专利名称：一种重组E.coli Klenow酶的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种生物酶的纯化方法，特别涉及一种重组E.coli Klenow片段的纯化。
背景技术：
Klenow 片段(克列诺片段，Klenow fragment,或称克列诺酶,Klenow enzyme),分子量66 68KD，是E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。Klenow作为分子生物学的工具酶，应用十分广泛，主要为:1)补平由限制性内切核酸酶消化产生的3'凹端；2)通过放射性dNTP的掺入标记DNA片段的3'端；3)用随机引物法标记单链DNA ；4)用引物延伸法合成单键探针。因此Klenow片段具有较高的市场价值,但国内生产的Klenow片段品质普遍不高，表现为蛋白纯度较低，一般小于90%，含有干扰酶活的杂质，使用此类酶可能导致实验的失败。国外公司生产的Klenow片段品质较高，但其生产工艺繁琐，成本较高，售价昂贵。1991年美国学者Ca therrine M.Joyce报导的Klenow纯化方法包括:破菌、50%盐析、85%盐析、Mono Q离子交换层析、Phenyl-Superose疏水层析、Superose 12凝胶层析，其中的Phenyl纯化步骤主要用来去除微量的核酸酶。1993年美国学者VictoriaDerbyshire报道Klenow纯化方法包括了类似的步骤:破菌、40%盐析、85%盐析、Mono Q离子交换层析、Phenyl-Superose疏水层析、Superose 12凝胶层析，仅第一级盐析的饱和度略有调整。1997年Yang Xu也采用了类似的纯化工艺。目前国外大公司生产Klenow的纯化一直沿用此类纯化方法，即破菌、两步盐析、离子层析、疏水层析、凝胶层析。为达到酶的商品浓度，常常还需要增加浓缩步骤，并且需要透析或超滤等方法将酶更换至相应的储液buffer，这进一步增加了工艺的复杂性和高成本性。因此建立简便、快速、高质量、低成本的工业化可行的Klenow纯化方法是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法。此方法具有工艺简便、快速，获得的Klenow片段质量高、成本低的特点，十分适合工业放大生产。本发明采用以下的技术方案:一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法，由以下步骤组成:I)破菌表达重组E.coli Klenow片段的菌体，以1: 5 20的比例加入破菌buffer,搅拌10 20min使之混合均匀，在4 10°C下破碎菌体10 20min，再将得到的破菌液在10000 20000g下离心10 20min，温度控制在O 10°C，取其上清液；其中破菌缓冲液为20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.I 5mMEDTA、0.5 IMNaCl、溶菌酶(λ 5 2mg/ml、加入 PMSF 至(λ 02 ImM ;所述破菌步骤中，是用超声或高压均质的方法进行破菌，对于破菌规模大于200ml优选高压均质法，具体是:将菌体和破菌buffer的混合液放入高压均质机中，在O 10°C、工作压力为500 800bar时均质2 3遍。小体积可以选择超声法，具体是将菌体和破菌buffer的混合液放入超声设备中，超声5 10s，停10 20s，共超声10 20min，此超声方法建议体积小于0.2L时使用。2)两步盐析第一步盐析的饱和度为40 50%，具体操作为:先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中缓慢加入，及时搅拌，确保不会出现局部浓度过高，加入的比例为IOOml破菌上清液加入22.6 29.1g硫酸铵，沉淀温度控制在O 10°C，时间大于2h，然后在10000 20000g下离心10 20min，离心温度控制在O 10°C，留取上清；第二步盐析的饱和度为80 85%,具体操作为:先将硫酸铵盐用研钵研碎，向一级盐析上清中一次性加入，搅拌至完全溶解，加入比例为IOOml破菌上清液加入51.6 55.9g硫酸铵，沉淀温度为O 10°C，时间大于2h，最好过夜，这样可以充分沉淀目的蛋白，提高收率且便于离心澄清，然后在10000 20000g下离心10 20min，温度为O 10°C，也可以将离心沉淀按金属螯合层析每批处理量分装并冷冻保存。