专利名称：微生物细胞固定化载体及相关应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞固定技术领域，特别涉及微生物细胞固定技术领域，更具体地，是指一种微生物细胞固定化载体及相关应用。
背景技术：
细胞的固定化在细胞催化工业应用中扮演着重要角色。目前，细胞的固定化主要有物理和化学两种方法(Food MiCrObiOlOgH2004)，21 :377-397)。物理方法主要是采用有机和无机多孔材料吸附或大分子包埋等手段对细胞进行固定化。吸附固定细胞是利用多孔材料和细胞表面之间的静电引力作用将细胞固定在多孔材料的表面，虽然对细胞的活性影响最小，但固定化效率不高，且细胞与载体之间的弱作用力导致在进行反应时由于搅拌或溶剂的作用等造成细胞脱落，影响细胞的重复利用率。而包埋法虽然细胞可以被牢牢地固定在载体内，固定化效率较高，但由于细胞被完全包裹，影响底物和转化产物的传递，造成固定化细胞的催化效率较低。化学交联方法是采用化学交联剂通过共价键将细胞固定在载体的表面，该方法虽然可以将细胞很好固定，也不存在底物和产物的传输问题，但交联通常需要有机溶剂和化学交联剂参与，而有机溶剂和化学交联剂对细胞毒性较大，对细胞的生物催化活性会产生不利的影响。此外，还有细胞自凝聚固定化方法，但这项技术只适合某些表面能够表达凝聚蛋白的特定细胞，不具备普遍性。纵观细胞固定化技术，虽然最近十年来得到了很大的发展、应用。但到目前为止，仍然停留在原有技术原理的基础上，没有出现概念新颖的细胞固定化技术手段。生物仿生黏附材料是最近十几年，通过对海洋贻贝类生物黏附蛋白结构组成的剖析研究基础上发展而来。研究发现在海洋贻贝类生物黏附蛋白中富含3，4_ 二羟基苯丙氨酸(DOPA)，进一步的研究发现DOPA及其邻苯二酚衍生物具有一个关键的特性，即能与有机体和无机物表面形成强烈的粘连，是贻贝类生物以及其它生物黏附蛋白中的重要的黏附功能性基团，它能与金属及其氧化物表面耦合，还能在弱碱性或若氧化剂存在的条件下与有机物表面的氨基或巯基发生Michael加成或希夫碱反应，牢固地粘附在这些物体的表面。更为重要的是这种黏附是可以在水溶液环境下进行，且在一般情况下是不可逆的 (Science (2007), 318 :426-430) 0这一特性使得这种新型仿生材料在医学、工程、涂料等领域具有良好的应用前景。已有国外研究者将该仿生材料应用于人体组织裂痕修复。但没见到将这种新型仿生材料用于细胞固定化的报道。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种微生物细胞固定化载体及相关应用，该微生物细胞固定化载体设计巧妙，能够简单方便地将微生物细胞固定在有机或无机载体上，且固定化效率高，细胞活性不受影响，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种微生物细胞固定化载体，其特点是，所述微生物细胞固定化载体采用含有邻苯二酚(catechol)结构的化合物修饰无机载体或有机载体而得到。较佳地，所述的含有邻苯二酚结构的化合物是多巴(DOPA)、多巴胺(dopamine)、 3，4- 二羟基苯甲胺、3，4- 二羟基苯甲醛、3，4- 二羟基苯乙醛、3，4- 二羟基苯甲酸或3，4- 二
羟基苯乙酸。较佳地，所述无机载体是硅藻土、硅胶粉、湖珊瑚石、分子筛、高岭土、金属氧化物、 金属氧化物纳米粒子、微孔陶瓷或微孔玻璃。较佳地，所述有机载体为高分子聚合物或多糖。更佳地，所述高分子聚合物为大孔树脂类、离子交换树脂类、环氧树脂类或氨基树脂。更佳地，所述多糖为纤维素、纤维素衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、环糊精、变性淀粉、褐藻胶、角叉藻胶或琼脂。在本发明的第二方面，提供了上述的微生物细胞固定化载体在固定化微生物细胞中的应用。较佳地，所述微生物细胞为细菌细胞、霉菌细胞或酵母菌细胞。更佳地，所述细菌细胞为球菌、螺旋菌、放线菌、杆菌或其基因工程菌；，所述霉菌细胞为根霉、毛霉、青霉、曲霉、木霉、或头孢霉；所述酵母细胞为毕赤酵母。更进一步地，所述杆菌包括大肠杆菌、醋酸杆菌、氧化葡糖酸杆菌、结核杆菌和乳酸杆菌。本发明的有益效果具体在于本发明的微生物细胞固定化载体采用含有邻苯二酚结构的化合物修饰无机载体或有机载体而得到，该微生物细胞固定化载体设计巧妙，能够简单方便地将微生物细胞固定在有机或无机载体上，且固定化效率高，细胞活性不受影响， 适于大规模推广应用。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。