专利名称：在植物体细胞胚胎发生中从多孔基材除去液体的方法
在植物体細胞胚胎发生中从多孔基材除去液体的方法
背景技术：
现代育林往往需要种植大量已经选定的、在基因上相同的植物以具有有益的特性。通过有性繁殖产生新植物，这生长出植物种子，通常是不可行的。通过培养体細胞或合子胚胎的无性繁殖已被证明针对ー些物种生长出大量的在基因上相同的胚胎，每ー个胚胎均有能力发育成为正常的植物。体細胞克隆是除雄雌交配以外的从植物组织创造在基因上相同的植物的方法。在体細胞克隆的方法之一中，在包含诸如生长素和/或細胞分裂素的激素的初始培养基中培养植物组织，以开始形成能够发育成体細胞胚胎的诸如胚性胚柄团的胚性组织。然后在促进胚性组织的定居和増殖的増殖培养基中进ー步培养胚性组织以形成子叶前期胚胎(即， 不具备子叶的胚胎)。然后在促进子叶体細胞胚胎的发育和成熟的发育培养基中培养子叶前期胚胎，所述子叶体細胞胚胎能够例如被放置在萌芽培养基上以生芽，并且随后被转移到土壌中进ー步生长，或者可替代地，放置到加工的种子中并播种到土壌里，种子在土壌中发芽以生长出籽苗。例如在美国专利No. 5，564，224、No. 5，687，504、No. 5，701，699、和 No. 6，119，395中描述了加工的种子。体細胞胚胎发生过程通常是费カ且无效率的。例如，在过程中步骤中的一个步骤涉及从液体増殖培养基中移动胚性组织以及随后在用于胚胎发育和成熟的半固体培养基表面上以低密度接种。该步骤通常由熟练的技术人员人工地使用移液管将胚性細胞和液体培养基的混合物分配到发育培养基上来完成。胚胎形成过程中的另ー个劳动密集型步骤是从发育培养基选择性地收获适合于萌芽的単独的胚胎。在发育阶段结束吋，胚胎可能会呈现在成熟和发育的多个阶段中。使用多种视觉评估筛选标准优选地选定那些最可能成功地生长成正常植物的胚胎，并且使用一对镊子人工地将胚胎拔出发育培养基，所述筛选标准诸如胚胎的大小、形状(例如，轴对称)、子叶发育、表面纹理、颜色等。然后小心地布置选定的理想胚胎，并将它们相互分离用于进一歩处理。这是ー项技术精湛而繁琐的工作，是费时且昂贵的。此外，当最终期望的产量是数以百万计的植物吋，该步骤遇到重大的生产瓶颈。已经对使体細胞胚胎发生过程自动化做出了努力。扩大规模和使体細胞胚胎发生技术自动化可能涉及为了稀释和/或对未成熟胚胎和成熟胚胎的切单(singulation)的目的使用大量的液体培养基或水，以便移动和放置胚胎用于随后的处理步骤。例如，在增殖阶段结束时可能会稀释悬浮培养液以便促进将子叶前期胚胎均勻接种在发育培养基上。使用大量的液体的另ー个例子是在切单步骤中。切单是发生在发育和成熟期结束时的加工步骤，在该步骤中，使胚胎物理地相互分离并且在进ー步加工之前将胚胎放在胚形胚柄团(ESM)下面，所述进一歩加工例如插入到已加工的种子中、或在插入到已加工的种子中之前放置到萌芽培养基或萌芽前期培养基上用于进ー步处理。切单可以通过如下步骤来完成用液体喷洒胚胎和附着的ESM以将胚胎和附着的ESM从发育培养基除去；使用一系列筛子将胚胎和残余ESM相互分离；将胚胎放置到大量液体中；随后将单独的胚胎放置到多孔基材上。
在接种步骤和/或切单步骤中，在其上布置有胚胎的基材上出现过多液体可能是有问题的。在凝胶-細胞界面处避免过度潮湿和液体培养基激素残留物的截留对优质胚胎发育是至关重要的。此外，在其上布置有胚胎的基材上出现液体会对萌芽有显著的负面影响。因此，需要在不损害胚胎或不干扰胚胎在基材上的位置的情况下，从胚胎表面和其上布置有胚胎的基材除去液体的方法。本发明解决这些和其它需要。
