阿维菌素的优化生产方法

专利名称：阿维菌素的优化生产方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的方法，具体是一种阿维菌素的优化生产方法。
背景技术：
阿维菌素具有高效、广谱的抗各种线虫和人类寄生虫的活性，被广泛地用于农业和畜牧业的病虫害防治。从阿维链霉菌中共可分离得到八种阿维菌素组分，其中唯一有抗虫活性的是组分Bla。另外，阿维链霉菌在发酵生产的过程中还会产生有毒副产物寡霉素。阿维链霉菌的全基因组测序已经完成，阿维菌素生物合成基因簇也已经克隆定位 (Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, Shinose M, Kikuchi H, Shiba T, Sakaki Y, Hattori M, Omura S. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis.(对工业微生物阿维链霉菌进行完整的基因组测序和比较分析)Nat Biotechnol2003,21 :526-531) 0但是目前很多调节阿维菌素产量的因子尚不知其功能。虽然已有不少关于提高阿维菌素产量的研究，但是目前还没有基于提高阿维菌素的外排效率来提高其产量的研究。腺苷三磷酸结合盒转运蛋白，由于含有一个腺苷三磷酸结合盒(ATP-binding cassette, ABC)而得名，可简称为ABC转运蛋白。ABC转运蛋白是膜整合蛋白，它利用水解ATP的能量对溶质中各种生物分子进行跨膜转运。其转运的底物包括糖、氨基酸、 金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢产物和药物等(Hollenstein K，Dawson RJ, Locher KP. Structure and mechanism of ABC transporter proteins. (ABC 转运蛋白的结构禾口机制)Curr Opin Struc Biol2007，17 :412-418)。ABC转运蛋白的核心结构通常由4个结构域组成，包括2个高度疏水的跨膜结构域(Transmembrane domain，TMD)，禾口 2 个核苷酸结合域(Nucleotide-binding domain， NBD)。TMD和NBD结构域只有在形成二聚体时才具有转运活性。真核生物的ABC转运蛋白比较常见的是，4个不同的结构域位于同一条多肽链上，称为“全分子”ABC转运蛋白；2个结构域在1个亚基上(1个TMD与1个NBD融合)的情况也会发生，称为“半分子” ABC转运蛋白。而在原核生物中，常见的是每1个结构域构成1个亚基，称为“1/4分子”ABC转运蛋白，但也会存在1个亚基上具有2个或2个以上的结构域(Kerr ID, Jones PM, George AM. Multidrug efflux pumps :the structures of prokaryotic ATP-binding cassette transporter efflux pumps and implications for our understanding of eukaryotic P-glycoproteins and homologues.(多药物外排蛋白原核生物ABC外排蛋白的结构及其对于理解真核生物P-糖蛋白与其同源物的启示)FEBS J 2010,277:550-563)。ABC转运蛋白广泛存在于真核和原核生物中，目前已知人类基因组中有48个ABC 转运蛋白超家族成员。在大肠杆菌K-12基因组中，至少有80个编码ABC转运蛋白的基因， 约占基因组的5%。近些年，对于ABC转运蛋白的研究热点主要集中在与多药耐药性(Multidrugresistance,MDR)相关的人类ABC转运蛋白上。肿瘤细胞的MDR是导致化疗失败的主要原因。早期的研究发现，MDR与细胞膜上某些蛋白的表达水平密切相关，由此找到了第一个与 MDR相关的人类ABC转运蛋白——P-糖蛋白(P-glycoproteimPgp)。随后，研究者们又发现了以多种机制参与MDR形成的其它ABC转运蛋白均具有药物排出泵的功能。现在人们将肿瘤细胞MDR的主要原因归于一个高度保守(从细菌到人类)的跨膜蛋白家族某些成员的过度表达，而这个家族正是ABC转运蛋白超家族。对全基因组已测序的阿维链霉菌进行生物信息学的分析。