专利名称：一种用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化磷脂酶的方法。
背景技术：
磷脂酶Al (Lecitase Ultra)是一种羧酸酯水解酶，专一水解磷脂Sn-Ι位脂肪酸， 生成溶血磷脂和脂肪酸，在磷脂改性、油脂精炼等方面有广泛应用。但是，游离磷脂酶Al价格昂贵，不易回收，催化水解时条件苛刻.而固定化磷脂酶Al具以下优点①容易从产品中分离；②在反应器位置固定容易；③稳定性高，可长时间连续操作；④保留活性高，并且可能获得超高活性.所谓固定化酶就是利用物理或化学方法处理，将游离酶限定或束缚于一定范围之内使其与整体流体分开，但仍能发挥催化作用的酶制剂。现固定化酶在化学、生物学及生物工程、医学、生命科学等领域得到迅速发展。醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产。
发明内容
本发明是针对单膜法固定化磷脂酶效果不理想的问题，而提出的用醋酸纤维素/ 聚四氟乙烯复合膜来进行固定化磷脂酶的方法。用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的方法通过以下步骤实现一、复合膜的制备。二、磷脂酶的固定化。三、酶活力的测定。四、固定化条件的优化。五、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/ 聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶中，酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收，最终得到的固定化酶活为4U/cm2，明显高于文献中单膜法固定化脂肪酶的活力。
具体实施例方式具体实施方式
一用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的方法通过以下步骤实现一、复合膜的制备将15g醋酸纤维素60°C下溶于85g 二甲基甲酰胺中得到铸膜液。将聚四氟乙烯膜先用0. lmol/L的NaOH溶液和0. lmol/L的HCl溶液清洗，然后用去离子水清洗，真空干燥后，平铺在洁净的玻璃板上。控制厚度，将醋酸纤维素铸膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，在室温下挥发适当的时间完成干相转换后，浸入去离子水完成湿相转换。1 后用去离子水清洗，自然干燥待用；二、磷脂酶的固定化取若干份Icm2 的醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和pH = 5. 0的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液，搅拌吸附一定时间。反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活。三、酶活力的测定，四、固定化条件的优化分别在酶液浓度 0. 02g/mL 0. 07g/mL,吸附时间 Ih 6h，温度 45 70°C，搅拌速度 80r/min ^Or/min 的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、采用响应面法进行分析讨论最终确定最佳固定化条件。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/ 聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 04g/mL 0. 06g/mL的条件下进行磷脂酶的吸附固定。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL的条件下，吸附固定池 4h。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL,吸附时间1 Mi的条件下，温度为阳 65°C。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL,吸附时间1 他，温度 45 70°C的条件下，搅拌速度160r/min MOr/min。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤五中采用响应面分析法进一步分析最佳固定化条件。其它步骤与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.一种用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的方法，其特征在于用复合膜来固定化磷脂酶的方法通过以下步骤实现一、复合膜的制备将15g醋酸纤维素60°C下溶于8 二甲基甲酰胺中得到铸膜液。将聚四氟乙烯膜先用0. lmol/L的NaOH溶液和0. Imol/ L的HCl溶液清洗，然后用去离子水清洗，真空干燥后，平铺在洁净的玻璃板上。控制厚度， 将醋酸纤维素铸膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，在室温下挥发适当的时间完成干相转换后，浸入去离子水完成湿相转换。1 后用去离子水清洗，自然干燥待用；二、磷脂酶的固定化取若干份Icm2的醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和PH = 5.0的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液，搅拌吸附一定时间。反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活。三、酶活力的测定。四、固定化条件的优化分别在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL,吸附时间Ih 他，温度45 70°C，搅拌速度80r/min ^Or/min的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、 采用响应面法进行分析讨论最终确定最佳固定化条件。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。
2.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 04g/mL 0. 06g/mL的条件下进行磷脂酶的吸附固定。
3.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL的条件下，吸附固定 4h。
4.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL，吸附时间1 6h的条件下，温度为55 65°C。
5.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在酶液浓度0. 02g/mL 0. 07g/mL，吸附时间1 6h，温度45 70°C的条件下，搅拌速度160r/min MOr/min。
6.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤五中采用响应面分析法进一步分析最佳固定化条件。
全文摘要
本发明提供一种以醋酸纤维素和聚四氟乙烯膜为材料制备了醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜，采用物理吸附固定化方法，用该复合膜来固定化磷脂酶。研究了酶液浓度、吸附时间、温度和搅拌速度等不同固定化条件对脂肪酶固定化效率和催化效果的影响，并采用响应面的分析方法。通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。根据本发明中复合膜的吸附特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产，最终得到的固定化酶活为4U/cm2，明显高于文献中单膜法固定化磷脂酶的活力。
文档编号C12N11/08GK102304504SQ201110290429
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者于殿宇, 刘晶, 周晓丹, 常云鹤, 张佳宁, 时敏, 李志平, 李越, 江连洲, 王立琦, 王雪, 胡立志, 陈晓慧 申请人:东北农业大学