发明内容
本发明提供了从其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液体的方法。本发明的方法包括如下步骤(a)提供具有顶表面和底表面的多孔基材；(b)将植物胚胎布置到多孔基材的顶表面上；(c)提供与真空源相连通的进气ロ，其中进气ロ的横截面面积小于多孔基材的底表面面积；(d)在进气ロ与真空源相连通吋，使进气口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，所述多孔基材具有布置在相应的顶表面上的植物胚胎，从而对接近进气ロ的多孔基材的底表面的所述部分施加真空；以及(e)在进气ロ与真空源相连通的同吋，使进气口和多孔基材的底表面彼此相对移动，直到基本上多孔基材的底表面的所有的期望区域已经接近进气ロ为止，从而从其上布置有植物胚胎的多孔基材的期望区域除去液体。
当结合附图时，通过參考下列详细描述，本发明的上述方面和许多所附优势将变得更容易理解，其中图1示意性地示出用于在根据本发明的方法的实施例中使用的示例性真空系统； 以及图2示意性地示出本发明的方法的实施例，在该实施例中，多孔基材被移动越过真空壳体中的开ロ，其中胚胎布置在多孔基材的顶表面上。
具体实施例方式此处所使用的术语“胚性胚柄团”(ESM)是指在萌芽和卵裂繁殖过程中的早期阶段胚胎。此处所使用的术语“胚性组织”是指形成胚形胚柄团的数十到数百个胚性細胞的总称。此处所使用的术语“植物胚胎”是指合子植物胚胎或体細胞植物胚胎。合子植物胚胎是在通过有性繁殖产生的植物种子内部发现的胚胎。体細胞植物胚胎能够通过标准方法在实验室条件下通过培养胚性组织而产生，在所述实验室条件中，使包括组织的細胞相互分离并且促使它们发育成微小完整的胚胎。此处所使用的术语“植物胚胎”包括处于各种发育阶段的胚胎并且包括子叶前期胚胎和子叶胚胎。此处所使用的术语“子叶前期胚胎”是指尚不具备任何子叶的胚胎。此处所使用的术语“子叶胚胎”是指具备ー个或多个子叶的胚胎。此处所使用的术语“液体”是指在胚胎形成过程中所使用的任何液体，包括但不限于水、等渗溶液、或培养基。
此处所使用的术语“接种”是指将胚形胚柄团和/或胚胎分配到表面上的过程。此处所使用的术语“切単”是指将子叶胚胎从胚形胚柄团及其它胚胎分离以产生単独的胚胎的过程。体細胞胚胎发生过程是在试管内使植物胚胎发育的过程。生产植物体细胞胚的方法在本领域中是已知的并且先前已经描述过(例如參见美国专利No. 4，957，866、 No. 5，034，326、No. 5，036，007、No. 5，041，382、No. 5，236，841、No. 5，294，549、 No. 5，482，857、No. 5，563，061、以及No. 5，821，126)。一般地，体细胞胚胎发生过程包括如下步骤(1)引发或诱导，引发形成诸如胚形胚柄团(ESM)的胚性组织，所述胚形胚柄团是包括早期胚胎的白色粘液团，所述早期胚胎具有长的薄壁胚柄，所述薄壁胚柄与带有稠密細胞质和大細胞核的小头连在一起；(2)増殖，有时也被称为维护，使胚性组织定居并繁殖以形成子叶前期胚胎，所述子叶前期胚胎的特征在于具有平滑的胚胎头；C3)发育，发育并形成成熟的子叶体細胞胚；以及(4)后期发育步骤，诸如切单、层积、萌芽、放置到已加工的种子中、以及转移到土壤用于进ー步生长和发育。正如先前在背景技术部分所述的，体細胞胚胎发生过程是劳动密集型的。已经对自动化和规模化过程作出努力以促进成百上千的植物胚胎的生产。例如，能够在商业规模的液体生物反应器中执行増殖步骤。在増殖步骤结束吋，可以将子叶前期胚胎转移到发育