结果发现，在阿维链霉菌的基因组里包含NBD结构域的蛋白有148个，包含TMD结构域的蛋白有183个，约占基因组的4.4%。阿维链霉菌拥有如此众多的ABC转运蛋白基因主要有两个原因。一是它能产生多种次生代谢产物。从阿维链霉菌中能分离到大环内酯、萜类等多种不同的次生代谢产物，如果不跨膜转运出细胞质或者通过区室化使其离开细胞质，则其中大多数都会对链霉菌本身产生毒害作用。二是链霉菌直接接触的环境中化合物丰富，化学成分极其复杂，很多化合物对其具有毒性。跨膜转运一些对细胞有毒的物质对细胞的存活至关重要，而ABC转运蛋白可能在其中起着重要作用。sav933, sav934是位于阿维菌素生物合成基因簇上游的两个基因，紧邻全局调控因子 aveR(Kitani S, Ikeda H, Sakamoto Τ, Noguchi S, Nihira Τ. Characterization of a regulatory gene, aveR, for the biosynthesis of avermectin in Streptomyces avermitilis.(阐明阿维链霉菌中一个与阿维菌素生物合成相关的调控基因aveR)Appl Microbiol Biotech 2009，82 1089-1096)。对 sav933、sav934 进行生物信息学的分析，推测它们编码的产物是属于ABC转运蛋白家族。sav933编码一个核苷酸结合域(NBD)，推测它是位于胞内的ABC转运蛋白ATP结合亚基。sav934编码一个跨膜结构域(TMD)，具有6 个典型的跨膜区，推测它是ABC转运蛋白跨膜亚基。它们是典型的原核生物“每1个结构域构成1个亚基”模式。1个跨膜结构域TMD和1个核苷酸结合域NBD并不能形成有功能的 ABC转运蛋白，只有当它们再形成同源二聚体的时候，才能成为有功能的ABC转运蛋白。目前，与阿维菌素外排相关的基因并没有相关研究报道。对SAV933、SAV934进行详细的生物信息学比对，发现它们与崔西杆菌素外排蛋白BcrA有较高的同源性，并且与人类抗伊维菌素的ABC转运蛋白Pgp具有较高的二级结构同源性。这说明SAV933、SAV934 极有可能与阿维菌素或者其中间产物的转运相关。通过构建sav933、sav934的缺失突变株、定量分析胞内胞外阿维菌素，证实了 SaV933、sav934与阿维菌素的转运有关。本发明根据之前研究的空白和这一发现，设计了一个全新的提高阿维菌素产量的方法及质粒，将负责阿维菌素外排的基因构建在高拷贝载体上，构建的质粒可以在阿维链霉菌菌株中进行表达，最大限度地减少胞内反馈抑制，增加代谢产物的积累，有效提高阿维菌素有效组分Bla 的产量。

发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种阿维菌素的优化生产方法及其质粒，通过在抗生素生产菌株里超量表达相应的药物转运蛋白以增加抗生素的外排效率，从而通过减少反馈抑制来增加其产量。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种阿维菌素的优化生产方法，通过构建带sav933基因和sav934基因的高拷贝质粒pFAveT，并将所述的高拷贝质粒转入阿维链霉菌NRRL 8165或阿维链霉菌 3-115中，实现阿维菌素产量的提高。所述的sav933基因如kq ID No. 1所示，是指ABC转运蛋白ATP结合亚基基因；所述的sav934基因如kq ID No. 2所示，是指ABC转运蛋白跨膜亚基基因；所述的构建是指将质粒!^osmid 20B4用KpnI酶切，回收包含有sav933、sav934 的4. 5kb片段，回收的片段插入载体pJTU1278 KpnI酶切位点中。所述的高拷贝是指因为目标质粒带PlJlOl复制子，所以每个链霉菌细胞中目标质粒的拷贝数达40-300的现象，首次记载于公开文献《plJlOl，a multi-copy broad host-range Streptomyces plasmid :functional analysis and development of DNA cloning vectors.(一个高拷贝且具有广谱宿主性的链霉菌质粒plJlOl的功能分析和DNA 克隆载体的发展)》中，作者Kieser T, Hopwood DA, Wright HM, Thompson CJ. (Mol Gen Genet, 1982，185 :223-228)。