实施例1以纳米氧化铁为例固定化大肠杆菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入1. Og磁性纳米氧化铁，用0. Imol/ L NaOH调pH为8. 5，搅拌1小时，用磁铁分离，用纯水洗涤2次固体，对照组是不加多巴胺盐酸盐的磁性纳米氧化铁。2、将大肠杆菌(E. coli)加水配成0D_为20左右的溶液，取5ml菌体加入上述5ml 磁性氧化铁材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用磁铁分离固体，用纯水洗涤2次固体，测上清液OD值，通过间接方法即得固定化的大肠杆菌(E. coli)，有多巴胺盐酸盐的氧化铁的固定化率为96. 4%，对照组的固定化率为79. 6%。3、测定细胞固定化率采用下式计算
....................缝又OD 4、活性评价本实验用的大肠杆菌是产腈水解酶重组的大肠杆菌，能催化3-氰基吡啶生成尼克酸。将上述固定化的细胞加入到30ml pH7.0的PB缓冲液中，3-氰基吡啶初始浓度为lmol/L的体系中，每隔5小时取样，通过Agilent 1100HPLC测产物含量。检测条件分析柱为安捷伦)(DB-C18，流速0. 8ml/min,检测波长230nm，流动相为体积比5 95的乙腈与0. 1 %稀磷酸，柱温30°C。固定化细胞在催化4 后转化率为73. 45%,对照组的只有 53. 28% ·实施例2以纳米氧化铁为例固定化酵母菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入0. 5g磁性纳米氧化铁，用0. Imol/ LNaOH调pH为8. 5，搅拌1小时，用磁铁分离，用纯水洗涤2次固体，对照组是不加多巴胺盐酸盐的磁性纳米氧化铁。2、将酵母菌加水配成OD6tltl为20左右的溶液，取5ml菌体加入上述5ml磁性氧化铁材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用磁铁分离固体，用纯水洗涤2次，测上清液OD值，通过计算即得固定化的酵母菌，含多巴胺盐酸盐的氧化铁的固定化率为95.6%，对照组的固定化率为80. 3%03、活性评价通过酵母菌转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇。将上述固定的细胞加入30mlpH6. 8，L-苯丙氨酸浓度10g/L的PB缓冲液中催化反应40小时，产物进行气相色谱分析。检测条件色谱柱为PEG20M(30mX0. 53mmX 1. 5nm)，FID检测器，载气为N2，柱箱温度采用程序控温，初始温度为80°C，初始温度保持时间2min，终止温度为220°C，升温速率为10°C、min，终止温度保持时间为5min，进样器和检测口温度均为250°C。固定化细胞的转化率达到41. 47%，对照组的转化率为26. 78%。实施例3以纳米氧化铁为例固定化氧化葡萄糖酸杆菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入0. 5g磁性纳米氧化铁，用0. Imol/ L NaOH调pH为8. 5，搅拌1小时，用磁铁分离，用纯水洗涤2次固体，对照组是不加多巴胺盐酸盐的磁性纳米氧化铁。2、将氧化葡萄糖酸杆菌湿菌体G加水配成OD6tltl为3的溶液，取5ml菌液加入上述 5ml磁性氧化铁材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用磁铁分离固体，用纯水洗涤2次，即得固定化的氧化葡萄糖酸杆菌。测上清液OD值，计算获得固定化率为98. 9%，对照组的固定化率为84.8%。3、活性评价通过氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成2-羟基丙酮。取5ml甘油溶于 30mlpH = 6. 5的磷酸盐缓冲液中，加入上述固定的细胞进行连续培养反应。每隔2小时取样，通过Agilent 1100HPLC测2-羟基丙酮的含量。分析条件为色谱柱为ICE-99-9861， ICSep Coregel87H3，柱温 35°C，流动相为 0. 004mol/L 的 H2SO4,流速为 0. 4ml/min，进样量为10 μ 1，波长为210nm。结果反应15批次后，含多巴胺盐酸盐的氧化铁转化率可达69%， 对照组的转化率为40%。实施例4以纳米氧化铁为例固定化巴氏毕赤酵母1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入0. 