专利名称：凝乳酶的制备方法
技术领域：
本发明属于利用农产品副产物进行固体发酵生产酶制剂技术领域。
背景技术：
麸皮是小麦加工面粉后得到的副产物。过去，麸皮主要是用作饲料，经济价值不高。实际上，麸皮可进行多层次的开发利用，利用发酵技术、酶技术等现代生物手段对麸皮进行综合利用和加工，使其综合利用价值得到全面的开发，生产高附加值的酶制剂产品，实现了农副产品的循环利用，解决了麸皮综合利用价值低的问题。凝乳酶是生产奶酪和凝乳酶干酪素的关键性酶。凝乳酶是一种从未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切κ-酪蛋白，导致牛奶凝结，因此被广泛用于乳酪制造业，成为重要的酶制剂，其产值占全世界酶制剂的15%。由于乳酪生产的需要，全球每年约屠宰5000万头小牛，造成全球性小牛短缺。我国自80年代末也开展了凝乳酶的研究，但到目前为止，国内大部分凝乳酶仍依赖于进口。凝乳酶来源广泛，但动物和植物源的凝乳酶受到原材料、时间和地点的限制难以发展。微生物由于生产周期短，受气候、区域、时间的限制小，生产成本低，产量大，提取方便，经济效益高而得到广泛的应用。目前微生物凝乳酶份额已经占凝乳酶消费量的一半以上。目前，国内微生物凝乳酶的产酶活力偏低，工艺复杂，间接导致生产成本过高，不易工业化大规模生产。如专利CN101974503 A公开了一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法，本发明采用国外菌种资源，凝乳酶粗酶活达到13000U/ml，酶活比CN101974503 A公开的粗酶活提高20倍。专利CN101514336 B公开了红曲米固态发酵生产凝乳酶的方法，采用醇沉，凝胶柱洗脱，分步收集等方法制备凝乳酶，工艺较复杂。同时两者用的都是未经活化处理的孢子或菌丝体，发酵的周期较长，达到90小时左右，本发明采用接种液体种子，缩短了发酵周期，60小时即可完成发酵。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种凝乳酶的制备方法。用麸皮固体发酵制备凝乳酶，实现了农副产品的综合利用，缓解凝乳酶市场供应不足的问题，工艺简单，产酶活力高，适合工业化推广生产。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种凝乳酶的制备方法，其主要特点是包括以下步骤
(1)米黑毛霉菌株购自ATCC美国模式培养物集存库，菌种编号NO.26282 Rhizomucormiehei ；
(2)制备液体菌种称取20-40g的麸皮煮沸8-12分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至IOOOmL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121°C灭菌20分钟；冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，33°C培养2天；(3)液体菌种接种麸皮培养基175g麸皮，加入150-210mL水，搅拌均勻，121°C灭菌25 分钟，冷却后，接种液体种子，接种量20-60mL，25°C -50°C培养3天；
(4)浸提1公斤发酵产物加入9%的氯化钠水溶液20升，室温浸提4-12小时；
(5)离心用80-150目滤布的板框压滤，过滤液用离心机8000-10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液。所述的凝乳酶的制备方法，还包括以下步骤
(6)超滤取10升离心液，通过截留量为Sk-IOk的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为 1升-2升，停止超滤，浓缩比例5-10倍；
(7)干燥1升超滤液添加氯化钠50-100g，甘露醇30-60g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品。本发明的有益效果
1.固体发酵培养基以麸皮为唯一原料，原料价格低廉；
2.操作工艺简单，发酵周期短，节约生产成本，省时经济，适合工业化生产和推广；
3.采用优质的菌种资源，凝乳酶酶活较高，凝乳酶粗酶液酶活13000U/mL，酶粉酶活，500000u/g 以上。
具体实施例方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1 一种凝乳酶的制备方法，其特征是包括以下步骤