所述的载体PJTU1278是含有硫链丝菌素抗性基因带piJlOl复制子的高拷贝链霉菌游离型载体，首次记载于公开文献《Two pHZ1358-derivative vectors for efficient gene knockout in Str印tomyces.(用于链霉菌属高效基因敲除的两种pHZ1358衍生载 #)》巾，## :He Y, Wang Ζ, Bai L, Liang J, Zhou X,Deng Z. (Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010，20 :678-682),该载体保存于大肠杆菌菌株 DH10B, DHIOB/ pJTU1278(大肠埃希氏菌hcherichia coli DH10B/pJTU1278)已提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101 (中国微生物研究所)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏登记编号为CGMCC N0. 5594，保藏日期2011-12-15。所述的质粒R)smid 20B4,是指对阿维链霉菌构建基因组文库，阿维链霉菌的DNA 片段被克隆到含有大肠杆菌F因子的黏粒中，Fosmid 20B4包含阿维菌素生物合成基因簇及其上游的部分基因。所述的转入是指将构建的质粒pFAveT转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，与经水浴热激后的链霉菌孢子置于培养基平板上进行共培养。具体步骤包括将构建的质粒 PFAveT转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中并挑转化子在液体LB培养基中培养携带有转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，37°C培养，OD600 = 0. 4-0. 6左右时收集菌体，用新鲜LB 培养基洗涤菌体2次备用；将链霉菌孢子悬浮于3mLTES缓冲液中，然后在50°C水浴中热激 lOmin，冷却至室温后加入等体积孢子预萌发培养基，37°C摇床培养2-2. 5小时，离心收集孢子并用新鲜LB培养基洗涤1次，重新悬浮于适量的LB培养基中，按2女IO8 IO8与大肠杆菌细胞混合后涂在SFM培养基平板上，吹干后放在30°C培养箱中进行培养，16-24小时后用含萘啶酮酸和硫链丝菌素的ImL无菌水覆盖平板，置30°C培养4-7天后即可看到接合转移子。所述的液体LB培养基内含有终浓度为25 μ g/mL的氯霉素，50 μ g/mL的卡那霉素和100 μ g/mL的氨苄青霉素。所述的TES缓冲液的浓度为0. 05mol/L, pH值为8. 0。所述的孢子预萌发培养基组分为=Difco酵母粉(m/v)，Difco酪蛋白氨基酸 1% (m/v)，CaCl2 0. 01mol/L。
所述的SFM培养基平板组分为2%琼脂(m/v)，2%甘露醇(m/v)，2 %黄豆饼粉 (m/v)，培养平板pH值为7. 2 7. 5。所述的无菌水覆盖平板，添加萘啶酮酸的终浓度为50yg/mL，硫链丝菌素为 12.5 μ g/mL0所述的大肠杆菌ET12567/pUZ8002首次记载于公开文献《Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor σ E is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3Q)(位于外细胞质的σ E是天蓝色链霉菌 A3 (2)正常细胞壁形成所必须的功能因子)》，作者Paget MS, Chamberlin L，Atrih A, Foster SJ, Buttner MJ. (J Bacteriol,1999,181 :204-211)。所述的阿维链霉菌NRRL 8165是指阿维菌素的原始产生菌株，首次记载于公开文献《Avermectins，new family of potent anthelmintic agent !Producing organism and fermentation.