专利名称：一种产纤维素酶的青霉菌株及其酶解纤维素的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种产高活力纤维素酶的微生物青霉菌株及其酶解纤维素的应用。
背景技术：
随着全球石油储备的日益枯竭，液体燃料短缺将严重制约人类的发展，寻找可再生性的替代资源已成为维持人类社会可持续发展的紧迫任务。大力开发新的可再生资源，也是中国在21世纪保持可持续发展的前提条件。用地球上最丰富的可再生资源一植物纤维素作为原料生产生物能源和生物基化学品已受到国内外的广泛关注，并被认为是21世纪应对化石资源枯竭的最佳途径之一。纤维素是由β_1，4-糖苷键连接而成的线性高分子聚合物，将其降解成为单糖是进而发酵制取乙醇等生物基化学品的关键，这一步需要由纤维素酶来完成，因此生产高效率的纤维素酶成为生物乙醇通路中的一个关键步骤。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素转化为葡萄糖的各种酶的总称，分为真菌纤维素酶和细菌纤维素酶。纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)，β-葡萄糖苷酶(BG)组成。其广泛应用在纺织、饲料、酿造、食品加工、环保、造纸等行业，能有效改善产品质量，提高产品产量；利用纤维素酶对纤维素纤维织物进行生物整理即酶降解整理；可改善纤维素针织物外观性能，增强纤维素纤维的柔软度，使织物光泽和色泽鲜艳度得到明显改善，应用越来越广，市场需量也越来越大。纤维素酶的生产方法一般采用固体发酵和液体发酵两种工艺方法固体发酵工艺虽然固定投资少，但生产稳定性差，难以进行大规模工业化生产；而液体发酵工艺生产稳定性高，培养条件易控 制生产效率高，便于大规模生产，但其技术瓶颈在于发酵液的酶活普遍偏低。要生产高活性纤维素酶关键是一是选育高产菌种，作为生产菌种；二是发酵工艺路线，培养基选定、发酵时间、温度等，发酵后发酵液的过滤，浓缩等的提取工艺等均对纤维素酶的活性存在较大影响。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，因其产生的纤维素酶多为胞外酶，分离提取的工艺也相对简单。研究较多的有木霉属(Trichodema sp.)、曲霉属(Aspergillus sp·)、青霉属(Penicillium sp.)和枝顶抱霉属(Acremonium sp.)的菌株。其中以木霉属的产量居高，而对青霉菌(Penicillium sp.)的报道相对较少,且一般活力都低于木霉属(Trichodema sp.)所产的酶。中国专利CN101717728A公开了一株青霉菌及其用于催化水解木质纤维素的用途，利用该菌株得到的纤维素酶可发挥生物催化效力，分解富含纤维素的生物质并生成单糖，所得的水解物可作为碳源用于合成生物能源和生物基化学品。所得的纤维素酶在摇瓶规模水解纤维素的转化率为48%，在发酵罐规模水解纤维素的转化率为64%。虽然利用该菌株得到的纤维素酶具有较好的水解纤维素能力，但毕竟有接近一半的纤维素没有得到水解而浪费，因此急需开发出具有更好水解能力的纤维素酶以及能够高产该纤维素酶的菌株。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中青霉菌水解纤维素能力受限的问题，进而提供一种能产生高效水解纤维素酶的青霉菌株。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下本发明人经过诱变育种，选育出一株青霉菌株，其分类命名为Penicilliumdecumbens PD-G3-08,已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏单位地址武汉大学保藏中心。登记入册的编号是CCTCC M 2011195，保藏日期是2011年6月13日。以此菌株为酶解纤维素的菌株。该菌株具有下述性质所述青霉菌株的菌落在麦芽汁平板上呈淡粉红色，单菌落呈圆形，表面有少量褶皱，显微镜下观察菌丝粗壮，交织密集且很少断裂。本发明还公开了一种由上述青霉菌株编码的纤维素酶。本发明还公开了所述的青霉菌株Penicillium decumbens Η)-63_08的培养方法，包括如下步骤(I)菌种活化将所述菌株接种于适于微生物生长的固体培养基培养活化，于25-30°C，好氧培养5-7天；