5g磁性纳米氧化铁，用0. Imol/ L NaOH调pH为8. 5，搅拌1小时，用磁铁分离，用纯水洗涤2次固体，对照组是不加多巴胺盐酸盐的磁性纳米氧化铁。2、将巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)配制成120g/L的溶液，取5ml菌液加入上述制备的5ml磁性氧化铁材料中，室温(25°C )震摇30分钟，用磁铁分离固体，用纯水洗涤2次，测上清液OD值，通过间接方法即得固定化的巴氏毕赤酵母，含有多巴胺盐酸盐的氧化铁的固定化率为93. 7%，对照组固定化率为81%。3、生物催化毕赤酵母转化5-邻苯二甲酰亚胺-3-氧代戊酸乙酯为(S)-3_羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯。将上述固定的细胞加入IOml 7g/L的5_邻苯二甲酰亚胺_3_氧代戊酸乙酯中， 35°C震摇12h，转速169rpm，通过Agilent 1100HPLC测定产物的含量，实验平行3次。分析条件色谱柱为XDB-C18 (4. 6mmX 250mm, 5um)，流动相甲醇/水(体积比50/50)，流速 lmL/min,柱温30°C，进样量2uL，波长219nm。游离酵母的产率为94. 94%,固定化酵母的产率为95.31%，ee值均大于99%。实施例5以壳聚糖为例固定化氧化葡萄糖酸杆菌1、将5g脱乙酰壳聚糖(脱乙酰度大于90%)加入500ml纯水中，加入醋酸10ml， 室温搅拌溶解，加入用10g3，4-二羟基苯甲醛溶于50mlDMF配成的溶液，室温搅拌6小时， 用0. Imol/LNaOH调pH为6. 5，过滤，固体用纯水洗涤3次，每次50ml。2、将上述制备的固体加到500ml纯水中，加入醋酸10ml，室温搅拌溶解，加入醋酸硼氰化钠，室温搅拌6小时，用0. Imol/LNaOH调pH为6. 5，过滤，固体用纯水洗涤3次，每次 50ml。即得含有邻苯二酚结构的壳聚糖。3、将0.4g上述制备的壳聚糖溶于IOOml的质量分数2 %的乙酸中，用0. lmol/L NaOH调节pH = 5，加入3ml菌液，边搅拌边用NaOH调节pH至7，测上清液OD值，计算细胞固定化率，对照组是没有修饰过的壳聚糖。含有多巴胺盐酸盐的氧化铁的固定化率为63.7%， 对照组固定化率为21%。4、活性评价氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成2-羟基丙酮。取5ml甘油溶于60ml PH = 6. 5的磷酸盐缓冲液中，加入上述固定的细胞进行连续培养反应。每隔12小时取样， 通过AgilentllOOHPLC测2-羟基丙酮的含量。检测条件同实施例3。结果反应8批次后， 含有邻苯二酚结构的壳聚糖转化率可达67 %，对照组的转化率为51 %。实施例6以纳米氧化铁为例固定化青霉菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入0. 5g磁性纳米氧化铁，用0. Imol/ L NaOH调pH为8. 5，搅拌1小时，用磁铁分离，用纯水洗涤2次固体，对照组是不加多巴胺盐酸盐的磁性纳米氧化铁。2、将青霉菌配制成OD6tltl约为20的溶液，取5ml菌液加入上述制备的5ml磁性氧化铁材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用磁铁分离固体，用纯水洗涤2次，测上清液OD值， 通过间接方法即得固定化的青霉菌，有多巴胺盐酸盐的氧化铁的固定化率为85.6%，对照组的固定化率为64.8%。3、活性评价采用邻一联(二)茴香胺分光光度法测定葡萄糖氧化酶的活性，即在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体即邻一联(二)茴香胺被氧化成棕色产物。于436nm处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。定义酶活单位为26°C每分催化释放一微克分子H2O2所需要的酶量。将上述固定的细胞加入到30ml pH为7的缓冲液中，葡萄糖的浓度为0.4mol/L。30分钟后于436nm处测定吸光度的变化，结果表明固定化的细胞的酶活比对照组的酶活提高了 46. 45%o实施例6以大孔树脂为例固定化氧化葡萄糖酸杆菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入6g大孔树脂，用0. Imol/LNaOH调 PH为8. 