(高效杀虫剂的新家族阿维菌素的产生菌株及发酵)》，作者Burg Rff, Miller BM, Baker EE, Birnbaum J, Currie SA, Hartman R, Kong YL, Monaghan RL, Olson G, Putter I, Tunac JB, Wallick H, Stapley E0, Oiwa R, Omura S. (Antimicrob Agents Chemother, 1979，15 :361-367)。该菌株保藏在位于华盛顿特区独立大道1400号，邮编 20250的美国农业研究菌种保藏中心NRRL，编号为NRRL 8165，该菌株可通过购买的方式公开获得。所述的阿维链霉菌3-115 (CGMCC No. 3229)是指阿维菌素Bla的工业高产菌株， 张立新实验室通过多轮传统诱变育种的方式制备得到，阿维菌素Bla组分的产量相比于 ATCC31267 提高了 ；35 倍，达到 4167mg/L。上述阿维链霉菌3-115首次记载于公开文献《Identification of avermectin-high-producing strains by high-throughput screening methods (通过高通量筛选法确定阿维菌素高产菌株)》，作者=Gao H，Liu M，Zhou X，Liu J，Zhuo Y，Gou Z， Xu B, Zhang W, Liu X, Luo A, Zheng C, Chen X, Zhang L. (Appl Microbiol Biotechnol, 2010,85 :1219-1225)，在此文献中公开了其保藏编号为CGMCC N0. 32四。所述的阿维链霉菌3-115(阿维链霉菌 Mi^ptomyces avermitilis ZLX6003) 已提交位于北京市朝阳区大屯路，邮编100101(中国微生物研究所)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏登记编号为CGMCC N0. 3229，保藏日期 2009-8-18，其保藏名称为ZLX6003。上述基因工程菌株可应用于工业生产阿维菌素，阿维菌素为兽用杀虫、杀螨剂，对螨类和昆虫具有胃毒和触杀作用，主要用于清除家禽、家畜体内外寄生虫和农作物害虫。本发明提供了一种提高链霉菌抗生素产量的方法和质粒，将对抗生素的外排有促进作用的2个基因构建在一个载体上，利用接合转移转入链霉菌中同时进行高效表达以提
高抗生素的产量。


图1为表达质粒pFAveT的构建图。图2为菌株8165/pFAveT中aveAIII、sav933、sav9;34基因表达量的实时定量 RT-PCR检测图。
图3为高效液相色谱法定量分析SaV933、SaV934基因高拷贝菌株8165/pFAveT相比于带空载体的对照菌株8165/pJTU1278阿维菌素Bla组分和副产物寡霉素A组分的产量变化图。图4为阿维菌素Bla组分的标准曲线图。图5为定量分析工业高拷贝菌株3-115/pFAveT相比于对照菌株3_115/pJTU1278 阿维菌素Bla组分的产量变化图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1阿维链霉菌目标抗生素产量的提高随着分子生物学以及生物工程技术在抗生素育种领域的应用，基因工程育种技术已成为主要的工业生产菌种改良手段。本发明是通过提高抗生素的主动外排效率来提高抗生素的产量。具体的操作是通过基因工程技术将负责抗生素外排的目的基因与载体在体外连接，然后转入受体细胞，使抗生素外排基因在受体中高效表达遗传。(一)质粒的构建(用于转入宿主高表达目的基因)用于sav933、sav934基因超量表达的质粒构建KpnI酶解阿维链霉菌NRRL 8165基因组文库F黏粒i^osmid 20B4,回收包含有 sav933、sav9;34基因的4. 5-1Λ KpnI-KpnI DNA片段。回收片段被克隆在pJTU1278 (大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒)KpnI位点，从而得到用于在阿维链霉菌中超量表达sav933、sav934 基因的质粒pFAveT。图1为本实施例中涉及的表达质粒构建图。保存于大肠杆菌菌株DHlOB 中的该表达质粒，即大肠埃希氏菌Escherichia coli DHlOB/pFAveT已于2011年12月15 日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101 (中国微生物研究所)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏登记编号为CGMCC No. 5595。