.，French, A. J.，Goldberg，R. M.，Hamilton，S. R.，Laurent-Puig，P.，Gryfe, R.，Shepherd，L E.，Tu, D.，Redston，M.，and Gallinger, S. (2003) N. Engl. J. Med. 349, 247-25733. Popat，S.，Hubner，R.，and Houlston，R. S. (2005) J. Clin. Oncol. 23，609-61834. Sargent，D. J.，Marsoni, S.，Monges，G.，Thibodeau，S. N.，Labianca，R.，Hamilton，S. R.，French，A. J.，Kabat, B.，Foster，N. R.，Torri, V.，Ribic, C.，Grothey,A.，Moore, M.，Zaniboni，A. , Seitz, J. F.，Sinicrope，F.，and Gallinger，S. (2010) J. Clin.Oncol. 28，3219-322635. Bertagnolli，M. M.，Niedzwiecki，D.，Compton，C. C.，Hahn, H. P.，Hall，M.，Damas, B.，Jewell, S. D.，Mayer, R. J.，Goldberg，R. M.，Saltz，L B.，Warren, R. S.，andRedston, M. (2009) J. Clin. Oncol. 27，1814-182136. Tejpar，S.，Bosman，F.，Delorenzi，M.，Fiocca，R.，Yan，P.，Klingbiel，D.，Dietrich, D.，Van Cutsem，E.，Labianca, R.，and Roth, A. (2009) J. Clin. Oncol. 27,400137. Vilar, E.，Scaltriti，M.，Balmana，J.，Saura, C.，Guzman, M.，Arribas，J.，Baselga，J.，and Tabernero, J. (2008)Br. J. Cancer 99，1607-161238. Rodriguez, R.，Hansen，L T.，Phear，G.，Scorah，J.，Spang-Thomsen，M.，CoX，A.，Helleday，T.，and Meuth, M. (2008)Clin. Cancer Res. 14,5476-548339. Mendes-Pereira, A. M. , Martin, S. A. , Brough, R. ,McCarthy, A.，Taylor，J.R.，Kim, J. S.，Waldman, T.，Lord, C. J.，and Ashworth, A. (2009) EMBO Mol. Med. I，315-32240. McEllin，B.，Camacho，C. V.，Mukher jee, B.，Hahm, B.，Tomimatsu，N.，Bachoo,R. M.，and Burma, S. (2010) Cancer Res. 70,5457-546441. Kohonen-Corish, M. R.，Daniel，J. J.，Chan, C.，Lin, B. P.，Kwun, S. Y.，Dent，0. F.，Dhillon，V. S.，Trent, R. J.，Chapuis, P. H.，and Bokey, E. L (2005) J. Clin.Oncol.23,2318-232442. Wright, C. M.，Dent，0. F.，Newland，R. C.，Barker, M.，Chapuis, P. H.，Bokey，E. L.，Young，J. P.，Leggett, B. A.，Jass，J. R.，and Macdonald，G. A. (2005)Gut 54，103-108。
权利要求
1.一种用于预测具有患一种或多种腺癌的风险，或者诊断患有一种或多种腺癌的患者的治疗方案的疗效的方法，所述方法包括 测定得自患者的怀疑为腺癌细胞的细胞中的MSH3的总体表达；并且 根据在患者细胞中MSH3的总体表达的测定，预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂的治疗方案的效果，其中与正常细胞中MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明对抗肿瘤剂治疗的响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的抗肿瘤剂给予患者。
2.权利要求I所述的方法，其中所述的腺癌包括实体瘤，所述的实体瘤选自结肠直肠癌(CRC)、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴道癌、乳腺癌、食 道癌、胰腺癌和胃癌。
3.权利要求I所述的方法，其中所述的腺癌是CRC。
4.权利要求I所述的方法，其中所述的测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑为腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达，MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。
5.权利要求I所述的方法，其中所述的测定得自个体的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的总体表达水平的步骤包括进行质谱分析，滚环扩增，免疫组织化学分析，使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者其任意的组合或者修改。
6.权利要求I所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂选自1，3_二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、马法兰、丝裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和电离辐射。
7.权利要求I所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂是链间交联剂，所述链间交联剂选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素。
8.权利要求I所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂选自奥拉帕尼、异吲哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。
