专利名称：农杆菌介导大分子量t-dna转化的毒性辅助载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体，本发明还公开了该毒性辅助载体的构建方法以及应用。
背景技术：
农杆菌介导的植物遗传转化是一个借助农杆菌将外源基因导入植物基因组的自然过程。在根癌农杆菌中，存在一个大小约为150-M0 1Λ的大型质粒，即Ti质粒。在Ti 质粒上存在两个重要的区域T-DNA区和毒性区(virulence region，Vir区)。当农杆菌受植物伤口分泌的乙酰丁香酮等酚类物质诱导下，位于农杆菌细胞膜上VirA蛋白被自体磷酸化和被激活，随后将其磷酸基团传递给具有转录因子功能的VirG蛋白，并由VirG蛋白特异结合Vir区基因上游的启动子区域，启动所有Vir区基因的表达。其中，表达的VirD2蛋白在VirCl和VirDl等蛋白的协助下，对T-DNA右边界(RB)下链的5，端进行切割，并共价结合，构成ssT-DNA/VirD2复合物，ssT-DNA复合物迅速被VirE2蛋白包裹，以确保ssT_DNA 进入植物后不被核酸酶降解。野生型农杆菌中由VirG蛋白诱导表达的VirE2蛋白数量有限，约有1000个分子， 通常只能使231Λ左右的T-DNA得到有效保护。当T-DNA分子量大于25 1Λ时，由于农杆菌细胞内没有足量的VirE2蛋白，ssT-DNA/VirD2复合物得不到完全包裹，致使转化大片段T-DNA时出现丢失、断裂，而大分子量T-DNA不能完整的整合进植物基因组中。为了使大分子量T-DNA能够完整的整合进植物基因组中，需要在农杆菌中超表达VirE2蛋白。由于 VirE2蛋白不稳定，必须有VirEl分子伴侣来维持其结构。本发明将ftx)moter-VirEl-VirE2 片段与VirG-terminator拼接，构成virE-virG嵌合操纵子，并构建不含T-DNA区的、辅助农杆菌介导大分子量T-DNA转化的载体。
发明内容
有鉴于此，为了解决大分子量T-DNA完整整合进植物基因组的问题，提供农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体，该载体能够介导分子量大于25 kb的T-DNA转化；提供农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体的制备方法，利用本方法构建毒性辅助载体方法简单。本发明目的之一在于提供上述制备方法获得的毒性辅助载体，所述毒性辅助载体包括virE-virG嵌合操纵子，所述virE-virG嵌合操纵子核苷酸序列如SEQ ID NO 16所
优选为，所述毒性辅助载体还包括oriV农杆菌复制子和spec基因，所述oriV农杆菌复制子核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示，所述spec基因核苷酸序列如SEQ ID NO 18 所示。更优选为，所述毒性辅助载体核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。
本发明目的之二在于提供农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体的制备方法，为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
毒性辅助载体的制备方法，具体包括以下步骤
a.制备重组双元表达载体；
al.制备Pnos::nptII片段并酶切，将Pnos: :nptll酶切片段插入pCAMBIA1302载体多克隆酶切位点处，得PVCT2020载体；
a2.酶切pEGFP-Nl载体，制备eGFP基因，将eGFP基因插入pET-32a(+)载体多克隆酶切位点，得PVCT2190载体；
a3.酶切所得pVCT2190载体，制备所述eGFP基因的片段，将酶切所得eGFP基因插入所得pVCT2020载体酶切位点处，得pVCT2210载体；
a4.酶切所得PVCT2210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，将回收的片段连接，得 PVCT2212 载体；
a5.酶切所得PVCT2212载体，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含eGFP基因片段，将酶切所得eGFP基因插入pHells gate8载体酶切位点处，得重组双元表达载体，命名为pVCT2268 载体；
b.制备含virE-virG嵌合操纵子的基本载体；