(二)把sav933、sav934基因高拷贝质粒转入野生型宿主通过电转把PJTU1278衍生质粒pFAveT和空载体pJTU1278分别转入大肠杆菌 ET12567(携带接合转移辅助质粒pUZ8002)中，以便于pFAveT在辅助质粒pUZ8002的协助下，通过接合转移进入受体阿维链霉菌NRRL 8165细胞中。将过夜培养的携带pUZ8002和待转移质粒的大肠杆菌ET12567以1 10的接种量转接到带合适的抗生素(终浓度氨苄青霉素100 μ g/mL、卡那霉素50 μ g/mL、氯霉素25 μ g/mL)的新鲜LB培养基(1%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，0. 5% NaCl，pH7. 0)中 37°C培养。2-2. 5 小时后(OD600 = 0. 4-0. 6 左右)收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体2次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将培养3-5天的链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液(3mL 0. 05mol/L, pH 8.0)中， 在50°C水浴中热激lOmin，冷却至室温后加入等体积孢子预萌发培养基(Difco酵母粉1 %， Difco酪蛋白氨基酸1 %，CaCl2 0. 01mol/L)，37°C摇床Q20rpm)培养2-2. 5小时，离心收集孢子并用新鲜LB培养基洗涤1次，重新均勻悬浮于适量的LB培养基中，按2 1与大肠杆菌细胞混合后涂在培养平板琼脂糖，2%甘露醇，2%黄豆饼粉，pH 7. 2 7. 5)上， 进行细菌双亲接合转移。16-M小时后用含萘啶酮酸(抑制大肠杆菌的生长)和硫链丝菌素(转入质粒带有此抗性)的ImL无菌水覆盖平板(终浓度萘啶酮酸50 μ g/mL ；硫链丝菌素12. 5 μ g/mL)，置30°C培养4_7天后即可看到接合转移子。(三)基因工程菌株的筛选和验证从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到抗性(硫链丝菌素)平板上进一步确认抗性。将抗性验证正确的单菌落在SFM平板上扩大培养。将收下的孢子接入20mL含硫链丝菌素(8 μ g/mL)的TSBY培养基(3%胰豆蛋白胨，0. 5% Difco酵母粉，10. 3%蔗糖)中30°C 摇床培养，从中提质粒并反转大肠杆菌DH10B，证实目标质粒已转入链霉菌中，从而最终确证了目标基因工程菌株的正确性。筛选到的基因工程菌株命名为8165/pFAveT。上述8165/pFAveT，即阿维链霉菌 Mi^ptomyces avermitilis 8165/pFAveT 已于 2011年12月15日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101 (中国微生物研究所)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏登记编号为 CGMCC No. 5592。(四)基因工程菌株中目标基因表达量的实时定量RT-PCR检测(1)阿维链霉菌RNA的提取待检测的菌种8165/pJTU1278、8165/pFAveT在TSBY液体培养基中培养小时后涂于SFM平板。30°C在SFM平板上生长3天后用牙签刮下平板表面的菌丝体。将刮出的菌丝体浸入含ImL Redzol的勻浆柱，震荡均勻。15_30°C勻浆。12，500转离心1分钟 (4°C )，取上清至新的1.5mL离心管中。加入0.2mL氯仿，震荡均勻，15-30°C放置10分钟。 13，000转离心15分钟。将无色上层(RNA在无色上层)转入新的1. 5mL离心管，加入200 μ L 乙醇。颠倒混勻后转入SiMax membrane spin column，放置3分钟，10，000转离心3分钟。弃废液，加入600 μ L RNA washing buffer, 10, 000转离心1分钟，弃废液。14，800转离心2分钟，将上柱放入新的1.5mL离心管，重复一次。管子在空气中放置5-10分钟彻底晾干。加50 μ L DEPC水在膜中间溶解RNA，30°C放置1-2分钟，14，800转离心1分钟。