5，室温搅拌3小时，抽滤，固体用纯水洗涤3次，每次50ml。对照组是不加多巴胺盐酸盐的大孔树脂。2、将氧化葡萄糖酸杆菌湿菌体G加水配成OD6tltl为3溶液，取Iml菌液加入上述制备的0.5g(湿重)固体材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用砂芯漏斗分离固体，测上清液 OD值，通过间接方法即得固定化的氧化葡萄糖酸杆菌，有多巴胺盐酸盐的氧化铁的固定化率为91. 9%，对照组的固定化率为55. 8%。3、活性评价氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成2-羟基丙酮。取5ml甘油溶于60ml PH = 6. 5的磷酸盐缓冲液中，加入上述固定的细胞进行连续培养反应。每隔12小时取样， 通过AgilentllOOHPLC测2-羟基丙酮的含量。检测条件同实施例3。结果反应6批次后， 含有邻苯二酚结构的壳聚糖转化率可达49. 23%，对照组的转化率为33. 89%。实施例8以硅藻土为例固定化氧化葡萄糖酸杆菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入8g硅藻土，用0. Imol/LNaOH调pH 为8. 5，室温搅拌3小时，抽滤，固体用纯水洗涤3次，每次50ml。对照组是不加多巴胺盐酸盐的硅藻土。2、将氧化葡萄糖酸杆菌湿菌体G加水配成OD6tltl为3的溶液，取Iml菌液加入上述制备的0.5g(湿重)固体材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用砂芯漏斗分离固体，测上清液OD值，通过间接方法即得固定化的氧化葡萄糖酸杆菌，有多巴胺盐酸盐的硅藻土的固定化率为95. 8%，对照组的固定化率为79. 82%。3、活性评价氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成2-羟基丙酮。取5ml甘油溶于60ml PH = 6. 5的磷酸盐缓冲液中，加入上述固定的细胞进行连续培养反应。每隔12小时取样， 通过AgilentllOOHPLC测2-羟基丙酮的含量。检测条件同实施例3。结果反应8批次后， 含有邻苯二酚结构的壳聚糖转化率可达％ 48.四％，对照组的转化率为35. 16%。实施例9以氨基树脂为例固定化大肠杆菌1、将Ig多巴胺盐酸盐溶于500ml纯水中，加入6g氨基树脂，用0. Imol/LNaOH调 PH为8. 5，室温搅拌3小时，抽滤，固体用纯水洗涤3次，每次50ml。对照组是不加多巴胺盐酸盐的氨基树脂。2、将大肠杆菌(E. coli)加水配成浓度OD6tltl约为20的溶液，取Iml菌液加入上述制备的0.5g(湿重)固体材料中，室温(25°C)震摇30分钟，用砂芯漏斗分离固体，测上清液OD值，通过间接方法即得固定化的大肠杆菌(E. coli)，有多巴胺盐酸盐的氨基树脂的固定化率为80. 1%，对照组的固定化率为73. 8%。3、活性评价本实验是用的大肠杆菌是产腈水解酶重组的大肠杆菌，能催化3-氰基吡啶生成尼克酸。将上述固定化的细胞加入到30mlPH7. 0的PB缓冲液中，3-氰基吡啶初始浓度为lmol/L的体系中，每隔5小时取样，通过Agilent 1100HPLC测产物含量。分析条件分析柱为安捷伦)(DB-C18，流速0. 8ml/min,检测波长230nm，流动相为体积比5 95的乙腈与0. 1 %稀磷酸，柱温30°C。固定化细胞在催化4 后转化率为41. 92%,对照组的只有 35. 85%。实施例10以珊瑚石为例固定化酵母菌1、将珊瑚石破碎，用40目筛子筛选出粒径差不多大的珊瑚石。将Ig多巴胺盐酸盐溶于200ml纯水中，加入IOg珊瑚石，用0. Imol/LNaOH调pH为8. 5，搅拌3小时，过滤，固体用纯水洗涤3次，每次50ml。对照组是不加多巴胺盐酸盐的珊瑚石。2、将酵母菌加水配成OD6tltl约为20的溶液，取Iml菌体加入上述2g材料中，室温 (250C )震摇30分钟，过滤，测上清液OD值，通过间接方法即得固定化的酵母菌，有多巴胺盐酸盐的珊瑚石的固定化率为30%左右，对照组固定化率为4. 1%。3、活性评价通过酵母菌转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇。将上述固定的细胞加入 30mlPH6. 8，L-苯丙氨酸浓度10g/L的PB缓冲液中催化反应40小时，产物进行气相色谱分析。检测条件同实施例2。固定化细胞的转化率达到36. 81%，对照组的转化率为4. 36%。