bl.制备 Promoter-VirEl-VirE2 基因，将所得 Promoter-VirEl_VirE2 基因连接 P^asj-Blant 载体，得 pVCT1213 载体；
b2.制备 VirG-terminator 基因，将所得 VirG-terminator 片段插入 pVCT1213 载体，得含virE-virG嵌合操纵子的基本载体，命名为pVCT1244载体；
c.制备毒性辅助载体；
cl.酶切所得PVCT1244载体，制备virE-virG嵌合操纵子，将所得virE-virG嵌合操纵子插入所得PVCT2268载体，得重组载体，命名为pVCT2270载体；
c2.酶切所得pVCT2270载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收含所述virE-virG嵌合操纵子片段、农杆菌复制子oriV和所述抗性标记基因片段，将回收pVCT2270载体的酶切片段再连接，得所述毒性辅助载体，命名为PVCT2272载体。优选为，步骤al所述Pnos: :nptll片段的制备，具体包括如下步骤
以SEQ ID NO :1所示序列为上游引物，以SEQ ID NO :2所示序列为下游引物，以pBIN19 载体为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C预变性3分钟，94°C变性20秒，50°C退火 20秒，72°C延伸2分钟10秒，3个循环，60°C退火20秒，72°C延伸2分钟10秒，27个循环， 72°C延伸10分钟，得Pnos::nptII片段。优选为，步骤bl所述ft~0m0ter-VirEl-VirE2基因的制备，具体步骤如下 以所述农杆菌C58的pTiC58质粒DNA为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID
NO :3所示，下游上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :4所示，采用I^rin^tar HS DNA 聚合酶进行PCR扩增，得VirE2基因片段，所述PCR扩增条件为98°C预变性1分钟， 98°C变性10秒，56 °C退火15秒，72 °C延伸2分钟30秒，观个循环，72 °C延伸10分钟，得 Promoter-VirEl-VirE2 _@。优选为，步骤1^2所述VirG-terminator基因的制备，具体步骤如下
以所述农杆菌农杆菌C58的pTiC58载体为模板，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，采用I^rin^tar HS DNA聚合酶进行PCR扩增，得VirG基因片段，所述PCR扩增条件为98°C预变性1分钟，98°C变性10秒，56°C退火 15秒，72°C延伸1分钟，沘个循环，72°C延伸10分钟，得VirG-terminator基因。优选为，步骤Cl所述virE-virG嵌合操纵子的制备，具体步骤如下
同时用限制性内切酶Spe I.Xba I和Emall05 I酶切所得pVCT1244载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收3465bp大小的片段，得virE-virG嵌合操纵子。本发明目的三在于提供毒性辅助载体在农杆菌介导的遗传转化中的应用。优选为，用含有所述毒性辅助载体的农杆菌介导pBiBAC-CBF载体转化烟草。本发明的有益效果在于本发明将Promoter-VirEl-VirEZ-VirG-iTerminator构建到表达载体上，当农杆菌中被激活的VirG蛋白作用于该vir操纵子时，VirG蛋白将得到过量表达，而过量表达VirG蛋白将促进VirE2蛋白的过量表达，满足大分子量T-DNA包装需求，促进大分子量T-DNA对植物的遗传转化。VirEl蛋白是VirE2蛋白的分子伴侣，能维持VirE2蛋白处于可溶状态，防止过量表达的VirE2蛋白形成包涵体。构成的毒性辅助载体不含T-DNA区，防止农杆菌中双元表达载体在发生同源重组。同时构建的毒性辅助载体农杆菌复制子为oriV复制子，与pVSl复制子在杆菌中能够兼容，实现大分子量T-DNA完整整合进植物基因组中。本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其它优点可以通过下面的说明书，权利要求书，以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。壮观霉素基因，简称为spec，具有抗壮观霉素(spe)的活性。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为本发明PVCT2020载体图； 图2为本发明PVCT2190载体图； 图3为本发明pVCT2210载体图； 图4为本发明pVCT2212载体图； 图5为本发明pVCT2268载体图； 图6为本发明pVCT1213载体图； 图7为本发明pVCT1244载体图； 图8为本发明pVCT2270载体图； 图9为本发明pVCT2272载体图； 图10为本发明转基因烟草图11为卡那霉素抗性烟草的AtCBFl基因PCR鉴定电泳图。