9.一种用于治疗具有患结肠直肠癌的风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者的方法，所述的方法包括 测定得自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞中的MSH3的总体表达；并且 根据在患者细胞中MSH3的总体表达的测定，预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂的治疗方案的效果，其中与正常结肠直肠癌细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达的减少表明对抗肿瘤剂治疗的响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的抗肿瘤剂治疗给予患者。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑为腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达，MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。
11.权利要求9所述的方法，其中所述的从得自个体的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸测定MSH3的总体表达水平的步骤包括进行质谱分析，滚环扩增，免疫组织化学分析，使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者其任意的组合或者修改。
12.权利要求9所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂选自1，3_二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、马法兰、丝裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康、和电离辐射。
13.权利要求9所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂是链间交联剂，所述链间交联剂选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素。
14.权利要求9所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂选自奥拉帕尼、异吲哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。
15.一种为具有患结肠直肠癌风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者选择癌症治疗的方法，所述的方法包括 测定患者的MSH3的总体表达水平，并且预测使用用于治疗患者的抗肿瘤剂治疗的疗效，其中MSH3的总体表达的减少表明DNA交联剂对于患者而言是适合的治疗。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达、MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。
17.权利要求15所述的方法，其中所述的从得自个体的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸测定MSH3的总体表达水平的步骤包括进行质谱分析，滚环扩增，免疫组织化学分析，使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者其任意的组合或者修改。
18.权利要求15所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂选自1，3_二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、马法兰、丝裂霉素C、米托蒽醌、替莫唑胺、托泊替康和电离辐射。
19.权利要求15所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂是链间交联剂，所述链间交联剂选自顺钼、卡钼、奥沙利钼、呋喃香豆素或补骨脂素。
20.权利要求15所述的方法，其中所述的抗肿瘤剂是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，所述的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂选自奥拉帕尼、异吲哚酮的衍生物、veliparib、iniparib和4-甲氧基-咔唑的衍生物。
21.一种用于将患者分类到癌症治疗的临床试验的亚组中的方法，所述的方法包括步骤 测定得自患者的怀疑为癌细胞的细胞中的MSH3的总体表达；并且 预测使用用于治疗患者的候选药物治疗的疗效，其中与正常细胞中的MSH3的表达相t匕，患者细胞中的MSH3的总体表达的减少表明对使用该候选药物治疗响应性的倾向，其中所述的治疗包括将有效量的候选药物给予患者，并且MSH3的表达水平使得患者能分类到临床试验的亚组中。
22.权利要求21所述的方法，其中所述的癌细胞是位于实体瘤内的，并且选自结肠直肠癌(CRC)、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴道癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌和胃癌。
23.权利要求21所述的方法，其中所述的癌细胞是结肠直肠癌细胞。
24.权利要求21所述的方法，其中所述的测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑是腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达、MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。
25.权利要求21所述的方法，其中所述的测定得自个体的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的总体表达水平的步骤包括进行质谱分析，滚环扩增，免疫组织化学分析，使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者其任意的组合或者修改。
26.权利要求21所述的方法，其中所述的候选药物是基因毒性剂。
