专利名称：一种发酵培养微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物培养方法，尤其是一种适用于芽孢杆菌的培养方法。
背景技术：
在微生物领域，常常涉及到菌种的培养、增殖，使菌株在一定的温度条件下、在适宜的培养基中增殖以扩大数量，满足该菌种在人用药、兽用药、饲料、养殖等领域的使用需要。尤其是对于芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、酪酸梭菌等，都需要在发酵罐内进行发酵、增殖，使活菌数量显著增加。根据微生物生命周期理论，微生物生长过程可分为适应期、对数生长期、平衡期、 死亡期。平衡期后的微生物因生长过程中底物浓度的降低、代谢产物的抑制、PH值的变化等生长环境的恶化及自身遗传特性的影响导致微生物生长繁殖受到抑制，活菌数量开始减少，最终大量死亡。目前，国内芽孢杆菌(如，酪酸梭菌)发酵主要采用传统的分批低密度法发酵，该方法具有发酵液菌浓度低、菌粉活菌数不高，发酵系数低，产量低，能耗高，成本高等缺点。
发明内容
本发明针对现有技术中微生物发酵主要采用传统的分批低密度法发酵方法存在的发酵液菌浓度低、菌粉活菌数不高，发酵系数低，产量低，能耗高，成本高等不足，提供一种发酵培养微生物的方法；该方法能大幅度提高芽孢杆菌(如酪酸梭菌)发酵液活菌数、大幅度提高发酵系数和产品质量，大大降低能耗和生产成本。本发明的技术方案一种发酵培养微生物的方法，其特征在于包含如下工艺步骤
(1)选择合适的芽孢杆菌生产种子，采用常规的分离纯化处理，使菌种活化；
(2)一级种子培养将活化后的芽孢杆菌菌种接种至一级种子液体培养基中，30-40°C 培养6-24小时；
(3)一级种子液热处理对步骤(2)所得的一级种子液进行热处理处理温度60— 90°C，时间5—60分钟；
(4)二级种子培养将热处理后的一级种子接入二级种子液体培养基中，30-40°C培养 6-24小时；
(5)二级种子液热处理对步骤(4)所得的二级种子液进行热处理处理温度60— 90°C，时间5—60分钟；
(6)三级种子培养将热处理后的二级种子接入三级种子液体培养基中，30-40°C培养 6-24小时；
(7)三级种子液热处理对步骤(6)所得的三级种子液进行热处理处理温度60—90°C，时间5—60分钟；
(8)三级种子液冷处理对步骤(7)中热处理后的三级种子进行冷处理处理温度2— 25°C，时间6—48小时；
(9)发酵培养将步骤(8)中进行了冷处理的三级种子接入液体培养基中，在发酵罐内培养16-36小时，使其活菌数及芽孢数量倍增；并根据动态检测发酵培养过程中的实时数据，实时向发酵罐内补充液体培养基和/或碱，发酵培养过程中的实时数据主要包括温度、 C02浓度、pH值、残糖、菌浓度、溶氧等；加入的碱为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种，或两种以上的混合物。(10)对步骤(9)中发酵液进行常规的离心分离、干燥，即得菌粉。以上所述的液体培养基，指一级、二级、三级种子液体培养基，其包括如下重量百分比的组分蛋白胨0. 2%—3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氢钾 0. 01%—0. 5%，硫酸镁 0. 01%—0. 5%，其余为水。液体培养基的另外一种配方，其包括如下重量百分比的组分蛋白胨0.2%— 3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氢钾0. 01%— 0. 5%，磷酸氢二钾0. 01-0. 05%，硫酸镁0. 01%—0. 5%，碳酸钙0. 01-2. 0 %，其余为水。本发明根据微生物的生长规律，通过选育优良种子、改善生长环境、提高种子对菌群密度的适应能力达到较高的发酵液菌浓度。通过连续补料维持生长的最适底物浓度；通过连续补碱保证芽孢杆菌(酪酸梭菌)生长的最适PH值；通过发酵过程在线检测与控制系统维持芽孢杆菌(酪酸梭菌)生长的最适环境条件(温度、压力、厌氧等)。从而保证发酵得到的菌液菌浓度达到较高的水平。本发明的一种发酵培养微生物的方法，具有如下优点