具体实施例方式以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit 和 Ε· Z. N. A. Gel Exteaction Kit 试剂盒购自 Omega (USA)公司；PfuDNA 聚合酶、小牛小肠磷酸酶 CIAP、Wide Range DNAmarker, Lambda DNA / Hind III +EcoR I Marker, DL2000 Marker 购自上海生工生物有限公司 (China) ；Taq DNA polymerase、PrimeStar HS DNA polymerase、dNTP、限制性内切醇、 pfe紗-Blant载体购自北京全式金生物技术有限公司、T4 DNA Iigase购自大连宝生生物工程有限公司(Japan) ；pET-32a(+)载体购自Novagen公司；卡那霉素(Kanamycin，Kan)、 利福平(Rifampicin, Rif)、链霄素(Streptomycin, Str)、壮观霄素(spectinomycin, Spe) 等购自北京鼎国生物技术发展中心；PCAMBIA1302载体、pCAMBIA2300载体、BiBAC2载体和 pEGFP-m载体由本实验室保存。引物的合成及DNA测序由上海生工生物有限公司完成。实施例1
重组双元表达载体的构建 al. pVCT2020载体的构建
根据PBIN19载体序列(GenBank accession No :U09365)设计引物，上游引物如SEQ ID NO :1 所示，序列为5‘-cggaattcagggagtcacgttatgac-3‘(划线处为 EcoR I 位点)，下游引物如 SEQ ID NO 2 所示，序列为5’ —cgctcgagtcccgctcagaagaac—3，(划线处为 Β ο I 位点)。以pBIN19载体为模板，PfuDNA聚合酶、进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C预变性3 分钟，94 V变性20秒，50 V退火20秒，72 °C延伸2分钟10秒，3个循环，60 V退火20秒，72 °C 延伸2分钟10秒，27个循环，72°C延伸10分钟，经琼脂糖电泳鉴定回收1116 bp片段，所得片段含有胭脂碱合成酶基因启动子Pnos和卡那霉素编码区nptll，命名为Pnos: :nptll。 用EcoR I和Β ο I酶切Pnos::nptII片段，回收1107 bp的Pnos: :nptll片段；同时用相同的酶消化载体 pCAMBIA1302(GenBank accession AF234298)，回收 8425 bp 片段，将两个回收片段用在T4连接酶作用下16°C过夜连接，得9532 bp的pVCT2020载体，如附图1所不。a2. PVCT2190 载体的构建。用EcoR I和Not I酶切pET_32a(+)载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收5874 bp片段的ρΕΤ-3^ι(+)载体骨架；同时用相同酶切pEGFP-Nl载体(GenBank accession No. U55762)，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收772 bp的绿荧光蛋白突变系(命名为eGFP基因)编码区；将回收的pET-32a(+)载体骨架与eGFP基因用T4 DNA连接酶于16°C过夜连接，得pVCT2190载体，如附图2所示。a3. pVCT2210 载体构建
用Β ο I酶切载体所得pVCT2190载体，Klenow Fragment酶补平后，再用Bgl II酶消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收含eGFP基因的833 bp片段；同时用PmaC I和)(ba I酶切pVCT2020载体，回收8788 bp的pVCT2020载体大骨架；将回收的eGFP基因与pVCT2020 载体大骨架用jM DNA连接酶于16 °C过夜连接，得pVCT2210载体，如附图3所示。a4. pVCT2212 载体构建