4)金属螯合亲和层析 金属螯合层析柱高为2.5 15cm，用缓冲液I平衡色谱柱3 5CV，上样量为每ml填料上样菌体蛋白100 300mg，上样线性流速为30 120cm/h，洗脱线性流速为100 300cm/h，上样后冲洗5 10CV，UV280洗至基线，缓冲液II洗脱杂蛋白5 10CV，UV280洗至基线，缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280大于IOOmAu组分；其中缓冲液I 为 20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 IOmM 咪唑；缓冲液 II 为 20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5,0.5 IM NaCl、40 60mM 咪唑；缓冲液 III 为 20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5,0.5 IM NaCl、250 350mM 咪唑。所述金属螯合亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)，优选为亚氨基二乙酸(IDA)。由于NTA的载量相对较低，所以使用IDA更经济，GE公司生产的Ni Sepharose HP、Ni Sepharose FF比较适合,其可重复使用,Ni离子脱落较少，选择性高，广泛用于组氨酸标签蛋白的纯化。Ni Sepharose HP填料颗粒平均34 μ m,分辨率略高于Ni Sepharose FF，流速反压与Ni Sepharose FF无明显差异，但需要样品较澄清，否则色谱柱堵塞明显，柱压上升加快；放大生产选择Ni Sepharose FF较理想，可以降低成本,对上样样品澄清度要求也相对低。所述金属螯合亲和层析步骤中柱高为2.5 15cm，柱床过高，柱压明显，影响上样、洗脱流速，过低影响分离效果；上样线性流速为30 120cm/h,优选为60 100cm/h,这样可以确保蛋白与填料的充分吸附；洗脱线性流速为100 300cm/h,优选为100 150cm/h，上样、洗脱时色谱柱压力控制在0.4MPa以下，防止色谱柱床压塌；上样量为每ml填料上样菌体蛋白100 300mg (Bradford法检测)，优选为100 200mg,上样量过高会降低分辨率，目的蛋白穿透，收率降低，产品纯度下降。4)凝胶过滤层析凝胶柱高度为50 70cm，上样量为I % 5%，色谱过程中温度维持在4 10°C，上样流速10 30cm/h，洗脱流速20 60cm/h，收集UV280大于150mAu样品；所述凝胶过滤层析步骤中，在上样前色谱柱先用无菌水冲洗I 3CV，buffer平衡2 3CV，至UV280洗脱至基线，使电导、PH稳定；其中凝胶过滤buffer为2倍浓度的NEB酶储液buffer，成分为50mM Tris-HCl (pH7.4) ,0.2mM EDTA, 2mM DTT。凝胶过滤层析介质可选择的范围十分广泛，GE公司生产的此类介质理化性质稳定，分离度高，优选GE公司生产的介质，介质种类可以选择Superdex 200、Sepharcyl200HR、Superose 12pg、Sepharose6FF,综合考虑分离度、成本，优选 Sephacryl 200HR,既可以实现目的蛋白与微量核酸酶杂质的有效分离，又可以实现成本最低，利于放大。本发明的方法中为避免外源核酸酶的污染，所有缓冲液、接触样品的容器、吸头等物品需要高压灭菌，色谱系统的管路、分子筛凝胶柱需要0.1 0.5M NaOH处理Ih以上，金属螯合层析柱需要4 6M盐酸胍处理Ih以上。