专利名称：一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶的制作方法
CN 102533682 A一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶技术领域
本发明属于生物工程技术与难降解有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种能够催化降解茚并[l，2，3-cd]芘的酶。
背景技术：
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的有毒有机污染物，具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用。PAHs能通过生物累积及食物链的传递作用对生态环境和人体健康造成极大危害，已引起各国环境科学家的高度重视。美国环保局早在80年代就已把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也把PAHs列入环境污染的黑名单中。
目前对环境中多环芳烃的治理技术主要有物理法、化学法和生物法。物理处理技术主要存在处理费用高与去除不彻底的缺点。在化学法中国内外有学者利用有机溶剂(如乙醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮)及表面活性剂等洗脱环境中的多环芳烃，但会存在二次污染等问题。生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃，例如苯并[a]芘、茚并[1，2， 3-cd]芘等则难于降解，较长期存在于环境中。从降解微生物细胞中提取降解酶来强化降解已成为去除多环芳烃污染的一种重要方法。降解酶在多环芳烃降解的应用中具有降解效率高、作用底物浓度低及环境适应性强等优点，具有广阔的应用前景。但是，由于对多环芳烃降解微生物缺乏深入的研究，国内外缺少高环多环芳烃降解酶方面的研究报道。发明内容
本发明提供一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶。所述能够催化降解茚并 [l，2，3-cd]芘的酶由潘多拉菌Pandoraea sp.的菌液经过提取与纯化得到的。该酶在进行催化降解茚并[1，2，3-cd]芘时，适宜pH值为6. 0 8. 0，最适宜pH值为7. 0，当pH值小于 4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30 45°C，最适宜反应温度为35°C，当温度高于50°C易于失活变性，浓度为lmmol/L的Cu2+、Zn2\ Hg2+离子对酶的活性有较强抑制作用。
分离能够催化降解茚并[l，2，3_cd]芘的酶所用的菌株潘多拉菌Pandoraea sp.在2010年01月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC N0. 3615。从潘多拉菌Pandoraea sp.中分离能够催化降解茚并[l，2，3_cd]芘的酶具体方案为
①向加入198ml诱导培养基、2. Oml微量金属液和0. 2ml维生素c溶液的培养瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株潘多拉菌Pandoraea sp.；然后用透气膜密封瓶口，将培养瓶在培养温度为25 ^°C、转速为lOOr/min的振荡器中培养40d后即可得到扩增培养后的菌液；②将步骤①中的菌液进行超声波破碎15min ；破碎后的菌液在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；③向由步骤②分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min， 在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；④向由步骤③分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min， 在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；⑤合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到酶粗提液；⑥向由步骤⑤得到的酶粗提液中加入碾细的(NH4)2SO4固体至65 70%饱和度， 在转速为100r/min的振荡器中振荡1 池，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀；⑦将由步骤⑥得到的沉淀溶于少量pH值为7. O 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7. O 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析24h ；将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min， 分离出上清液；⑧将由步骤⑦得到的上清液上到已用pH值为7. O 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7. O 7. 2内含0. 25mol/L氯化钠的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液线形洗脱梯度洗脱结合的酶，洗脱速度为20ml/h ；运用容积为IOml的试管收集洗脱液，其中每支试管收集洗脱液5ml ；用紫外分光光度计在吸收波长为^Onm处检测洗脱液，收集吸光度大于0. 01的洗脱液；测定酶的活性，选择活性部分备用。所述步骤①中诱导培养基的组成为=NaNO3 :2. 5g/L，NH4Cl :1. 5g · L-1，KH2PO4 1. 5g · ΙΛ MgCl2 :0. 2g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 :0. 15g · Λ 茚并[1,2,3-cd]芘:0. Olg · Γ1。所述步骤①中微量金属液的组成为=CoCl2 · 6H20 :35mg · L-1，CuCl2 :0. 25mg · L-1， H3BO3 :6. Omg .IAMnCl2 ·4Η20 :30mg ·L-1,Na2MoO4 ·2H20 :3. Omg .IANiCl2 ·2Η20 :2. 5mg · Λ ZnCl2 :2. 5mg · L-1。所述步骤步骤②、③和④中超声波破碎的条件为电流35%、脉冲9. Os、处理时间 15min。本发明得到的酶可以有效催化降解茚并[l，2，3_cd]芘，对于多环芳烃茚并[1，2， 3-cd]芘污染土壤及水体有应用潜力。
具体实施例方式下面结合实例进一步说明本发明。材料(1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株潘多拉菌Pandoraea sp，菌种保藏号分别为CGMCC NO. 3615 ；(2)茚并[1，2，3-cd]芘(纯度彡 99%, Sigma Aldrich)；
(3) NaCl、(NH4) 2S04 分析纯； (4)pH值为7. 0 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液，pH值为 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0,10. 0 的磷酸缓冲液；
(5)诱导培养基1L，其组成及各组分的浓度为=NaNO3 :2. Og/L, NH4Cl :1. Og · L-1， KH2PO4 :1. Og ·厂1，MgCl2 :0. Ig ·厂1，CaCl2 · 2H20 :0. 05g ·厂1，茚并[1,2,3-cd]芘 0. Olg · L-1 ；