因此，本发明克服现有细胞固定化技术的不足，提供一种新的微生物细胞固定化载体，使微生物细胞可以在水溶液环境下简单、方便地固定在有机或无机载体上。主要包括两个方面，首先是将多巴(DOPA)或多巴胺(dopamine)或含有邻苯二酚(catechol)结构的化合物与无机或有机载体进行反应，在这些载体的表面或多孔结构的内部表面形成多个邻苯二酚结构的粘性界面，从而制得微生物细胞固定化载体；然后，在弱碱性条件下，将表面富含多巴或多巴胺或邻苯二酚结构的载体即微生物细胞固定化载体与细胞悬浊液混合，通过一定时间的搅拌后，对活细胞进行固定，采用过滤等手段对固定后的细胞进行分离。这种微生物细胞固定化载体可以将活细胞固定在载体表面，有利于底物和产物的传递，不影响细胞的催化活性，催化效率高，且具有操作简便、易于分离、有利于重复使用等优势，是一种创新性的微生物细胞固定化载体。综上，本发明的微生物细胞固定化载体设计巧妙，能够简单方便地将微生物细胞固定在有机或无机载体上，且固定化效率高，细胞活性不受影响，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述微生物细胞固定化载体采用含有邻苯二酚结构的化合物修饰无机载体或有机载体而得到。
2.根据权利要求1所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述的含有邻苯二酚结构的化合物是多巴、多巴胺、3，4_ 二羟基苯甲胺、3，4_ 二羟基苯甲醛、3，4_ 二羟基苯乙醛、3，4- 二羟基苯甲酸或3，4- 二羟基苯乙酸。
3.根据权利要求1所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述无机载体是硅藻土、硅胶粉、湖珊瑚石、分子筛、高岭土、金属氧化物、金属氧化物纳米粒子、微孔陶瓷或微孔玻璃。
4.根据权利要求1所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述有机载体为高分子聚合物或多糖。
5.根据权利要求4所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述高分子聚合物为大孔树脂类、离子交换树脂类、环氧树脂类或氨基树脂。
6.根据权利要求4所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述多糖为纤维素、纤维素衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、环糊精、变性淀粉、褐藻胶、角叉藻胶或琼脂。
7.根据权利要求1所述的微生物细胞固定化载体在固定化微生物细胞中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物细胞为细菌细胞、霉菌细胞或酵母菌细胞。
9.根据权利要求8所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述细菌细胞为球菌、 螺旋菌、放线菌、杆菌或其基因工程菌；，所述霉菌细胞为根霉、毛霉、青霉、曲霉、木霉、或头孢霉；所述酵母细胞为毕赤酵母。
10.根据权利要求9所述的微生物细胞固定化载体，其特征在于，所述杆菌包括大肠杆菌、醋酸杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌、结核杆菌和乳酸杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种微生物细胞固定化载体，其采用含有邻苯二酚(catechol)结构的化合物修饰无机载体或有机载体而得到，较佳地，含有邻苯二酚结构的化合物是多巴(DOPA)、多巴胺(dopamine)、3，4-二羟基苯甲胺、3，4-二羟基苯甲醛、3，4-二羟基苯乙醛、3，4-二羟基苯甲酸或3，4-二羟基苯乙酸；无机载体是硅藻土、硅胶粉、湖珊瑚石、分子筛、高岭土、金属氧化物、金属氧化物纳米粒子、微孔陶瓷或微孔玻璃；有机载体为高分子聚合物或多糖，还提供了上述的微生物细胞固定化载体在固定化微生物细胞中的应用。本发明的微生物细胞固定化载体设计巧妙，能够简单方便地将微生物细胞固定在有机或无机载体上，且固定化效率高，细胞活性不受影响，适于大规模推广应用。
文档编号C12R1/19GK102373193SQ201110296918
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者任宇红, 倪克奉, 周勖, 王存勋, 魏东芝, 鲁慧敏 申请人:华东理工大学