土ロ养基。美国专利No. 7，785，884中描述了将子叶前期胚胎转移到发育培养基的方法。转移步骤可以通过例如如下程序来执行从生物反应器除去一定体积的悬浮培养液；允许细胞沉积并测量沉积的細胞体积；用无菌稀释培养基稀释沉积的細胞体积；将細胞和稀释培养基以期望的密度均勻分散到多孔基材上，所述多孔基材布置在非多孔表面上；从多孔基材除去无菌稀释培养基除去，从而将均勻分散的子叶前期胚胎捕集到多孔基材上；以及将布置有子叶前期胚胎的多孔基材转移到发育培养基。无菌稀释培养基可以通过多种方法从多孔基材除去。例如，可以将多孔基材附接到包括手把的接种框架上，并且可以使用任何适当的手段通过手把将多孔基材竖直地抬起，诸如人工地或通过机器人手段。无菌稀释培养基也可以使用避免干扰已接种的細胞的分布的任何方法除去，所述方法诸如对无菌稀释培养基进行吸入、排水、倾斜、或吸干。上述方法是劳动密集型的，并且涉及转移多孔基材和将細胞布置到数个表面，所述数个表面仅被使用一次或需要被经常操纵以准备被使用额外的次数。在接种和除去液体之后，可以将子叶前期胚胎放置在发育培养基上一段时间以发育成子叶胚胎。在发育期结束吋，子叶胚胎连同未完全发育的胚胎、异常形成的胚胎、尺寸不足的或过大的胚胎、以及其它种类的非胚胎植物材料不同程度地附接到胚柄组织和残余未发育的ESM和其它胚胎并嵌入胚柄组织和残余未发育的ESM和其它胚胎内。对于随后的正常萌芽来说将胚胎从胚柄团和其它胚胎分离以产生的単独的胚胎是重要的。这个分离过程被称为“切単”。至于接种エ艺，切单是劳动密集型的。通常，手工挑选胚胎并使用镊子将胚胎转移到干滤纸或培养基上。自动化切单步骤对于胚胎形成过程的商业规模化以及生产率和工人福利来说是重要的。在自动切单期间，可以采用诸如水或等渗营养液的水性液体将胚胎从发育培养基洗掉，并使胚胎通过一系列筛子。在筛选期间，可以用水性液体进ー步喷洒胚胎以促进除去和洗去任何不期望的材料，诸如尺寸不足的胚胎、组织、以及残余胚柄团。随后可以将已切单的单独胚胎放置在多孔基材上用于进一歩处理。在自动化切单过程结束吋，在胚胎和多孔基材两者的表面上均有自由液体。除去残余液体防止其与胚胎接触是重要的，因为液体接触胚胎会对胚胎的渗透压和水势有深远的有害影响。例如，如果残留液体与胚胎接触，则胚胎的水势产生的变化能够导致不期望的过早绿化和伸长。如上所述，对于将子叶前期胚胎接种到发育培养基上的步骤，以及对子叶胚胎切单的步骤来说，从布置的胚胎的表面和其上布置有胚胎的多孔基材除去自由液体是重要的。本发明人已经发现从植物胚胎的表面和从其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液体的方法，该方法致使与本领域中已知的方法(例如，使用布氏漏斗、抽吸、排水、吸干等)相比更彻底且更一致地除去液体。本发明提供从其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液体的方法。本发明的方法包括如下步骤(a)提供具有顶表面和底表面的多孔基材；(b)将植物胚胎布置到多孔基材的顶表面上；(c)提供与真空源相连通的进气ロ，其中进气ロ的横截面面积小于多孔基材的底表面面积；(d)当进气ロ与真空源相连通吋，使进气口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，所述多孔基材具有布置在相应的顶表面上的植物胚胎，从而对接近进气ロ的多孔基材的底表面部分施加真空；以及(e)在进气ロ与真空源相连通的同吋，使进气口和多孔基材的底表面相对于彼此移动，直到多孔基材的底表面的基本上所有的期望区域已经接近进气ロ为止，从而从其上布置有植物胚胎的多孔基材的期望区域除去液体。