所述固体培养基优选本领域技术人员常见的适用于青霉菌种生长的固体培养基，进一步优选含有如下组分及用量的培养基麸皮80-100g/L、葡萄糖10-20g/L、琼脂粉15-20g/L、其余为水；(2)菌种增殖将步骤(I)中活化好的菌种连同固体培养基挖块接入适于微生物生长的液体种子培养基，25-30°C，好氧培养30-60小时，即得种子液；所述液体种子培养基优选本领域技术人员常见的适用于青霉菌种生长的液体种子培养基，进一步优选含有如下组分及用量的液体种子培养基木糖渣10_30g/L、麸皮20-50g/L、蛋白胨l_4g/L、硫酸铵2-4g/L、其余为水。所述种子培养基中的组分及用量进一步优选为木糖渣20g/L、麸皮40g/L、蛋白胨3g/L、硫酸铵3g/L、其余为水。本发明还公开了适于上述青霉菌株Penicillium decumbens Η)-63-08产纤维素酶的方法在适于纤维素酶表达的培养条件下培养所述的青霉菌株Penicilliumdecumbens PD-G3-08。所述培养步骤是在含有如下含量组分的培养基中进行的碳源纤维原料30_50g/L、麸皮20-50g/L、产酶诱导剂4-8g/L、无机氮源2_5g/L、无机磷酸盐2_4g/L、无机镁盐O. 4-0. 6g/L、其余为水。所述碳源纤维原料为含纤维素的农业或工业残渣，所述产酶诱导剂为微晶纤维素和/或羧甲基纤维素，所述无机氮源为硫酸铵、尿素或氯化铵中的一种或几种，所述无机磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠，所述无机镁盐为硫酸镁、氯化镁。所述培养条件为控制温度25_30°C，pH 4. 0-6. 0，通气量O. 5-0. 6vvm，搅拌转速100-150rpm，发酵时间为80-136小时。本发明的产酶方法中还任选地包括将得到的纤维素酶分离的步骤将青霉菌株Penicillium decumbens PD-G3-08经合适的培养基培养得到的发酵液采用本领域常规手段例如离心或超滤，去除菌体后即得到含有所需纤维素酶的粗酶液，即可直接用于纤维素的酶解转化。本发明还公开了应用上述青霉菌株Penicillium decumbens Η)-63_08生产纤维素酶的方法得到的纤维素酶。本发明还公开了上述的纤维素酶在酶解纤维素方面的应用，即将所述纤维素酶与含纤维素底物相接触。将所述纤维素酶按照10_15FPU/g纤维素的添加量与含纤维素底物相接触酶解，优选的酶解转化条件为含纤维素底物浓度为50-200g/L，控制温度45-55°C、控制pH4_5、搅拌转速50-100rpm，酶解转化3_7天，对纤维素的转化率高达80%以上。本发明还公开了一种酶解纤维素的方法，其包括将青霉菌株Penicilliumdecumbens PD-G3-08与纤维素接触的步骤。·本发明所述的纤维素酶是一种纤维素酶复合物(即纤维素酶系)，在各种酶的协同作用下使纤维素降解，所以统称为纤维素酶。一般来讲，纤维素酶中的多组分酶系包括外切β-1，4-葡聚糖酶、内切β-1，4-葡聚糖酶和纤维二糖酶。本发明所述涉及的酶活力测定包括滤纸酶活力(FPU)、内切葡聚糖酶活力、纤维二糖酶活力、外切葡聚糖酶活力。本发明提及的各种酶活力统一定义为1ml酶液,在50±0· 1°C、pH4. 8条件下,每分钟水解底物，产生出相当于Iymol葡萄糖的还原糖量，为I个酶活力单位，以IU/ml表
/Jn ο 所使用的检测方法均根据国标制定方法进行。滤纸酶活力的测定1ml液体酶,在(50±0· I) °C、pH4. 8条件下，Ih水解50±lmg
滤纸，然后用DNS法测定还原糖的生成量。内切葡聚糖酶活力的测定1ml液体酶，在(50±0· 1)°C、ρΗ4· 8条件下，Ih水解2ml 1% CMC-Na，然后用DNS法测定还原糖的生成量。纤维二糖酶活力的测定1ml液体酶，在(50±0· I) °C、ρΗ4· 8条件下，30min水解Iml 1%水杨苷，然后用DNS法测定还原糖的生成量。外切葡聚糖酶活力的测定1ml液体酶，在(50±0· I) °C、ρΗ4· 8条件下，24h水解50± Img脱脂棉，然后用DNS法测定还原糖的生成量。本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点，1、发明人通过诱变育种，选育得到一株产高活性纤维素酶的青霉菌株，利用该菌株发酵得到纤维素酶粗酶液，其滤纸酶活力达到10IU/ml，内切葡聚糖酶活力达到30IU/ml，外切葡聚糖酶活力达到1. 5IU/ml,β -葡萄糖苷酶活力达到8IU/ml，比照出发菌株活力分别提升了 3倍、4倍、4. 5倍和4倍；