如果本发明的方法用于生产制备重组E.coli Klenow片段，则制备工艺中还应包括质检、制剂及分装步骤，具体为:将凝胶过滤层析收集的样品加入等体积甘油在_20°C保存，Bradford法检测蛋白浓度，Klenow片段活测定方法可参考NEB商品酶，根据浓度、活性计算比活，按照NEBKlenow商品酶的DNA内、外切酶检测方法对我们的终产品进行检测。SDS-PAGE检测蛋白纯度。在百级层流下,根据需要的酶活性加入稀释buffer,稀释buffer为I倍的酶储buffer，成分为 25mM Tris-HCl (pH 7.4)，0.1mM EDTA, ImM DTT，50%甘油，稀释过程中温度维持在O 10°C。稀释样品0.22 um无菌滤膜过滤，无菌连续分液器在百级层流下进行分装。分装用离心管需经灭菌处理，分装过程中温度维持在O 10°C，分装样品-20°c冻存。本发明与文献中提到的方法相比，具有以下优点:(I)金属螯合层析属于亲和层析,选择性、蛋白载量远远高于Q、Phenyl层析，IOmlNi柱即可处理5L发酵菌体蛋白，洗脱蛋白纯度明显高于文献方法。(2)因金属螯合层析洗脱蛋白浓度较高，可到达10mg/ml以上，满足凝胶层析上样蛋白浓度要求，凝胶层析洗脱蛋白浓度大于商品所需浓度，不需增加浓缩步骤，凝胶柱洗脱样品buffer即为2倍浓度的储液Buffer,加入等体积甘油相应稀释即可,无需进行透析步骤，大大简化了工艺，降低了成本，提高了收率。。(3)建立了稳定可靠核酸酶去除工艺，使得终产品DNA内切酶、外切酶等检测指标达到了商品酶的水平；(4)凝胶过滤层析后蛋白纯度大于95%,好于NEB、Fermentas等进口酶的纯度(大于90% ),比活类似于NEB酶；(5)工艺衔接便捷，两步盐析后沉淀进行分装冻存，长时间保持活性，每次生产只需取出所需量的盐析沉淀即可；(6)工艺用时短，从Ni柱亲和层析到制剂分装，可在一天内完成。(8)工艺收率高，Ni柱收率在90%以上，凝胶层析收率在85%以上，全工艺收率在70%以上。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:图1是本发明实施例1的Klenow Ni柱亲和层析色谱图；图2是本发明实施例1的Klenow盐析、金属螯合层析SDS-PAGE电泳图；图3是本发明实施例1的Klenow S200柱亲和层析色谱图；图4是本发明实施例1的Klenow S200层析SDS-PAGE电泳；图5是本发明实施例1的Klenow内切酶检测结果
具体实施例方式本发明Klenow Fragment gene 基因序列:
ATGGTGATTTCTTATGACAACTACGTCACCATCCTTGATGAAGAAACACTGAAAGCGTGGATTGCGAAGCTGGAAAMGCGCCGGTATTTGCATTTGATACCGAAACCGACAGCCTTGATAACATCTCTGCTAACCTGGTCGGGCTTTCTTTTGCTATCGAGCCAGGCGTAGCGGCATATATTCCGGTTGCTCATGATTATCTTGATGCGCCCGATCAAATCTCTCGCGAGCGTGCACTCGAGTTGCTAAAACCGCTGCTGGAAGATGAAAAGGCGCTGAAGGTCGGGCAAAACCTGAAATACGATCGCGGTATTCTGGCGAACTACGGCATTGAACTGCGTGGGATTGCGTTTGATACCATGCTGGAGTCCTACATTCTCAATAGCGTTGCCGGGCGTCACGATATGGACAGCCTCGCGGAACGTTGGTTGAAGCACA AAACCATCACTTTTGAAGAGATTGCTGGTAAAGGCAAAAATCAACTGACCTTTAACCAGATTGCCCTCGAAGAAGCCGGACGTTACGCCGCCGAAGATGCAGATGTCACCTTGCAGTTGCATCTGAAAATGTGGCCGGATCTGCAAAAACACAAAGGGCCGTTGAACGTCTTCGAGAATATCGAAATGCCGCTGGTGCCGGTGCTTTCACGCATTGAACGTAACGGTGTGAAGATCGATCCGAAAGTGCTGCACAATCATTCTGAAGAGCTCACCCTTCGTCTGGCTGAGCTGGAAAAGAAAGCGCATGAAATTGCAGGTGAGGAATTTAACCTTTCTTCCACCAAGCAGTTACAAACCATTCTCTTTGAAAAACAGGGCATTAAACCGCTGAAGAAAACGCCGGGTGGCGCGCCGTCAACGTCGGAAGAGGTACTGGAAGAACTGGCGCTGGACTATCCGTTGCCAAAAGTGATTCTGGAGTATCGTGGTCTGGCGAAGCTGAAATCGACCTACACCGACAAGCTGCCGCTGATGATCAACCCGAAAACCGGGCGTGTGCATACCTCTTATCACCAGGCAGTAACTGCAACGGGACGTTTATCGTCAACCGATCCTAACCTGCAAAACATTCCGGTGCGTAACGAAGAAGGTCGTCGTATCCGCCAGGCGTTTATTGCGCCAGAGGATTATGTGATTGTCTCAGCGGACTACTCGCAGATTGAACTGCGCATTATGGCGCATCTTTCGCGTGACAAAGGCTTGCTGACCGCATTCGCGGAAGGAAAAGATATCCACCGGGCAACGGCGGCAGAAGTGTTTGGTTTGCCACTGGAAACCGTCACCAGCGAGCAACGCCGTAGCGCGAAAGCGATCAACTTTGGTCTGATTTATGGCATGAGTGCTTTCGGTCTGGCGCGGCAATTGAACATTCCACGTAAAGAAGCGCAGAAGT ACATGGACCTTTACTTCGAACGCTACCCTGGCGTGCTGGAGTATATGGAACGCACCCGTGCTCAGGCGAAAGAGCAGGGCTACGTTGAAACGCTGGACGGACGCCGTCTGTATCTGCCGGATATCAAATCCAGCAATGGTGCTCGTCGTGCAGCGGCTGAACGTGCAGCCATTAACGCGCCAATGCAGGGAACCGCCGCCGACATTATCAAACGGGCGATGATTGCCGTTGATGCGTGGTTACAGGCTGAGCAACCGCGTGTACGTATGATCATGCAGGTACACGATGAACTGGTATTTGAAGTTCATAAAGATGATGTTGATGCCGTCGCGAAGCAGATTCATCAACTGATGGAAAACTGTACCCGTCTGGATGTGCCGTTGCTGGTGGAAGTGGGGAGTGGCGAAAACTGGGATCAGGCGCACTAA蛋白序列:MVISYDNYVTILDEETLKAWIAKLEKAPVFAFDTETDSLDNISANLVGLSFAIEPGVAAYIPVAHDYLDAPDQISRERALELLKPLLEDEKALKVGQNLKYDRGILANYGIELRGIAFDTMLESYILNSVAGRHDMDSLAERWLKHKTITFEEIAGKGKNQLTFNQIALEEAGRYAAEDADVTLQLHLKMWPDLQKHKGPLNVFENIEMPLVPVLSRIERNGVKIDPKVLHNHSEELTLRLAELEKKAHEIAGEEFNLSSTKQLQTILFEKQGIKPLKKTPGGAPSTSEEVLEELALDYPLPKVILEYRGLAKLKSTYTDKLPLMINPKTGRVHTSYHQAVTATGRLSSTDPNLQNIPVRNEEGRRIRQAFIAPEDYVIVSADYSQIELRIMAHLSRDKGLLTAFAEGKDIHRATAAEVFGLPLETVTSEQRRSAKAINFGLIYGMSAFGLARQLNIPRKEAQKYMDLYFERYPGVLEYMERTRAQAKEQGYVETLDGRRLY LPDIKSSNGARRAAAERAAINAPMQGTAADIIKRAMIAVDAWLQAEQPRVRMIMQVHDELVFEVHKDDVDAVAKQIHQLMENCTRLDVPLLVEVGSGENWDQAH上游引物:5'-GGCAAATTCATATGGTGATTTCTTATGAC-3'下游引物: 5'-CCAGGATCCTTAGTGCGCCTGATC-3'构建方法:1.使用上下游引物PCR获得目的片段；2.NdeI及BamHI双酶切目的基因及pet 15b质粒载体；3.连接载体及目的基因、转入大肠杆菌DH5 α菌株；4.测序正确后提取质粒转入表达载体大肠杆菌BL21 (DE3)进行诱导表达，表达成功后进行大规模发酵。发酵过程大肠杆菌BL21 (DE3)pET15b菌种发酵采用三级发酵一级种子培养基(LB):
蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化钠 0.5%
氨苄0.1 mg/ml原始菌种接种过夜培养培养条件:温度为37°C，220rpm二级种子培养基(LB)
蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化钠 0.5%
氨苄0.1 mg/ml1% -10%接种培养至 0D600 为 0.5-1.0培养条件:温度为37°C，220rpm发酵培养基:胰蛋白胨1.6% 酵母粉1.0% 氯化钠0.5% 三水嶙酸氢二钾1.4% 嶙酸二氢钾0.52%补料成分:
酵母粉3% 胰蛋白胨6% 葡萄糖40% NaCl0.5%按5% 10%接种，温度为37°C，pH控制在7.0，通过搅拌，通气和灌压控制溶氧保持在30% 60%，后期通过补料控制溶氧保持在30% 60%，当0D600为10 20开始诱导，加入IPTG至终浓度为0.2 0.5mM，诱导时间3 5h，诱导温度为37°C，可获得发酵液，在5000rpm离心20分钟，收获菌体180 250g。结合具体实施例进行说明。实施例1 3L发酵液离心获得190g菌体，加入破菌缓冲液950ml (菌体和破菌缓冲液的比例为 I: 5)，其中破菌缓冲液为 20mM Tris-HCl, pH7.5,0.1mM EDTA、0.5M NaCl、溶菌酶
0.5mg/ml、0.02mM PMSF，搅拌IOmin使之混合均匀，温控操作温度为4°C，通过高压均质的方法裂解菌体，即将混合液体600bar，4°C下匀质2遍，IOOOOg 4°C离心10分钟，获得951ml
破菌上清液。事先将214g硫酸铵用研钵研碎，向破菌上清液中边搅拌边缓慢加入(40%饱和度)，确保不会出现局部浓度过高，沉淀温度控制在4°C，沉淀时间为2h，IOOOOg离心15min，离心温度为4°C。将520g硫酸铵盐用研钵研碎，向一级盐析上清中一次性加入(80%饱和度)，搅拌至完全溶解，沉淀淀温度为4°C，沉淀时间为2h，IOOOOg离心15min，离心温度为4°C。离心获得的盐析沉淀铵等分8份，每份相当约20g菌体来源的蛋白量，_20°C长期冻存，盐析收率为 95%。金属螯合层析的介质配基是Ni2+-1DA,为GE公司生产的Ni Sepharose HP5ml (2*2.5cm)，金属螯合层析用缓冲液I平衡色谱柱3CV，上样后冲洗5CV，UV280吸收洗至基线，其中缓冲液I为20mMTris-HCl，pH7.5、0.5M NaCl、5mM咪唑；用缓冲液II洗脱杂蛋白，用量8CV，UV280吸收洗至基线，其中缓冲液II为20mM Tris-HCl，pH7.5、0.5MNaCl、40mM咪唑；用缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu组分，其中缓冲液 III 为 20mM Tris-HCl, ρΗ7.5、0.5M NaCl、250mM 咪唑；上样流速 2ml/min(线性流速为60cm/h),洗脱流速3.4ml/min (线性流速为100cm/h),上样量为每ml填料上样菌体蛋白IOOmg (Bradford法检测)，此步收率为94%。色谱过程中温度维持在4°C。Sephacryl S-200HR 色谱柱(26*60cm)0.5M NaOH 处理 2CV，填料、系统、管路接触碱2h，以确保所有接触蛋白的表面内切酶完全灭活。上样前色谱柱用无菌水冲洗I 3CV, buffer平衡2 3CV，至UV280洗脱至基线，电导、pH稳定，取金属螯合柱洗脱蛋白5ml (1.7%凝胶柱体积)上样,上样流速lml/min (线性流速12cm/h),洗脱流速2ml/min (线性流速24cm/h)，收集UV280大于150mAu样品，此步收率87%。