(1)米黑毛霉菌株购自ATCC美国模式培养物集存库(Americantype culture collection)，菌种编号 NO. 26282 Rhizomucor miehei ；
(2)制备液体菌种称取20-40g的麸皮煮沸8-12分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至IOOOmL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121°C灭菌20分钟；冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，33°C培养2天；
(3)液体菌种接种麸皮培养基175g麸皮，加入150-210mL水，搅拌均勻，121°C灭菌25 分钟，冷却后，接种液体种子，接种量20-60mL，25°C -50°C培养3天；
(4)浸提1公斤发酵产物加入9%的氯化钠水溶液20升，室温浸提4-12小时；
(5)离心用80目滤布的板框压滤，过滤液用离心机8000-10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液。实施例2 —种凝乳酶的制备方法，还包括以下步骤
(6)超滤取10升离心液，通过截留量为8k的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为1 升"2升，停止超滤，浓缩比例5-10倍；
(7)干燥1升超滤液添加氯化钠50-100g，甘露醇30-60g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品。酶活测定采用Arima方法，用0. 01mol/L CaCl2溶液配制10%的脱脂奶粉溶液，取 5mL 10%的脱脂奶粉液于35°C保温10分钟，加入0. 5mL适当稀释的酶液，立即摇勻，开始计时，并把试管倾斜45度以上，沿试管轴方向旋转，观察试管壁上开始出现凝结小颗粒为终点，记录凝乳时间。在上述条件下，40min凝乳ImL 10%脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位(SU)
酶活力(SU)=(供试乳体积/凝乳酶体积)XDX2400/t 式中D为酶液稀释倍数；t为反应时间。
表1凝乳酶酶活计算实例
权利要求
1.一种凝乳酶的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)米黑毛霉菌株购自ATCC美国模式培养物集存库，菌种编号NO.26282 Rhizomucor miehei ；(2)制备液体菌种称取20-40g的麸皮煮沸8-12分钟，用四层纱布过滤，滤液用水定容至IOOOmL,取250mL装进500mL三角瓶，棉塞封口，121°C灭菌20分钟；冷却后，接种1环米黑毛霉孢子，33°C培养2天；(3)液体菌种接种麸皮培养基175g麸皮，加入150-210mL水，搅拌均勻，121°C灭菌25 分钟，冷却后，接种液体种子，接种量20-60mL，25°C -50°C培养3天；(4)浸提1公斤发酵产物加入9%的氯化钠水溶液20升，室温浸提4-12小时；(5)离心用80-150目滤布的板框压滤，过滤液用离心机8000-10000rpm转速离心，收集上清液，即为粗酶液。
2.如权利要求1所述的凝乳酶的制备方法，其特征是还包括以下步骤(6)超滤取10升离心液，通过截留量为Sk-IOk的超滤膜，废弃透析液，当酶液体积为 1升-2升，停止超滤，浓缩比例5-10倍；(7)干燥1升超滤液添加氯化钠50-100g，甘露醇30-60g，真空冷冻干燥72小时，得凝乳酶成品。
全文摘要
本发明涉及一种凝乳酶的制备方法，属生物工程和酶制剂制备技术领域。其主要特点包括如下步骤(1)制备摇瓶摇瓶种子；(2)接种液体菌种接种麸皮培养基；(3)发酵培养33℃，培养48个小时；(4)浸提物料用9%的盐水浸提过夜得粗酶液；(5)离心粗酶液通过80000-10000rpm离心；(6)超滤通过8k的超滤膜去除杂蛋白；(7)冷冻干燥添加冷冻保护剂，真空冷冻干燥，得凝乳酶成品。本发明以麸皮为主要原料，原料价格低廉，操作工艺简单，发酵周期短，省时经济，降低了生产成本，适合工业化生产和推广。
文档编号C12R1/645GK102382808SQ20111038142
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月27日 优先权日2011年11月27日
发明者何潇, 唐兴宇, 宋礼, 张玉平, 甘伯中, 纪银莉, 高维东 申请人:甘肃农业大学, 甘肃华羚生物技术研究中心