27.权利要求21所述的方法，其中所述的候选药物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂。
28.一种用于将患者分类到结肠直肠癌的亚组中的方法，所述的方法包括步骤 测定得自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞中的MSH3的总体表达；并且 预测结肠直肠癌的阶段，其基于与正常的结肠直肠癌细胞中的MSH3的表达相比，在患者的细胞中的MSH3的总体表达的变化。
29.一种用于治疗具有患结肠直肠癌的风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者的方法，所述的方法包括 测定得自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞中MSH3的总体表达，其中MSH3的总体表达的变化表明了对于采用一种或者多种DNA交联剂治疗的响应性的倾向； 给予治疗上有效量的DNA交联剂，所述的DNA交联剂的量足以减少结肠直肠癌细胞中的MSH3表达；并且 测定在患者中MSH3的总体表达的持续降低。
30.一种用于进行临床试验从而评估候选药物的方法，所述的候选药物据相信在治疗与MSH3基因表达有关的疾病状态中有用，该方法包括 a)测定来自一组患者的怀疑具有结肠直肠癌的组织中的MSH3表达的水平； b)将候选药物给予第一亚组的患者，并将安慰剂给予第二亚组的患者； c)在给予候选药物或者安慰剂之后，重复步骤a);并且 d)测定所述的候选药物是否减少了结肠直肠癌的细胞的数目，所述的细胞具有降低的MSH3表达，该降低与第二个亚组的患者中所发生的任何降低相比具有统计学上的显著性，其中统计学上的显著性降低表明所述的候选药物在治疗所述的疾病状态中是有用的。
31.一种用于确定哺乳动物的结肠直肠癌对于DNA损伤剂是否很可能具有抗性或者是有响应的方法，所述的DNA损伤剂用于结肠直肠癌的治疗，该方法包括以下步骤 检测来自所述癌症的生物样品中MSH3的总体表达的下降；并且 将所述的结肠癌鉴定为对该DNA损伤剂有反应或者具有增强的敏感性，其中在生物样品中降低的MSH3的表达或者活性是对DNA损伤剂的指示或者响应。
32.一种用于结肠直肠癌疾病进展的生物标记物，其中所述的生物标记物是MSH3，并且与正常的结肠直肠癌细胞，或者在更早的时间点上得自同一患者的结肠直肠癌细胞中的MSH3表达相比，从患者中得到的结肠直肠癌细胞中MSH3的总体表达的减少意味着结肠直肠癌疾病的进展。
33.权利要求32所述的生物标记物，其中测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑为腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达、MSH3核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3核酸表达两者都分析。
34.权利要求32所述的生物标记物，其中测定得自个体的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的总体表达水平的步骤包括进行质谱分析，滚环扩增，免疫组织化学分析，使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者其任意的组合或者修改。
35.一种用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，所述的试剂盒包括用于测定MSH3的差异表达 水平的生物标记物检测剂和针对其在诊断结肠直肠癌风险中的应用的说明。
36.权利要求35所述的试剂盒，其中在来自具有患结肠直肠癌风险的患者的样品中，MSH3mRNA和蛋白质表达水平与正常受试者相比均显著地降低。
37.一种用于诊断或者检测人类受试者的结肠直肠癌进展的方法，该方法包括以下步骤 鉴定怀疑患有结肠直肠癌的人类受试者； 从该受试者得到一个或多个的生物样品，其中所述的生物样品选自组织样品、粪便样品、细胞匀浆物和所包含的一种或更多种生物流体； 测定来自受试者的生物样品中的一个或者多个细胞中的MSH3的总体表达特征；并且 将来自怀疑患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中的MSH3的总体表达特征与来自正常的受试者的生物样品的MSH3的总体表达特征进行比较，其中所述正常的受试者是未患有结肠直肠癌的健康受试者，其中在受试者的生物样品中，MSH3的总体表达特征的下降意味着存在结肠直肠癌、具有发生结肠直肠癌的风险或者存在结肠直肠癌和具有发生结肠直肠癌的风险。
38.权利要求37所述的方法，其中所述的测定MSH3的总体表达水平的步骤包括分析怀疑为腺癌细胞的细胞的MSH3蛋白表达、MSH3mRNA核酸表达或者MSH3蛋白表达和MSH3mRNA核酸表达两者都分析。
39.权利要求37所述的方法，其中MSH3mRNA、MSH3蛋白质或者MSH3mRNA和MSH3蛋白质两者的表达水平的显著降低说明存在侵袭性结肠直肠癌、具有发生侵袭性结肠直肠癌的风险或者存在侵袭性结肠直肠癌和具有发生侵袭性结肠直肠癌的风险。
40.权利要求37所述的方法，其中所述的测定得自个体的MSH3核酸或者一部分的MSH3核酸中的MSH3的总体表达水平的步骤包括进行质谱分析，滚环扩增，免疫组织化学分析，使用等位基因特异性探针、抗体探针或者使用等位基因特异性探针和抗体探针两者进行杂交，或者其任意的组合或者修改。
41.权利要求37所述的方法，其中所述的方法用于治疗存在患结肠直肠癌的风险或者患有结肠直肠癌的患者，用于选择用于存在患结肠直肠癌的风险或者患有结肠直肠癌的患者的DNA交联剂治疗，用于将患者分类到结肠直肠癌的亚组中或者用于结肠直肠癌治疗临床试验，用于确定针对结肠直肠癌治疗方案的抗性或者响应性，用于开发用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，或者其任意的组合。
全文摘要
本文公开了治疗具有患结肠直肠癌的风险或者诊断患有结肠直肠癌的患者的方法。本发明的方法确定了来自患者的怀疑为结肠直肠癌细胞的细胞中的MSH3的总体表达水平，并预测使用有基因毒性的抗肿瘤剂治疗患者的疗效，其中与正常的结肠直肠癌细胞中MSH3的表达相比，在患者的细胞中MSH3的总体表达水平的下降表明对基因毒性抗肿瘤剂治疗的响应性的倾向性，其中该治疗包括将有效量的基因毒性抗肿瘤剂治疗给予患者。
文档编号C12Q1/68GK102636648SQ20111022834
公开日2012年8月15日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年2月12日
发明者A·古勒, C·R·伯兰德, 儿井稔, 高桥雅信 申请人:贝勒研究院