收集容器及期间取样容器均需灭菌处理，色谱过程中温度维持在4°C。凝胶过滤buffer为2倍浓度的NEB酶储液buffer,成分为50mMTris_HCl (pH7.4) ,0.2mM EDTA, 2mM DTT。凝胶过滤层析收集样品，加入等体积甘油_20°C暂时保存，Bradford法检测蛋白浓度，根据NEB Klenow产品说明书方法测定酶活，计算比活，比活为3700U/mg，NEB比活为3685U/mg, DNA内、外切酶活性按照其说明书方法检测，内切酶含量< 10%，外切酶未检测至IJ，符合商品酶质量标准。SDS-PAGE电泳纯度为96%。根据商品酶活5000U/ml进行稀释,稀释buffer为I倍的NEB酶储液buffer,成分为25mM Tris-HCl (pH 7.4),0.1mM EDTA, ImM DTT, 50%甘油。稀释过程中温度维持在
4。。。稀释样品0.22 μ m无菌滤膜过滤，无菌连续分液器在百级层流下进行分装。分装用离心管经灭菌处理 ，分装过程中温度维持在4°C，分装后样品-20度冻存。按照Victoria Derbyshire文献所述方法-破菌、50%盐析、85%盐析、Mono Q
离子交换层析、Phenyl-Superose疏水层析、Superose 12凝胶层析-同时进行层析，与本
专利方法比较纯度收率。本实施例中涉及的图表有:(I)金属螯合亲和层析色谱图及电泳图:Klenow Ni柱亲和层析色谱图，见图1 ;Klenow盐析、金属螯合层析SDS-PAGE电泳，见图2，其中图2中的标号含义为:1.40%盐析上清 2.裂解液上清 3.80%盐析上清4.40%盐析沉淀复溶5.Marker6.80%盐析沉淀复溶，同为Ni柱上样前7.Ni洗脱穿透8.Ni洗脱杂峰3号收集9.Ni目的蛋白洗脱4号收集10.Ni目的蛋白洗脱6号收集(注:箭头所示为洗脱目的峰)(2) Sephacryl S-200HR色谱柱(26*60cm)凝胶层析色谱图及电泳图:Klenow S200柱亲和层析色谱图，见图3 ；Klenow S200层析SDS-PAGE电泳，见图4，其图4中的标号含义为:1、S200上样前2、S200洗脱峰6号
3、KlenowS200 洗脱峰 15 号 4、KlenowS200 洗脱峰 20 号(3)内切酶检测结果(方法参见NEB Klenow产品说明书)Klenow内切酶检测结果，见图5，其中图5中的标号为:阳性对照:1.Ni柱收集样品Oh 2.Ni柱收集样品37°C反应4h阴性对照:3.无菌水Oh4.无菌水37°C反应4hNEB 商品酶:5.反应 Oh6.37°C反应 4h自制酶:7.反应Oh8.37°C反应4h(4)本专利方法与Victoria Derbyshire文献方法收率、纯度比较重复VictoriaDerbyshire文献方法，与此实施例采用的纯化方法生产蛋白的纯度、比活、活性回收率、用时进行比较，具有如下特点:
权利要求
1.一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法,其特征在于:由以下步骤组成: 1)破菌 表达重组E.coli Klenow片段的菌体，以1: 5 20的比例加入破菌缓冲液，搅拌10 20min使之混合均匀，在4 10°C下破碎菌体10 20min，再将得到的破菌液在10000 20000g下离心10 20min，温度控制在O 10°C，取其上清液； 破菌缓冲液为 20 50mM Tris-HCl，ΡΗ7.5 8.5、0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl、溶菌酶 0.5 2mg/ml、加入 PMSF 至 0.02 ImM ； 2)两步盐析 第一步盐析的饱和度为40 50%:先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中缓慢加入，及时搅拌，加入比例为IOOml破菌上清液加入22.6 29.1g硫酸铵，沉淀温度控制在O 10°C，时间大于2h，然后在10000 20000g下离心10 20min，离心温度控制在O 10°C，留取上清； 