再加30 μ L DEPC水在膜中间，重复一遍，增加RNA的得率。O) DNA 的消化取适量RNA (1-10 μ g)，加入 10 * 反应缓冲液 5 μ 1，RNase 抑制剂 0. 5 μ 1，DNase Idu/μ 1)5μ 1，用DEPC处理过的水定容到50μ 1。37°C温浴4小时。1 10加入25mM EDTA (保护RNA)，65°C干浴10分钟，失活DNase I。(3)反转录生产cDNA链PCR 反应体系0. 1-5 μ g 模板总 RNA, 1 μ 1 弓丨物 random hexamer primer,用 DEPC 处理过的水定容至Ι μ 。对于高GC的模板，65°C温浴5分钟后，在冰上冷却。再按顺序加入 4 μ 15 * 反应缓冲液，1 μ 1 RNase 抑制剂(20u/ μ 1)，2 μ 1 dNTP (IOmM)，2 μ 1 M-MuLV Reverse Transcriptase(20u/μ 1)。PCR反应的循环条件为25 °C (5分钟),42V (60分钟)，70°C (5分钟)。(4) SYBR GREEN法实时定量RT-PCR检测目标基因的表达量SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，使用以它作为荧光染料的试剂盒进行实时定量RT-PCR。以从阿维链霉菌提取的总RNA反转的cDNA为模板，hrdB为内参，选用 Δ ACT法，扩增sav9333、sav934基因和阿维菌素结构基因aveAIII，检测其在基因工程菌株中的表达量。检测结果表明sav933、sav934基因高拷贝菌株8165/pFAveT相比于带空载体的对照菌株8165/pJTU1278，sav9333、sav9;34基因的表达量提高了 100 7)倍左右，而阿维菌素结构基因aveAIII的表达量则没有明显变化(见图2)。实时定量RT-PCR检测目标基因表达量的条件引物DQ18F (hrdB 正向引物)，5 ‘ -GCAGCCTCAACCAGATCCTC-3 ‘
DQ18R(hrdB 反向引物)，5 ‘ -TTGGCAGTCACCGTCTTCG-3 ‘AveA3-R3，5‘ -ATCCGCAGCAGCGGTTGT-3‘AveA3-R4，5‘ -CGTTGCCGATGTAGCCCTC-3‘SAV933-R3，5‘ -GCGGGTGGCGGTCATTCT-3‘SAV933-R4,5' -GCTTGGTCAGATCCGTGACTTCG-3‘SAV934-R3，5‘ -CTGCTGCTGGCCTTCGTGC-3‘SAV934-R4,5' -GAAGAGCGGACTGAAGTTGACG-3‘PCR 反应体系12· 5μ 1 2 * Maxima SYBR Green qPCR Master Mix，引物各 0.311|1，5001^模板0嫩，用不含核酸酶的水定容至25111。PCR反应的循环条件为50°C (20 秒)，95°C (10分钟)；40个循环的95°C (15秒)，60°C (1分钟)；最后是95°C (15秒)， 600C (1 分钟)，95°C (30 秒)，60°C (15 秒)。(五)突变菌株的发酵培养平板发酵2 %琼脂糖，2 %甘露醇，2 %黄豆饼粉(煮沸熬制后过滤去渣)，pH7. 2 7. 5，TSBY中培养了 36小时的菌丝体取ImL接种，30°C发酵14天。液体发酵14%玉米淀粉，2. 8%豆粕粉，1.0%酵母粉，0.5% (NH4) 2S04 (5 % ), 0. 2% CoCl2(l% ) ,0. 22% Na2MoO4(1% ) ,0. 23% MnSO4(0. 1% ) ,0. 01%淀粉酶，0· 08% (调 pH后加入)CaCO3, ρΗ7· 45 7. 5，装量30mL/瓶，种子培养基3. 0 %玉米淀粉，0. 8 %豆粕粉，1. 0%花生饼粉，0. 4%酵母粉，0. 3% CoCl2(1% ),0.01%淀粉酶淀粉酶，pH 6. 86 6. 9，装量40mL/瓶中生长40 48小时的菌丝体取1. 5mL接种，28°C发酵10天。(六)抗生素的分离纯化平板发酵将平板浸泡在甲醇中，过夜萃取，萃取液45°C旋转蒸干后重溶于ImL甲醇，0. 22微米滤膜过滤后-30°C保存以备检测。液体发酵取ImL发酵液加入盛有9mL甲醇的50mL管中，200转振摇6小时以上， 8000转离心5分钟；取上清ImL左右，以0. 