1、大幅度提高发酵液活菌数(提高10倍)，大幅度提高发酵系数(提高10倍)，产量高， 能耗低，成本低，产品质量标准提高5倍。2、实现操作简单、工艺灵活操作，大大减少染菌、菌种退化等问题，整个发酵过程实现优化控制，目的产物转化率大大提高。3、种子经过热处理和冷处理后发酵培养过程中微生物实现同步生长，所获得的菌粉活菌数高，芽孢成熟快，芽孢转化率高，发酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高。4、本发明能促进我国微生态药物工业的发展，进而为患者减轻医疗负担，提高人民生活质量和水平。
具体实施例方式本发明一种发酵培养微生物的方法，其包含如下工艺步骤
1、按照工艺要求，选择合适的芽孢杆菌生产种子，采用常规的分离纯化处理，使菌种活化、复苏；
2、一级种子培养将活化后的芽孢杆菌菌种接种至一级种子液体培养基中，30-40°C培养6-24小时；
3、一级种子液热处理对步骤2所得的一级种子液进行热处理处理温度60—90°C，时间5 — 60分钟；热处理的作用，增加微生物生长的同步性、提高微生物对较高温度的适应能力，选得的菌种更耐高温，不能适应高温的菌种被淘汰；
4、二级种子培养将热处理后的一级种子接入二级种子液体培养基中，30-40°C培养 6-24小时；
5、二级种子液热处理对步骤4所得的二级种子液进行热处理处理温度60—90°C，时间5 — 60分钟；
6、三级种子培养将热处理后的二级种子接入三级种子液体培养基中，30-40°C培养 6-24小时；
7、三级种子液热处理对步骤6所得的三级种子液进行热处理处理温度60—90°C，时间5 — 60分钟；
8、三级种子液冷处理对步骤7中热处理后的三级种子进行冷处理处理温度2— 25°C，时间6— 48小时；
冷处理的作用，增加微生物生长的同步性、提高微生物对较低温度的适应能力，选得的菌种更耐低温，不能适应低温的菌种被淘汰；
菌种经过热处理和冷处理，在发酵培养过程中微生物实现同步生长，所获得的菌粉活菌数高，芽孢成熟快，芽孢转化率高，发酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高，酪酸梭菌活菌胶囊活菌数提高5倍。9、发酵培养将步骤8中进行了冷处理的三级种子接入液体培养基中，在发酵罐内培养16-36小时，使其活菌数及芽孢数量倍增；并根据动态检测发酵培养过程中的实时数据，实时向发酵罐内补充液体培养基和/或碱，发酵培养过程中的实时数据主要包括温度、C02浓度、pH值、残糖、菌浓度、溶氧等，都是发酵培养过程中的常规指标和数据；
发酵罐内的温度在30— 45°C，最佳温度为37°C ；
在发酵过程中，需要进行发酵过程PH值在线监测与控制、发酵过程C02在线监测、发酵过程溶氧在线监测系统、发酵过程温度、压力在线监测与控制、发酵过程氧化还原电位在线监测与控制，获得发酵罐内的实时数据，根据实时数据向发酵罐内连续或断续(而且实时) 补充液体培养基和/或碱；满足工艺要求的保持充足但又较低浓度的营养物的需要。加入的碱为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种，或两种以上的混合物。10、对步骤9中进行发酵处理后的发酵液进行常规的离心分离、干燥，即得菌粉。所述的一级、二级、三级种子液体培养基，可以选用现有技术中适合芽孢杆菌的液体培养基；本发明提供两种具体的、区别于现有技术的液体培养基，其包括如下重量百分比的组分
蛋白胨0. 2%—3. 0%,，酵母膏0. 3%—2. 0%,葡萄糖0. 3%—5. 5%,磷酸二氢钾0. 01%— 0. 5%，硫酸镁0. 01%—0. 5%，其余为水。液体培养基的另外一个配方为蛋白胨0. 2%—3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏 0. 3%—2. 0%,葡萄糖 0. 3%—5. 5%,磷酸二氢钾 0. 01%—0. 5%,磷酸氢二钾 0. 01-0. 05%,硫酸镁0. 01%—0. 5%，碳酸钙0. 01-2. 0 %，其余为水。