专利名称：红椿菌AUH-Julong21及其在甘草素转化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种菌株及其应用，尤其是一种红椿菌AUH-JUlong21及其在甘草素转化中的应用。
背景技术：
甘草(Licorice roots)是一味古老的中药材，在我国古代医药典籍中多有记载， 迄今已有几千年的使用史。甘草具有保肝、祛痰止咳、清热解毒、补脾益气、抗菌消炎、抗癌、 降糖、免疫调节、神经保护等多种功效，临床上主要用于治疗呼吸系统、消化系统和免疫系统等疾病。由于甘草对多种疾病均具良好的预防和治疗作用，尤其是甘草毒副作用低，对甘草中药理活性物质的研究和挖掘已成为国内外研究热点。甘草中的黄酮和酚类是甘草中的标志性化合物，目前从甘草中已分离得到300多种三萜皂苷和甘草黄酮类化合物。甘草苷(Liquiritin，简称LQ)是甘草中含量较高的黄酮成分之一，有研究表明，LQ在酸性条件下或在人肠道微生物菌群产生的葡萄糖苷酶作用下，可被水解为甘草素(Liquiritigenin，简称LG)。已有研究表明，LG是Akt蛋白激酶抑制剂，也是有较高选择性的雌激素受体激动剂，对肝细胞等具有保护作用。甘草不管是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，甘草中的众多药理活性成分具有被寄居在胃肠道的微生物菌群降解为不同代谢产物的可能性。1998年，Li等(Miological and Pharmaceutical Bulletin, 1998，12:1251-1257)在人尿液检测到了甘草代谢产物达维荚莲苷元(Davidigenin，简称DG)，而DG在天然甘草提取物物中未能检测到，故推测人体肠道微生物菌群可将LG转化为DG。此后，Zuo等的研究结果进一步证实LG可被人肠道微生物菌群代谢为 DG {Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 25:558-563)，然而，迄今国内外尚未见任何利用单一微生物菌株将LG转化为DG的报道。目前虽在某些植物中，如Vibui^um davidii Franch，Caprifoliaceae等，有分离得到天然DG的报道，但天然DG在植物细胞中的含量极低，试图从天然植物中去规模化提取DG几乎是不可能的。有关DG的化学合成方法已有报道，但大多是通过在无氧条件下提供昂贵的化学催化剂钯经化学加氢来完成(历aro aio^r，1997，11 125-231 )，所需成本高，且易造成环境污染。由于DG资源匮乏，有关其生理活性方面研究报道较少，但从目前已有研究结果看，DG除具有与LG相似的生理功能，如止咳、降糖等外，还表现出不同于LG的一些生理功能，如抑制人肺细胞纤维化，抗过敏和抗痉挛等。随着DG生理功能研究的不断深入，这意味着DG今后极有可能开发为不同于目前甘草药效的其他新药。
发明内容
本发明解决了 DG资源缺乏的问题，提供一种红椿菌AUH-Jul0ng21及红椿菌 AUH-Julong21将甘草素高效转化为DG的方法。本发明采取的技术方案为
一种红椿菌(Cbrio如cieri腫 sp. ) AUH-Julong21，保藏号为 CGMCC No. 5306。
W^M Coriobacterium sp. AUH_Julong21 (EU919864)是从人粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将中药甘草提取物的水解物粗品(即甘草素粗品)高效转化为DG。由于甘草素与甘草素异构体在适宜酸碱条件下可能会相互转化，经推测是甘草素粗品在菌株Goridmcteriim sp. AUH-Julong21 (为方便书写， 在这里将菌株Coriobacterium sp. AUH-Julong21简称Julong21，以下均使用该转化菌株的简称形式，菌株Julong21与H Coriobacterium sp. AUH-Julong21为同一菌株)的培养物中首先自发转变为异甘草素，异甘草素再在菌株Julong21分泌的还原酶作用下被加氢还原成DG，有关DG微生物生物合成途径推测如下所示。
权利要求
1.一种红椿菌(Cbrio如Cieri腫 sp. ) AUH-Julong21，保藏号为 CGMCC No. 5306。
2.根据权利要求1所述的红椿菌AUH-JUlong21在甘草素转化中的应用，其特征在于包括下述步骤(1)菌株Julong21的培养将低温冷冻保存的红椿菌Julong21融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37°C下培养M小时；再以10%接种量将试管中的菌株 Julong21重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18- 小时作为种子液；(2)底物甘草素粗品与菌株JUlong21共培养与代谢产物的分离纯化①底物甘草素粗品与菌株Julong21共培养将菌株JUlong21的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，根据甘草素粗品母液中底物甘草素浓度40-60毫摩尔/升及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使得甘草素在培养基中的浓度为0. 2-0. 8毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2-3天，即可将底物甘草素粗品高效转化为达维荚莲苷元；②代谢产物的分离纯化用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备代谢产物。
全文摘要
本发明公开了一种红椿菌AUH-Julong21及其在甘草素转化中的应用，红椿菌(Coriobacteriumsp.)AUH-Julong21，保藏号为CGMCCNo.5306。将菌株Julong21的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，加入甘草素粗品，在厌氧工作站内培养2-3天；用乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上对产物进行分离制备。本发明的菌株能将甘草素粗品高效转化为达维荚蒾苷元，当浓度为0.4-1.6毫摩尔/升时，产物达维荚蒾苷元对二苯代苦味酰基自由基(DPPH)的体外清除率极显著高于底物甘草素(p<0.01)。
文档编号C12R1/01GK102367424SQ20111029679
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者张红蕾, 王秀伶, 王铭 申请人:河北农业大学