22微米的滤膜过滤后_30°C保存以备检测。(七)高效液相色谱法检测发酵产物高效液相色谱(HPLC)检测结果表明基因工程菌株8165/pFAveT中阿维菌素Bla 组分的产量相比于对照菌株提高到1. 7-4. 3倍，而寡霉素A组分的产量却没有明显的变化 (见图3)。检测是在安捷伦公司的仪器Agilent Technologies 1200 series HPLC上进行。 高效液相色谱的工作条件为柱子(Agilent SB C18 column, 2. 1 X 150mm, 3. 5 μ m)；流速 0. lmL/min ；流动相85%甲醇和15%去离子水；检测波长:246nm ；柱温25°C。实施例2制备阿维菌素的工业高产菌株步骤一，把质粒转入链霉菌宿主以及接合转移子的筛选和验证把sav933、sav934高拷贝质粒pFAveT通过接合转移转入阿维链霉菌工业菌株3-115细胞中，通过硫链丝菌素抗性验证、从链霉菌中提质粒并反转大肠杆菌DH10B，筛选到一株正确的基因工程菌株，将其命名为3-115/pFAveT。再把空载体pJTU1278通过接合转移转入阿维链霉菌3-115细胞中，同样的方法筛选并得到对照菌株3-115/pJTU1278。上述3-115/pFAveT，即阿维链霉菌 Mi^ptomyces avermitilis 3-115/pFAveT 已于2011年12月15日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101 (中国微生物研究所)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏登记编号为 CGMCC No. 5593。步骤二，菌株发酵以及抗生素的提取和检测。采用平板发酵和液体发酵两种发酵方式，对3-115/pJTU1278、3-115/pFAVeT这两株菌进行了发酵。并对发酵产物中阿维菌素Bla组分进行了提取和检测。从Sigma公司购买阿维菌素Bla组分的标准品，将其配制成0mg/mL、0. 25mg/mL、 0. 50mg/mL、0. 75mg/mL、1. Omg/mL这5个浓度。用HPLC检测这5个浓度标准品的峰面积，绘制标准曲线，用于计算不同峰面积对应的阿维菌素Bla的浓度，从而定量分析基因工程菌株中阿维菌素Bla组分的产量(图4)。图5为基因工程菌株3-115/pFAveT以对照菌株3_115/pJTU1278的发酵液作为空白对照，对产生的阿维菌素Bla组分的产量进行分析。所有的实验重复三次，基因工程菌株与对照菌株同时进行平行发酵检测，结果表明，固体发酵时基因工程菌株中阿维菌素 Bla组分的产量提高了 90%，平均产量大约从96mg/l(3-115/pJTU1278)提高到约18ang/ 1 (3-115/pFAveT)；液体发酵时基因工程菌株3-115/pFAveT中阿维菌素Bla组分的产量提高了约 30%。平均产量从 3. 3g/l (3-115/pJTU1278)提高到约 4. 3g/l (3-115/pFAveT)。
权利要求
1.一种阿维菌素的优化生产方法，其特征在于，通过构建带sav933基因和sav934基因的高拷贝质粒pFAveT，并将所述的高拷贝质粒转入阿维链霉菌NRRL 8165或阿维链霉菌 3-115中，实现阿维菌素产量的提高；所述的sav933基因如kq ID No. 1所示，是指ABC转运蛋白ATP结合亚基基因；所述的sav934基因如kq ID No. 2所示，是指ABC转运蛋白跨膜亚基基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的构建是指将质粒R)smid20B4用 KpnI酶切，回收包含有sav933、sav934的4. 5kb片段，回收的片段插入载体pJTU1278 KpnI 酶切位点中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的载体PJTU1278是含有硫链丝菌素抗性基因带PiJioi复制子的链霉菌游离型载体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的质粒R)smid20B4，是指对阿维链霉菌构建基因组文库，阿维链霉菌的DNA片段被克隆到含有大肠杆菌F因子的黏粒中， Fosmid20B4包含阿维菌素生物合成基因簇及其上游的部分基因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的转入是指将构建的质粒PFAveT转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，与经水浴热激后的链霉菌孢子置于培养基平板上进行共培养。