用Nco I酶切所得pVCT2210载体，电泳回收1679 bp和7838 bp大小的片段；将回收的两个片段用T4 DNA连接酶于16°C连接，得pVCT2212载体，如附图4所示。所得pVCT2212 载体含有由胭脂碱合成酶基因的启动子Pnos、卡那霉素编码区nptll和CaMV 35S基因终止子PA序列构成的表达盒，命名为Pnos: :nptll: :pA ；由35S启动子、eGFP基因和胭脂碱合成酶基因终止子iTnos序列构成的表达盒，命名为35S: :eGFP: Jnos基因。a5. pVCT2268 载体的构建
用限制性内切酶Sph I单酶切pHells gateS载体，用洲的琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含有农杆菌复制子oriV的9370bp的大片段；同时用SphI酶切所得pVCT2212载体，用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含eGFP的1915bp的大片段，连接回收的1915bp片段和9370bp 的片段，在T4连接酶作用下16°C过夜连接，得重组双元表达载体，命名为pVCT2268载体，如附图5所示。本实施例以pHells gateS载体为例，经过酶切连接得重组双元表达载体。该重组双元表达载体载体农杆菌复制子为oriV复制子，与常用的双元表达载体pCAMBIA系列所采用的PVSl农杆菌复制子不同，含有这两种复制子得载体在农杆菌中可以兼容，因此还可以为其他双元表达载体，选择复制子的原则为重组双元表达载体的农杆菌复制子与携带靶基因的双元表达载体的复制子能够兼容为宜。实施例2
含virE-virG嵌合操纵子的基本载体的构建 bl.pVCT1213载体的构建
根据报道的农杆菌菌株C58的pTiC58载体序列(GenBank accession NC_003308),设计含启动子I^romoter，VirEl基因编码区和VirE2基因编码区(简称为 Promoter-VirEl-VirE2)的PCR特异引物，其中上游引物如SEQ ID NO 3所示，序列为 5，-gaattacattcacacggcacc-3，，下游弓I 物如 SEQ ID NO 4 所示，序列为 5，-tcacacgtg gtggtggtggtggtgcagactgtttacggttgg-3，。以农杆菌菌株 C58 的 pTiC58 载体为模板，利用PrimeStar HS DNA polymerase进行PCR扩增，反应条件为98°C预变性1分钟，98°C 变性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸2分钟30秒，观个循环，72°C延伸10分钟。PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定回收MSlbp目的片段，得ft~0m0ter-VirEl-VirE2片段。所得 Promoter-VirEl-VirE2片段，由启动子Promoter,VirEl基因编码区和VirE2基因编码区依次串联构成。如附图2所示，将所得ft~0m0ter-VirEl-VirE2片段连接pfe^-Blant载体， Promoter-VirEl-VirE2片段与pfe紗-Blant载体按3 1比例混合后，用！"4 DNA连接酶于 16°C过夜连接，连接产物转化大肠杆菌五coli XLl-BLUE感受态细胞，筛选出Amp和Kan 抗性的阳性克隆菌落，提取质粒得含ftx)m0ter-VirEl-VirE2片段的pfe紗-Blant载体，命名为PVCT1213，如附图6所示。b2. pVCT1244 载体的构建
根据报道的农杆菌菌株C58的pTiC58载体序列(GenBank accession :NC_003308),设计含VirG基因编码区和VirG基因的终止子terminator (简称VirG_terminator)的PCR 特异引物，其中上游引物如SEQ ID NO :5所示，序列为5，-ggagatctgttgagctgcaaatggctg_ 3，，下游引物如 SEQ ID NO 6 所示，序列为 5，-RctctaRataRRacccatccaatcac-3 (下划线处为损a I酶切位点)，以农杆菌菌株C58的pTiC58载体为模板，利用I^rimeStar HS DNA polymerase进行PCR扩增，反应条件为98°C预变性1分钟，98°C变性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸1分钟，观个循环，72°C延伸10分钟，经1%琼脂糖电泳鉴定回收919 bp片段， 得VirG-terminator片段。