第二步盐析的饱和度为80 85%:先将硫酸铵盐用研钵研碎，向一级盐析上清中一次性加入，搅拌至完全溶解，加入比例为IOOml破菌上清液加入51.6 55.9g硫酸铵，沉淀温度为O 10°C，时间大于2h，然后在10000 20000 Xg下离心10 20min，温度为O IO0C ； 3)金属螯合亲和层析 金属螯合层析柱高为2.5 15cm，用缓冲液I平衡色谱柱3 5CV，上样量为每ml填料上样菌体蛋白100 300mg，上样线性流速为30 120cm/h，洗脱线性流速为100 300cm/h，上样后冲洗5 10CV，UV280洗至基线，缓冲液II洗脱杂蛋白5 10CV，UV280洗至基线，缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280大于IOOmAu组分； 缓冲液 I 为 20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5、0.5 1M NaCl、5 1OmM 咪唑；缓冲液 II 为 20 50mM Tris-HCl,PH7.5 8.5,0.5 lMNaCl、40 60mM 咪唑；缓冲液 III 为20 50mM Tris-HCl, PH7.5 8.5,0.5 IM NaCl,250 350mM 咪唑。色谱过程中温度维持在4 10°C ; 4)凝胶过滤层析 凝胶柱高度为50 70cm，上样量为I % 5 %，色谱过程中温度维持在4 10°C，上样流速10 30cm/h，洗脱流速20 60cm/h，收集UV280大于150mAu样品；
2.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:所述破菌步骤中，是用超声或高压均质的方法进行破菌。
3.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:所述金属螯合亲和层析中选用的介质配基为亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)。
4.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:所述金属螯合亲和层析步骤中上样量优选为每ml填料上样菌体蛋白100 200mg，上样线性流速优选为60 100cm/h,洗脱线性流速优选为100 150cm/h。
5.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:为避免外源核酸酶的污染，所有缓冲液、接触样品的容器、吸头等物品需要高压灭菌，色谱系统的管路、分子筛凝胶柱需要0.1 0.5M NaOH处理Ih以上，金属螯合层析柱需要4 6M盐酸胍处理Ih以上。
6.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:凝胶过滤层析介质为 GE 公司生产的 Superdex 200、Sepharcy1200HR> Superose 12pg 或 Sepharose6FF。
7.根据权利要求6所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:凝胶过滤层析介质优选为GE公司生产的Sepharcyl 200HR。
8.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于:其中凝胶过滤 buffer 为 50mM Tris-HCl (pH 7.4)，0.2mM EDTA, 2mM DTT。
全文摘要
本发明提供了一种重组E.coli Klenow酶的纯化方法，由以下步骤组成1)破菌、2)两步盐析、3)金属螯合亲和层析和4)凝胶过滤层析。此方法具有工艺简便、快速，获得的Klenow酶质量高、成本低的特点，十分适合工业放大生产。
文档编号C12R1/19GK103160480SQ20111041343
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者聂立影, 王磊, 徐彬, 郑春阳 申请人:天津强微特生物科技有限公司