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征是，所述的转入具体步骤包括将构建的质粒pFAveT转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中并挑转化子在液体LB培养基中培养携带有转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，37°C培养，OD600 = 0. 4-0. 6左右时收集菌体，用新鲜 LB培养基洗涤菌体2次备用；将阿维链霉菌3-115的孢子悬浮于3mL TES缓冲液中，然后在50°C水浴中热激lOmin， 冷却至室温后加入等体积孢子预萌发培养基，37°C摇床培养2-2. 5小时，离心收集孢子并用新鲜LB培养基洗涤1次，重新悬浮于适量的LB培养基中，按2 * IO8 IO8与大肠杆菌细胞混合后涂在SFM培养基平板上吹干后放在30°C培养箱中进行培养，16-24小时后用含萘啶酮酸和硫链丝菌素的ImL无菌水覆盖平板，置30°C培养4-7天后即可看到接合转移子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的液体LB培养基内含有终浓度为 25 μ g/mL的氯霉素，50 μ g/mL的卡那霉素和100 μ g/mL的氨苄青霉素。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的TES缓冲液的浓度为0.05mol/L, pH 值为8.0。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的孢子预萌发培养基组分为=DfTco酵母粉 (m/v)，Difco 酪蛋白氨基酸 (m/v), CaCl2 0. Olmol/L。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的培养基平板组分为2%琼脂糖(m/ ν)，2%甘露醇(m/v)，2%黄豆饼粉(m/v)，培养平板pH值为7. 2 7. 5。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的无菌水覆盖平板上萘啶酮酸的终浓度为50 μ g/mL，硫链丝菌素为12. 5 μ g/mL。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的阿维链霉菌3-115，即阿维链霉菌 Streptomyces avermitilis ZLX6003，其保藏号为 CGMCC No. 3229。
13.一种质粒pFAveT，其特征在于，通过将质粒R)smid 20B4用KpnI酶切，回收包含有 sav933、sav934的4. 5kb片段，回收的片段插入载体pJTU1278KpnI酶切位点中得到。
14.一种质粒pFAveT的应用，其特征在于，将该质粒用于制备阿维菌素的工业菌株。
15.一种基因工程菌株，其特征在于，根据权利要求1-12中任一所述方法制备得到； 该基因工程菌株包括阿维链霉菌Mi^ptomyces avermitilis 8165/pFAveT和阿维链霉菌 Mi^ptomyces avermitilis 3-115/pFAveT，其保藏登记编号分别为 CGMCC No. 5592 和 CGMCCNo. 5593。
16.一种根据权利要求15所述基因工程菌株的应用，其特征在于，将所述基因工程菌株生产用于清除家禽、家畜体内外寄生虫和农作物害虫的阿维菌素。
全文摘要
一种生物医药技术领域的阿维菌素的优化生产方法，通过构建包含sav933基因和sav934基因的超量表达质粒pFAveT，并将所述的表达质粒转入阿维链霉菌3-115中，实现产量的提高。本发明在抗生素工业生产菌株里超量表达外排基因以增加特定抗生素的产量。
文档编号C12N1/21GK102517321SQ201110448749
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者朱冬青, 白林泉, 邓子新, 邱竞帆 申请人:上海交通大学