(6)微量金属液1L，其组成及各组分的浓度为=CoCl2 · 6H20 :35mg · L-1，CuCl2 0. 25mg 'T1jH3BO3 :6. Omg .IAMnCl2 ·4Η20 :30mg 'L^1jNa2MoO4 ·2Η20 :3. Omg .IANiCl2 ·2Η20 2. 5mg · L-1，ZnCl2 :2. 5mg · L-1。
酶活性的检测方法以酶与茚并[l，2，3_cd]芘反应消耗的茚并[l，2，3_cd]芘量来确定酶的活性。取0.21^酶和4.81^含有茚并[1，2，3-((1]芘浓度为0.2yg/L pH值为 7. 5的磷酸缓冲液混合，在温度为35°C条件下反应Mh，加入0. 3mL浓度为2. Omol/L的HCl 终止酶反应，测定降解结束后茚并[l，2，3-cd]芘浓度的变化。
实施例
向已加入198ml诱导培养基、2. Oml微量金属液和0. 2ml维生素c溶液的培养瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株潘多拉菌Pandoraea sp.，然后将培养瓶在培养温度为25 ^°C、转速为lOOr/min的振荡器中培养40d，得到扩增培养后的菌液。
将得到的菌液超声波破碎15min后在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液。向分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/ min条件下离心15min，分离出菌体和上清液，重复2次。合并3次所收集的上清液，得到酶粗提液。
向酶粗提液中加入碾细的(NH4)2SO4固体至65%饱和度，在转速为lOOr/min的振荡器中振荡1 池，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀。然后将沉淀溶于少量PH值为7. O 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在PH值为7. O 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析Mh。将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离出上清液。将上清液上到已用pH值为 7. O 7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱上过滤，采用PH值为7. O 7. 2内含0. 25mol/L氯化钠的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液线形洗脱梯度洗脱结合的酶，洗脱速度为20ml/h。运用容积为 IOml的试管收集洗脱液，其中每支试管收集洗脱液5ml。用紫外分光光度计在吸收波长为 280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于0. 01的洗脱液。
分别用pH 值为 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0,10. 0 的含有茚并[1,2, 3-cd]芘浓度为0. 2 μ g/L磷酸缓冲液与0. 2mL的酶配成总体积为5. OmL的反应体系，在 30°C条件下反应M小时，加入0. 3mL浓度为2. 0mol/L的HCl终止酶反应。同时分别设定不加酶的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力，以确定酶反应的最适宜PH值。结果表明，酶在pH值为3.0 10.0之间对茚并[1，2，3-cd]芘均有不同程度的降解，其适宜的PH值为6. 0 8. 0，最适宜pH值为7. 0，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，在最适宜PH值条件下反应M小时对茚并[l，2，3-cd]芘的降解率为82.9%。
在pH值为7. 0条件下，将含有茚并[1，2，3-cd]芘浓度为0. 2 μ g/L磷酸缓冲液与 0. 2mL 的酶配成体积为 5. OmL 的反应体系，分别在 10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、 50°C条件下反应M小时，然后加入0. 3mL浓度为2. 0mol/L的HCl终止酶反应。同时分别设定不加酶的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力，以确定酶反应的最适宜温度。结果表明，酶在温度为10 50°C之间对茚并[l，2，3-cd]芘均有不同程度的降解，其适宜的温度为30 45°C，最适宜温度为35°C，当温度高于50°C易于失活变性， 在最适宜温度条件下反应M小时对茚并[l，2，3-cd]芘的降解率为88.7%。
分别向8份pH值为7. 0含有茚并[1，2，3-cd]芘浓度为0. 2 μ g/L磷酸缓冲液中加入 012+、&12+、!^2+、1^2+、&)2+、附2+、1%2+、取2+，使离子的浓度为 lmmol/L，然后加入 0. 2mL 的酶配成总体积为5. OmL的反应体系，在30°C条件下反应M小时，加入0. 3mL浓度为2. Omol/L 的HCl终止酶反应。同时分别设定不加酶和不加金属离子的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力，以确定各离子对酶活性的影响。结果表明，浓度为lmmol/ L的Cu2+、Zn2\ Hg2+离子对酶活性有较强的抑制作用。
权利要求
1.一种能够催化降解茚并[1，2，3-Cd]芘的酶，其特征在于，该酶由潘多拉菌 Pandoraea sp.的菌液经过提取与纯化得到的，潘多拉菌Pandoraea sp.的菌种保藏号为 CGMCC NO. 3615。
2.根据权利要求1所述能够催化降解茚并[l，2，3-cd]芘的酶，其特征在于，该酶在进行降催化解茚并[1，2，3-cd]芘时，适宜pH值为6. O 8. 0，最适宜pH值为7. 0，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30 45°C，最适宜反应温度为35°C，当温度高于50°C易于失活变性，浓度为lmmol/L的Cu2+、ai2+、Hg2+离子对降解酶活性有较强的抑制作用。
全文摘要
本发明提供一种能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶。所述能够催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶由潘多拉菌Pandoraea sp.的菌液经过提取与纯化得到的，该潘多拉菌Pandoraea sp.的菌种保藏号为CGMCC NO.3615。该酶在进行催化降解茚并[1，2，3-cd]芘时，适宜pH值为6.0～8.0，最适宜pH值为7.0，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30～45℃，最适宜反应温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，浓度为1mmol/L的Cu2+、Zn2+、Hg2+离子对酶的活性有较强抑制作用。本发明提供的酶可以有效催化降解茚并[1，2，3-cd]芘，对于多环芳烃茚并[1，2，3-cd]芘污染土壤及水体有应用潜力。
文档编号C12R1/01GK102533682SQ20111043589
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者丁爱中, 李帅冉, 杜勇超, 王鸿婷, 豆俊峰 申请人:北京师范大学