2、利用该菌株对纤维素原料进行酶解，3天纤维素转化率即可达到80%以上，具有极高的活性；3、选用农业或工业残渣比如木糖渣作为培育该菌株的主要营养成分，可以部分起到诱导产酶并提升活性的作用，同时利用了其他生产工艺中的废弃物料，经济环保。
具体实施例方式实施例1 :出发菌株的培养
将具有纤维素酶产生能力的青霉菌株传代培养，连续活化3次后，接入液体培养基中，30°C条件下振荡培养过夜。所述培养基中的组分及用量为麸皮100g/L，葡萄糖10g/L，其余为水。实施例2 :菌种的预处理将实施例1得到的菌液离心去除培养基液体，将得到的菌体用生理盐水重悬配置菌悬液，并接于已经灭菌处理过的平铺有玻璃珠的三角瓶中，室温下振荡处理5min，使菌体细胞分散，使用灭菌后的纱布过滤，梯度稀释，计数，至细胞浓度为106-107个/ml，备用。实施例3 :紫外诱变提前20分钟打开紫外灯管以稳定光波。取实施例2制得的菌悬液5_6ml加入到9cm培养皿中，保证菌液厚度2-3cm，，将培养皿放到磁力搅拌器上，培养皿中已放入无菌搅拌棒。打开培养皿盖，距离紫外灯管20-30cm，边搅拌边分别照射30、60、90、120、150、
180so分别选取经过不同时间紫外照射过的菌悬液O.1ml加入到O. 9ml无菌生理盐水中稀释，放入冰浴中l_2h。取O.1ml冰浴后的菌悬液涂布于含有100g/L麸皮汁和l_5g/L氯化锂的平板进行初筛分离，30°C培养3天。在上述平板上选取不同形态的菌落200个左右，接种到含有100g/L麸皮汁、20g/L葡萄糖和4-8g/L纤维素的平板进行复筛，30°C培养3-5天。在上述平板上选取透明圈与菌落直径比值较大的菌落20个左右，接种到含有100g/L麸皮汁和10g/L葡萄糖的平板培养，30°C培养3-5天后保存。将上述保存的菌株平板接种到种子培养基中培养增殖，然后接入发酵培养基进行诱导产酶，并对得到的粗酶液进行酶活检测，经过对比筛选得到I株酶活较高的菌株。所述种子培养基中的组分及用量为木糖渣20g/L、麸皮40g/L、蛋白胨3g/L、硫酸铵3g/L、其余为水。所述发酵培养基中各组分用量为木糖洛40g/L、麸皮30g/L、微晶纤维素6g/L、硫酸铵3g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁0. 5g/L、其余为水。实施例4 :化学诱变取实施例3筛选得到的具有较高酶活的菌株，按照实施例1和实施例2所述的方法进行菌种培养和菌种的预处理，制得所需的菌悬液。在通风橱中称取20mgNTG于棕色瓶中，加Iml丙酮使其溶解，然后加入0. 2M磷酸缓冲液9ml,配制成2mg/ml NTG母液,并将该母液稀释分别至0. 5、1. O、1. 5mg/ml。将上述预处理过的菌悬液0. 9ml以体积比9 I的比例与化学诱变剂NTG溶液混合，每个NTG溶液梯度的样品分别处理20、40、60、80min后终止反应。取0.1ml反应后的菌悬液涂布于含有100g/L麸皮汁和3g/L氯化锂的平板进行初筛分离，30°C培养3天。在上述平板上选取透明圈与菌落直径比值较大的菌落200个左右，接种到含有100g/L麸皮汁、20g/L葡萄糖和6g/L纤维素的平板进行复筛， 30°C培养3_5天。在上述平板上选取透明圈与菌落直径比值较大的菌落20个左右，接种到含有lOOg/L麸皮汁和10g/L葡萄糖的平板培养，30°C培养3-5天后保存。将上述保存的菌株平板接种到种子培养基中培养增殖，然后接入发酵培养基进行诱导产酶，并对得到的粗酶液进行酶活检测，经过对比筛选得到I株酶活较高的菌株。所述种子培养基中的组分及用量为木糖渣30g/L、麸皮30g/L、蛋白胨2g/L、硫酸铵4g/L、其余为水。所述发酵培养基中各组分用量为木糖洛50g/L、麸皮40g/L、微晶纤维素4g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁O. 6g/L、其余为水。实施例5 :紫外化学复合诱变将实施例4得到的经化学诱变的菌株分别按照实施例1到实施例4所述的菌种培养、菌种预处理、紫外诱变及化学诱变的方法重复进行4次复合诱变，最终得到酶活力最高的产纤维素酶菌株10株，并顺序编号，并分别保存于含有100g/L麸皮、10g/L葡萄糖和20g/L琼脂粉的固体培养基中。