戊糖发酵微生物的制作方法
【专利摘要】本发明提供能够利用C5糖特别是木糖的微生物真核细胞。本发明的另一目的是提供使得真核细胞能够降解C5糖的改进的蛋白序列。因此，本发明提供包含与SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.8具有至少75％同一性、优选80％同一性、最优选90％同一性、最高度优选95％同一性的氨基酸序列且在真核细胞中具有木糖异构酶活性的蛋白。
【专利说明】戊糖发酵微生物
【技术领域】
[0001] 木糖是植物生物质的主要基础材料，并与现今生物精炼观点聚焦的大量主要原 料紧密相关。这类富含木糖的材料的实例包括麦秸、玉米秸杆或木片或其它木材副产品 (Blake A Simmons 等人· Genome Biol. 2008 ;9 (12) : 242)。
[0002] 因此，通过酶促、化学或化学/酶促方法进行的起始材料的水解产生了其他有价 值的糖之外的富含木糖的中间产物（Deepak Kumar等人.Biotechnol Biofuels. 2011; 4:27)。在耦合发酵路线中对富含C5的糖溶液的高效利用对于应用的发酵菌株既是至关重 要的，也是必需的（Sara Fernandes and Patrick Murray, Bioeng Bugs. 2010 ; 1(6) :424)。 特别地，C6酵母（如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))由于较长历史的培育（最终 以极端耐乙醇和葡萄糖转化高产量为特点）而成为理想的工作平台，使得木糖完全不受影 响，从而降低了潜在产量。已知的几种策略可以避免这种缺陷。此处的关键步骤似乎为通 过将木糖异构化为木酮糖以及随后的C5非还原部分分流到酿酒酵母的常规糖酵解途径的 修饰级联而成功地供料木糖。虽然对通过特定转运蛋白的跨膜摄取木糖的强度和通过C5 旁路可达到的通量密度进行了可能的改进（David Runquist等人Microb Cell Fact. 2009; 8:49)，但是木糖到木酮糖的关键异构化步骤在整个过程中成为主要问题。为进行该步骤已 知有两种主要途径。第一，采用还原成木糖醇（通过木糖还原酶）和氧化（通过木糖醇脱 氢酶）成木酮糖的后续步骤，导致NADH和NADPH辅因子之间的极大不平衡，并导致木糖醇 在发酵条件下的形成增加 （Maurizio Bettiga 等人.Biotechnol Biofuels. 2008 ;1:16)。 应用木糖异构酶的备选的直接异构化途径问题在于如下的木糖异构酶基因的可得性不足， 其兼具有在真核微生物（特别是酵母，例如酿酒酵母）中的活性表达、高催化效率、与发酵 温度相适的温度和最适pH以及副产物尤其是木糖醇的低抑制。本发明的一个方面是满足 此需求的蛋白质序列及编码其的核酸的公开内容。
[0003] 木糖异构酶途径对于细菌物种和极少的酵母是原生的。相较于氧化还原酶途径， 异构酶途径不需要辅因子。异构酶途径最少由单一的酶--异源木糖异构酶（XI)组成，其 直接将木糖转化为木酮糖。就氧化还原酶途径而言，通过共表达异源木酮糖激酶0?)可以 获得广率的进一步提1?。
[0004] 首次功能性表达的XI是来源于厌氧真菌Piromyces物种E2(Kuyper M.等人FEMS Yeast Res. 2003 ;4(1):69)的xylA基因。构建了在厌氧条件下能发酵作为唯一碳源的木糖 的单倍体酵母菌株。大部分木糖异构酶是细菌蛋白并且主要障碍是其在酵母中的表达。然 而近期的研究已经证实酵母中的功能性表达（表1)。由于木糖异构酶活性在C5发酵生物 体理念中的关键重要性，希望使用最佳的木糖异构酶。就这方面而言，从先前的报道我们得 知Clostridium phytofermentans木糖异构酶提供了较低但却是可得的最高的技术标准。 因此非常期待在本发明范围内改进木糖异构酶的有益特性。
[0005] 表1 :所主张的应用于酵母中的木糖异构酶实例
[0006]
【权利要求】
1. 一种蛋白，其包括与SEQ ID NO. 2具有至少75%同一性、优选80%同一性、最优选 90%同一性、最高度优选95%同一性的氨基酸序列且在真核细胞中具有木糖-异构酶活 性。
2. 根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID N0.2的序列组成，或由与SEQ ID NO. 2具有至少75%同一性、优选80%同一性、最优选90%同一性、最高度优选95%同一 性的氨基酸序列组成并且在真核细胞中具有木糖-异构酶活性。
3. 根据权利要求1或2所述的蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID N0.8的序列组成，或由与 SEQ ID NO. 8具有至少75%同一性、优选80%同一性、最优选90%同一性、最高度优选95% 同一性的氨基酸序列组成并且在真核细胞中具有木糖-异构酶活性。
4. 根据权利要求1-3中的一项或多项所述的蛋白，其在7. 5-8. 5的pH范围内显示出最 佳的木糖-异构酶活性。