所得VirG-terminator片段，由VirG基因编码区和VirG基因的终止子terminator依次串联构成。用限制性内切酶损a I酶切回收所得VirG-terminator 片段，同时用限制性内切酶NotI酶切pVCT1213载体，经Klenow Fragment酶补平，然后用限制性内切酶)(bal酶切，得pVCT1213酶切片段；将酶切的VirG-terminator片段与 PVCT1213酶切片段连接，连接反应在T4连接酶作用下16°C过夜连接，得含KirG基因的重组载体，命名为PVCT1244，如附图7所示。pVCT1244载体中，Not I/Xbal酶切缺口位于VirE2基因编码区的末端，因此VirG 基因片段插入PVCT1213载体时，VirG基因的编码区和终止子拼接在VirE2基因编码区的末端，构成结构为 Promoter-VirEl-VirE2-VirG-Terminator 序列，命名为 virE-virG 嵌合操纵子。实施例3
毒性辅助载体的构建 cl.pVCT2270载体的构建
如附图5所示，用限制性内切酶Nru I单酶切所得PVCT2268载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得PVCT2268载体骨架片段；同时用限制性内切酶Spe I.Xba I,Emal 105 I三酶切载体PVCT1M4，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含virE-virG嵌合操纵子的3465bp大小的片段， 将virE-virG嵌合操纵子与pVCT2268载体骨架片段在T4连接酶作用下16°C过夜连接，得重组载体，命名为PVCT2270，如附图8所示。c2. pVCT2272 载体的构建
用限制性内切酶Sal I单酶切pVCT2270载体，切除pVCT2270载体上T-DNA区，用1% 的琼脂糖凝胶电泳回收virE-virG嵌合操纵子的11473bp的目标条带，得pVCT2270载体酶切片段，将回收的PVCT2270载体酶切片段在T4连接酶作用下16°C过夜连接，得农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体，具有如SEQ IDNO :7所示核苷酸序列，命名为 PVCT2272载体，如附图9所示。SEQ IDNO 7所示核苷酸序列，其中22-462位核苷酸序列为根癌农杆菌质粒复制子，1323-2111位核苷酸序列为壮观霉素抗性标记基因，3215-3977 位核苷酸序列为大肠杆菌ColEl复制子，4133-75 位核苷酸序列依次为根癌农杆菌C58 的VirG基因的终止子、根癌农杆菌C58的VirG基因编码区、根癌农杆菌C58的VirE2基因编码区、根癌农杆菌C58的VirEl基因编码区和根癌农杆菌C58的VirE操纵子的启动子， 2277-918位核苷酸序列为Tn7转座子，7582-11473位核苷酸序列来源于pHellsgate 8载体的序列。4133-7528 位核苷酸序列构成了 Promoter-VirEl-VirEZ-VirG-iTerminator 结构的virE-virG嵌合操纵子。所得毒性辅助载体含有virE-virG嵌合操纵子，农杆菌复制子为oriV复制子，抗性标记基因和大肠杆菌复制子ColEl、Tn7转座子；其中virE-virG嵌合操纵子结构为Pro moter-VirEl-VirE2-VirG-Terminator，抗性标记基因为壮观霉素抗性基因，抗性标记基因也可以为其他抗性标记基因。PVCT2272载体转入农杆菌中，当农杆菌中被激活的VirG蛋白作用于该virE-virG嵌合操纵子时，VirG蛋白将得到过量表达，而过量表达VirG蛋白将促进VirE2蛋白的过量表达，满足大分子量T-DNA包装需求，使大分子量T-DNA完整整合进植物基因组中。
实施例4
载体pVCT2272的应用