实施例6 :菌种遗传稳定性考察将实施例6所得到的10株活力较高的菌株进行遗传稳定性考察。将每个菌株连续转接10代，每代均接入所述发酵培养基进行培养发酵，发酵培养条件为培养基初始PH为5. 0-6. O,发酵温度25-30°C，通气量O. 5-0. 6vvm,搅拌转速100_150rpm，发酵80-136小时，菌株显示了稳定的发酵性能。其中酶活力较高、稳定性最好的菌株为ro-G3-08，并将该菌种保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2011195。实施例7 :菌株改造前后发酵性能比较将诱变菌株ro -G3_08、出发菌株、以及市售的青霉菌株CICC 40361分别进行实验室250ml摇瓶培养，并分别取得到的粗酶液进行酶活检测。所述种子培养基中的组分及用量为木糖渣30g/L、麸皮50g/L、蛋白胨4g/L、硫酸铵4g/L、其余为水。对比诱变前后粗酶
液的活力结果，见下表
权利要求
1.一种青霉菌株,其分类命名为Penicillium decumbens Η)-63-08,已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC Μ2011195。
2.一种由权利要求1所述的青霉菌株编码的纤维素酶。
3.—种生产纤维素酶的方法，其包括在适于纤维素酶表达的培养条件下培养根据权利要求I所述的青霉菌株。
4.根据权利要求3所述的青霉菌株生产纤维素酶的方法，其包括在含有如下含量组分的培养基中的培养步骤碳源纤维原料30-50g/L、麸皮20-50g/L、产酶诱导剂4_8g/L、无机氮源2-5g/L、无机磷酸盐2-4g/L、无机镁盐O. 4-0. 6g/L、其余为水。
5.根据权利要求4所述的青霉菌株生产纤维素酶的方法，其特征在于所述碳源纤维原料为含纤维素的农业或工业残渣，所述产酶诱导剂为微晶纤维素和/或羧甲基纤维素， 所述无机氮源为硫酸铵、尿素或氯化铵中的一种或几种，所述无机磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠，所述无机镁盐为硫酸镁、氯化镁。
6.根据权利要求3所述的青霉菌株生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养条件为控制温度25-30°C，pH 4. 0-6. 0，通气量O. 5-0. 6vvm，搅拌转速100-150rpm，发酵时间 80-136 小时。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的青霉菌株生产纤维素酶的方法得到的纤维素酶。
8.根据权利要求2或7所述的纤维素酶在酶解纤维素方面的应用。
9.根据权利要求8所述的纤维素酶在酶解纤维素方面的应用，其特征在于将所述纤维素酶与含纤维素底物相接触。
10.根据权利要求9所述的纤维素酶在酶解纤维素方面的应用，其特征在于将所述纤维素酶按照10-15FPU/g纤维素的添加量与含纤维素底物相接触酶解。
11.一种酶解纤维素的方法，其包括将根据权利要求1所述的青霉菌株与纤维素接触的步骤。
全文摘要
本发明属于微生物领域，具体涉及一种产高活力纤维素酶的微生物青霉菌株。一种青霉菌株，其分类命名为Penicillium decumbens PD-G3-08，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC M2011195。本发明还提供了该菌种在酶解纤维素的应用。发明人通过诱变育种，选育得到一株产高活性纤维素酶的青霉菌株，利用该菌株发酵得到纤维素酶粗酶液，其滤纸酶活力达到10IU/ml，内切葡聚糖酶活力达到30IU/ml，外切葡聚糖酶活力达到1.5IU/ml，β-葡萄糖苷酶活力达到8IU/ml，比照出发菌株活力分别提升了3倍、4倍、4.5倍和4倍；利用该菌株对纤维素原料进行酶解，3天纤维素转化率即可达到80％以上，具有极高的活性。
文档编号C12R1/80GK103045484SQ20111030662
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者唐一林, 崔建丽, 韩文斌, 高绍丰, 江成真 申请人:济南圣泉集团股份有限公司