本发明采用的高密度发酵技术(High cell density culture,简称HCDC)，实际上就是指补料分批发酵，该技术是在分批培养的前提下，连续或按某一规律向发酵系统中补充营养物，使发酵系统保持充足但又较低浓度的营养物，其优点在于消除了快速利用碳源后造成阻遏效应，避免了抑制性副产物的积累，避免了菌体快速生长而造成质粒不稳定的问题。该技术替代传统发酵工艺进行芽孢杆菌(酪酸梭菌)的工业化生产，能实现酪酸梭菌发酵液活菌数提高10倍，发酵系数提高10倍，产品质量标准提高5倍，大大降低能耗和生产成本，从而推动人体肠道益生菌的市场竞争能力，促进我国微生态药物工业的发展，进而为患者减轻医疗负担，提高人民生活质量和水平。
权利要求
1.一种发酵培养微生物的方法，其特征在于包含如下工艺步骤(1)选择合适的芽孢杆菌生产种子，采用常规的分离纯化处理，使菌种活化；(2)一级种子培养将活化后的芽孢杆菌菌种接种至一级种子液体培养基中，30-40°C 培养6-24小时；(3)一级种子液热处理对步骤(2)所得的一级种子液进行热处理处理温度60— 90°C，时间5—60分钟；(4)二级种子培养将热处理后的一级种子接入二级种子液体培养基中，30-40°C培养 6-24小时；(5)二级种子液热处理对步骤(4)所得的二级种子液进行热处理处理温度60— 90°C，时间5—60分钟；(6)三级种子培养将热处理后的二级种子接入三级种子液体培养基中，30-40°C培养 6-24小时；(7)三级种子液热处理对步骤(6)所得的三级种子液进行热处理处理温度60— 90°C，时间5—60分钟；(8)三级种子液冷处理对步骤(7)中热处理后的三级种子进行冷处理处理温度2— 25°C，时间6—48小时；(9)发酵培养将步骤(8)中进行了冷处理的三级种子接入液体培养基中，在发酵罐内培养16-36小时，使其活菌数及芽孢数量倍增；并根据动态检测发酵培养过程中的实时数据，实时向发酵罐内补充液体培养基和/或碱；(10)对步骤(9)中发酵液进行离心分离、干燥，即得菌粉。
2.根据权利要求1所述发酵培养微生物的方法，其特征在于所述的液体培养基，其包括如下重量百分比的组分蛋白胨0. 2%—3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氢钾0. 01%—0. 5%，硫酸镁0. 01%—0. 5%，其余为水。
3.根据权利要求1或2所述发酵培养微生物的方法，其特征在于所述的液体培养基， 蛋白胨0. 2%—3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氢钾 0. 01%—0. 5%,磷酸氢二钾 0. 01-0. 05%,硫酸镁 0. 01%—0. 5%,碳酸钙 0. 01-2. 0 %，其余为水。
4.根据权利要求1或2所述发酵培养微生物的方法，其特征在于所述的碱为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种，或两种或两种以上的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种发酵培养微生物的方法，其工艺步骤为对合适的芽孢杆菌生产种子经一级种子培养后热处理，处理温度60—90℃，时间5—60分钟；二级种子培养后热处理三级种子培养后热处理和冷处理进行了冷处理的三级种子接入液体培养基中，在发酵罐内培养16-36小时；并根据动态检测发酵培养过程中的实时数据，实时向发酵罐内补充液体培养基和/或碱。本发明的方法，大幅度提高发酵液活菌数、发酵系数，产量高，能耗低，成本低，产品质量标准提高；种子经过热处理和冷处理后发酵培养过程中微生物实现同步生长，所获得的菌粉活菌数高，芽孢成熟快，芽孢转化率高，发酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高。
文档编号C12N1/20GK102337238SQ201110297489
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者尚玉新, 江苏华 申请人:重庆泰平药业有限公司