采用冻融法将所得毒性辅助载体PVCT2272载体转化根癌农杆菌菌株EHA105，在含有壮观霉素50mg/L、链霉素100mg/L和利福平100mg/L抗性的YEB固体培养基上筛选， 得含有PVCT2272载体的根癌农杆菌EHA105，命名为EHA105/ pVCT2272，采用冻融法将 PCAMBIA2300 (GenBank accession no. AF234315)质粒转化 EHA105/ pVCT2272，卡那霉素50mg/L、壮观霉素50mg/L、链霉素100mg/L和利福平100mg/L的YEB固体培养基上筛选，得同时含有PCAMBIA2300载体和pVCT2272载体的EHA105，命名为EHA105/ pVCT2272/ PCAMBIA2300。培养 EHA105/ pVCT2272/ pCAMBIA2300 三代，提取所得 EHA105/ pVCT2272/ PCAMBIA2300的质粒，得pVCT2272载体和pCAMBIA2300载体混合物，用所得载体混合物转化大肠杆菌XLl-Blue，在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上筛选，得含pCAMBIA2300 载体的XLl-Blue，命名为XLl-Blue/ pCAMBIA2300 ；在含壮观霉素50mg/L的LB固体培养基上筛选，含 PVCT2272 载体 XLl-Blue，命名为 XLl-Blue/ pVCT2272。根据如 SEQ ID NO: 7所示的PVCT2272载体设计引物，上游引物位于VirG基因的上游，序列为5’-ggagatCtgt tgagctgcaaatggctg_3，(SEQ ID NO :8)，下游引物位于大肠杆菌复制子ColEl的上游，序列为 5，-tccttctagtgtagccgtag-3，(SEQ ID NO :9)，以 XLl-Blue/ pVCT2272 菌液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3分钟，94°C变性20秒，53 °C退火20秒，72°C延伸1分钟30秒，35个循环，最后72°C延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳检测得到1675 bp大小的条带，表明该菌株中有VirG基因与ColEl复制子相连的结构。根据pCAMBIA2300载体序列设计引物，上游引物位于35S启动子内部，序列为5，-ggatagtgggattgtgcgtca-3‘ (SEQ ID NO :10)，下游引物位于位于35S终止子内部，序列为5，-catgagcgaaaccctataggaacc_3， (SEQ ID NO 11),以含XLl-Blue/ pCAMBIA2300菌液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3分钟，94 V变性20秒，56 V退火20秒，72 °C延伸1分钟，35个循环，最后 72°C延伸10分钟，电泳检测得到预期1064 bp大小的产物，表明该菌株中有35S启动子和终止子及其控制的nptll基因。PCR检测结果表明，PVCT2272载体与pCAMBIA2300载体同时存在于根癌农杆菌EHA105中没有发生同源重组，在根癌农杆菌菌株EHA105中具有兼容性。在拟南芥中含有冷诱导转录激活因子(C-i^peat binding factor，AtCBF)，该家族中有AtCBFl、AtCBF2和AtCBF3三个成员已经报道，经研究发现这三个基因成连锁排列， 排列顺序为CBFl — CBF3 — CBF2。拟南芥Columbia生态型的gDNA为模板，用BamHI部分酶切，电泳回收50 -100 Kb大小的DNA片段；同时用BamHI酶切BiBAC2载体，经小牛小肠磷酸酶CIAP脱磷后过柱纯化；BiBAC2载体酶切片段与gDNA酶切片段按1 5的比例混合，经 T4 DNA连接酶于16°C过夜连接，转化大肠杆菌XLl-Blue，在含50mg/L Kan的LB固体培养基上筛选，得Kan抗性的重组子。根据报道的拟南芥基因组序列(GenBank accession No: CP002687. 1)，设计拟南芥冷诱导转录激活因子AtCBFl基因引物，上游引物序列为=AtCBFl F :5，-cttggatccttcgcttagtcctgtcctgg-3，(SEQ ID NO 12)，下游引物为AtCBFl R :5， -tggaaaatagaaagtaaagagtgaagtgac-3，(SEQ ID NO 13),以 Kan 抗性的重组子为模板进行 PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3分钟，94°C变性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸2分钟，35个循环，最后72°C延伸10分钟，筛选电泳检测得到2102 bp大小的产物，即Kan抗性的重组子含有AtCBFl基因；根据报道的拟南芥基因组序列(GenBank accession No :CP002687. 