5. 根据权利要求1-4中的一项或多项所述的蛋白，其能通过从真核细胞表达而获得。
6. -种DNA分子，其包括编码根据权利要求1-5中的一项或多项所限定的蛋白的DNA 序列，其中所述DNA序列可操作地连接至真核调节序列。
7. 根据权利要求6所述的DNA分子，其中所述DNA分子由SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7 的序列组成。
8. -种真核细胞，其表达根据权利要求1-5中的一项或多项所述的蛋白，和/或包含根 据权利要求6或7所述的DNA分子。
9. 根据权利要求8所述的真核细胞，其中所述真核细胞为酵母细胞，优选选 自毕赤酵母属（Pichia)、管囊酵母属（Pachysolen)、耶氏酵母属（Yarrowia)、酵母 属（Saccharomyces)、念珠菌属（Candida)、Arxula 属、Ashbya 属、德巴利酵母属 (Debaryomyces)、汉逊酵母属（Hansenula)、Hartaea 属、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、 许旺酵母属（Schwanniomyces)、丝抱酵母属（Trichosporon)、Xanthophylomyces 属、裂殖 酵母属（Schizosaccharomyces)、接合酵母属（Zygosaccharomyces)，最优选为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)〇
10. -种基因改造的酵母细胞，其包括在所述酵母细胞中有功能的外源木糖异构酶基 因，其中所述外源木糖异构酶基因可操作地连接至在所述酵母细胞中有功能的启动子和终 止子序列，引起根据权利要求1-5所述的蛋白的表达。
11. 根据权利要求10所述的基因改造的酵母细胞，其中所述外源木糖异构酶基因为根 据权利要求6或7所述的DNA分子。
12. 根据权利要求10或11所述的基因改造的酵母细胞，其中所述基因改造的酵母 细胞选自毕赤酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属、酵母属、念珠菌属、Arxula属、Ashbya 属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、Hartaea属、克鲁维酵母属、许旺酵母属、丝孢酵母属、 Xanthophylomyces属、裂殖酵母属、接合酵母属，优选为酿酒酵母。
13. -种真核细胞，其具有通过用根据权利要求6或7所述的DNA序列转化野生型酵母 菌株而得到的增加水平的木糖异构酶活性。
14. 根据权利要求8-13中的一项或多项所述的真核细胞，其中所表达的蛋白由SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 8的序列组成。
15. 根据权利要求13或14所述的真核细胞，其中所述酵母菌株选自毕赤酵母属、管囊 酵母属、耶氏酵母属、酵母属、念珠菌属、Arxula属、Ashbya属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、 Hartaea属、克鲁维酵母属、许旺酵母属、丝孢酵母属、Xanthophylomyces属、裂殖酵母属、 接合酵母属，优选为酿酒酵母。
16. 根据权利要求1-5中的一项或多项所述的蛋白或根据权利要求8-15中的一项或多 项所述的细胞用于从含木糖-碳源的培养基发酵生物质的用途。
17. 根据权利要求1-5中的一项或多项所述的蛋白或根据权利要求8-15中的一项或多 项所述的细胞作为生物催化剂原位用于或以纯化的形式用于生产异构化的糖产物或中间 体的用途，优选生产异构化的糖产物的用途。
18. 根据权利要求6或7所述的DNA分子用于真核细胞转化的用途。
19. 根据权利要求18所述的用途，其中所述转化产生根据权利要求8-15中任一项所述 的真核细胞。
20. 根据权利要求8-15中的一项或多项所述的真核细胞用于实现增加的木糖消耗率 的用途。
21. 使用酵母从木糖或葡萄糖-木糖混合物生产乙醇的方法，其中酵母表达根据权利 要求1-5中的一项或多项所述的蛋白，优选为酿酒酵母。
22. 生产选自乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素、 头孢菌素、生物燃料、丁醇、乙醇、乳酸、衣康酸的发酵产物的方法，所述发酵产物优选为丁 醇，最优选为乙醇，其中所述方法包括以下步骤： a) 以权利要求8-15中的任一项所限定的细胞发酵含有木糖来源的培养基，和任选地， b) 回收所述发酵产物。
【文档编号】C12N9/90GK104204202SQ201380018485
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年2月7日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】Z·德拉戈维奇, C·加默夫, C·赖辛格, U·克特林 申请人:科莱恩产品（德国）有限公司