1 )，拟南芥冷诱导转录激活因子AtCBF2基因和AtCBF3基因共同检测引物 AtCBF2/ AtCBF3，上游引物位于AtCBF3编码区内，引物序列为AtCBF2/ AtCBF3 F :5，-ggtgattatattccgacgcttgcga-3‘ (SEQ ID NO 14)，下游引物位于 AtCBF2 基因下游，引物序列为:AtCBF2/ AtCBF3 R 5'- ttaatagctccataaggacacgtcatc -3' (SEQ ID N0:15)，以含有AtCBFl基因的Kan抗性的重组子为模板进行PCR扩增，反应条件为95°C预变性2分钟， 95 °C变性10秒，58 °C退火20秒，72 °C延伸3分钟40秒，35个循环，最后72 °C延伸10分钟，筛选电泳检测得到3502 bp大小的产物，因此筛选出同时含有AtCBF3、AtCBF3和AtCBF2 三个基因的重组子，重组子含有重组载体，该重组载体命名为pBiBAC-CBF。采用电击法将pBiBAC-CBF载体转化EHA105/ pVCT2272，在含卡那霉素50mg/L、 壮观霉素50mg/L、链霉素100mg/L和利福平100mg/L的YEB固体培养基上筛选，获得含 pBiBAC-CBF 载体的 EHA105/pVCT2272 的工程菌，命名为 EHA105/pVCT2272/pBiBAC_CBF。所得 EHA105/pVCT2272/pBiBAC-CBF 叶盘法转化烟草，在含 2. 5 mg/L 6-BA 和 150mg/L 卡那霉素的MS固体培养基诱导生芽，获得抗卡那霉素的转基因烟草，如附图10所示。以卡那霉素抗性烟草基因组DNA为模板，以SEQ ID NO 12所示序列为上游引物，SEQ ID N0:13所示序列为下游引物，进行PCR扩增检测AtCBFl基因，如附图11所示。结果显示，在卡那霉素抗性烟草在2102bp处能够检测到AtCBFl扩增，结果表明pBiBAC-CBF质粒的T-DNA区整合进烟草基因组。进一步说明，本发明获得的毒性辅助载体PVCT2272载体能够实现使大分子量 T-DNA完整整合进植物基因组中。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
权利要求
1.农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体，其特征在于所述毒性辅助载体包括virE-virG嵌合操纵子，所述virE_virG嵌合操纵子核苷酸序列如SEQ ID NO 16所7J\ ο
2.根据权利要求1所述毒性辅助载体，其特在于所述毒性辅助载体还包括oriV农杆菌复制子和spec基因，所述oriV农杆菌复制子核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示，所述 spec基因核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。
3.根据权利要求2所述毒性辅助载体，其特征在于所述毒性辅助载体具有如SEQID NO :7所示核苷酸序列。
4.权利要求1、2或3所述毒性辅助载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤a.制备重组双元表达载体；al.制备Pnos: :nptll片段并酶切，将Pnos: :nptll酶切片段插入pCAMBIA1302载体多克隆酶切位点处，得PVCT2020载体；a2.酶切pEGFP-Nl载体，制备eGFP基因，将所述eGFP基因插入pET-32a(+)载体多克隆酶切位点，得PVCT2190载体；a3.酶切所得pVCT2190载体，制备所述eGFP基因的片段，将酶切所得eGFP基因插入所得pVCT2020载体酶切位点处，得pVCT2210载体；a4.酶切所得PVCT2210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，将回收的片段连接，得 PVCT2212 载体；a5.酶切所得pVCT2212载体，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含eGFP基因片段，将酶切所得eGFP基因插入pHells gate8载体酶切位点处，得重组双元表达载体，命名为pVCT2268 载体；b.制备含VirEiirG嵌合操纵子的基本载体；bl.制备 Promoter-VirEl-VirE2 基因，将所得 Promoter-VirEl_VirE2 基因连接 P^asj-Blant 载体，得 pVCT1213 载体；b2.制备 VirG-terminator 基因，将所得 VirG-terminator 片段插入 pVCT1213 载体，得含virE-virG嵌合操纵子的基本载体，命名为pVCT1244载体；c.制备毒性辅助载体；cl.酶切所得PVCT1244载体，制备virE-virG嵌合操纵子，将所得virE-virG嵌合操纵子插入所得PVCT2268载体，得重组载体，命名为pVCT2270载体；c2.酶切所得pVCT2270载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收含所述virE-virG嵌合操纵子片段、农杆菌复制子oriV和所述抗性标记基因片段，将回收pVCT2270载体的酶切片段再连接，得所述毒性辅助载体，命名为PVCT2272载体。
5.根据根据权利要求4所述毒性辅助载体的制备方法，其特在于步骤al所述 Pnos: :nptll片段的制备，具体包括如下步骤以SEQ ID NO :1所示序列为上游引物，以SEQ ID NO :2所示序列为下游引物，以pBIN19 载体为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C预变性3分钟，94°C变性20秒，50°C退火 20秒，72°C延伸2分钟10秒，3个循环，60°C退火20秒，72°C延伸2分钟10秒，27个循环， 72°C延伸10分钟，得Pnos: :nptll片段。
6.6.根据权利要求4所述毒性辅助载体的制备方法，其特征在于，步骤bl所述Promoter-VirEl-VirE2基因的制备，具体步骤如下以所述农杆菌C58的pTiC58质粒DNA为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :3所示，下游上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :4所示，采用I^rin^tar HS DNA 聚合酶进行PCR扩增，得VirE2基因片段，所述PCR扩增条件为98°C预变性1分钟， 98°C变性10秒，56 °C退火15秒，72 °C延伸2分钟30秒，观个循环，72 °C延伸10分钟，得 Promoter-VirEl-VirE2 _@。
7.根据权利要求4所述毒性辅助载体的制备方法，其特征在于，步骤1^2所述 VirG-terminator基因的制备，具体步骤如下以所述农杆菌农杆菌C58的pTiC58载体为模板，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO 5 所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，采用I^rin^tar HS DNA聚合酶进行PCR扩增，得VirG基因片段，所述PCR扩增条件为98°C预变性1分钟，98°C变性10秒，56°C退火 15秒，72°C延伸1分钟，沘个循环，72°C延伸10分钟，得VirG-terminator基因。
8.根据权利要求4所述毒性辅助载体的制备方法，其特征在于，步骤cl所述 virE-virG嵌合操纵子的制备，具体步骤如下同时用限制性内切酶Spe I.Xba I和Emall05 I酶切所得pVCT1244载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收3465bp大小的片段，得virE-virG嵌合操纵子。
9.权利要求1所述毒性辅助载体在农杆菌介导的遗传转化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于用含有所述毒性辅助载体的农杆菌介导 pBiBAC-CBF载体转化烟草。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，特别涉及农杆菌介导大分子量T-DNA转化的毒性辅助载体，本发明通过构建含有virE-virG嵌合操纵子和农杆菌复制子oriV的载体，在农杆菌中能过量表达VirE2蛋白；本发明还公开了该载体的制备方法，本发明公开的载体用于农杆菌介导的遗传转化中，使长度超过25kb的T-DNA转进植物基因组时有足够量的VirE2蛋白包裹大分子量T-DNA，使大分子量T-DNA不被核酸酶降解，能够使大分子量T-DNA完整整合进植物基因组中，实现多基因的遗传转化。
文档编号C12N15/66GK102321667SQ20111030644
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者张兴国, 杜小兵, 苏承刚, 钱春, 陈吉裕, 高启国, 黄国栋 申请人:西南大学