在一个实施例中，本发明的方法进ー步包括当进气ロ与真空源相连通吋，重复步骤⑷和(e)直到多孔基材的基本上所有的底表面已经接近进气ロ为止。在一个实施例中，当进气口和多孔基材的底表面相对于彼此移动时，进气ロ持续地与真空源相连通。在一个实施例中，当进气口和多孔基材的底表面相对于彼此移动时，进气ロ间歇地与真空源相连通。在一个实施例中，进气ロ保持静止，并且移动多孔基材越过进气ロ。在一个实施例中，多孔基材保持静止，并且移动进气ロ越过多孔基材的底表面。在一个实施例中，进气ロ 基本上接触多孔基材的底表面。在一个实施例中，本发明的方法进ー步包括如下步骤在进气ロ与真空源相连通的同吋，在进气口和多孔膜的底表面相对于彼此移动时，在布置在多孔基材的顶表面上的胚胎上和在布置在多孔基材的顶表面上的胚胎周围引起空气对流，从而通过蒸发促进从布置的胚胎的表面除去液体。在本发明的实践中有用的多孔基材具有范围从约5微米到约1200微米的孔隙直径，诸如从约50微米至约500微米、诸如从约70微米至约150微米、诸如约100。多孔基材可以具有任何期望的形状和尺寸。为了便于操作并且适合于进一歩处理已布置的胚胎，选择多孔基材的形状和尺寸。适当的形状包括正方形、矩形、或圆形形状。示例性尺寸是从约 4平方英寸至观平方英寸或更大的表面面积，诸如50平方英寸、100平方英寸直至500平方英寸或更大。优选的多孔基材是可消毒的并且强度足以抵抗撕裂。有用的多孔基材的例子包括膜、尼龙纤维、编织网(例如，尼龙、不锈钢或塑料)、自然纤维(例如，棉花)、纸和聚合纤维。在一个实施例中，多孔基材是聚合膜。在一个实施例中，多孔基材是尼龙膜。
为了促进操作和提供支撑，多孔基材可以被安装在框架中。所述框架可以是诸如塑料或金属的任何适当的材料。在一个实施例中，多孔基材是尼龙膜并且被铝框住。具有开ロ的进气ロ可以用任何适当的大小和形状的壳体覆盖，所述壳体诸如具有细长开ロ或喷嘴的矩形壳体。在一个实施例中，在壳体中的开ロ的长度基本上等于ー个尺寸，例如多孔基材的长度或宽度。通常壳体中的开ロ的宽度范围可以从约0.001英寸至一英寸或更大，诸如从约0. 001英寸至约0. 1英寸、诸如从约0. 001英寸至约0. 01英寸。在一个实施例中，壳体是矩形结构，该矩形结构具有长度约5. 25英寸和宽度约0. 002英寸的细长开ロ。取决于多孔基材的尺寸，在壳体中的开ロ的其它宽度可以是合适。植物胚胎可以以任何排列布置在多孔基材上并且可以分布在多孔基材的任何数量的表面面积上。通常，植物胚胎可以分布在多孔基材的表面面积的从约30%至约90%或更大的面积上，诸如在多孔基材的表面面积的从约55%至约85%的面积上。图1中示出在实践本发明的方法中有用的自动化系统的典型实例。參照图1，自动化系统10包括平台20，该平台被划分为两段；多孔基材30，该多孔基材被周围框架支撑，基材30具有顶表面以及底表面，在顶表面上布置有胚胎；机械滑动臂40，该机械滑动臂由马达(未示出)驱动以推挤基材框架的邻接侧；真空壳体50，该真空壳体位于平台20的两段之间，所述真空壳体50具有狭窄细长的开ロ 60 ；真空发生器或泵70，所述真空发生器或泵经由管子80连接到真空壳体50 ；以及控制器90。在实践本发明的方法的实施例中，将多孔基材30放置到平台20的一段上。在将多孔基材30放置到平台20上之前或在将多孔基材30放置到平台20上之后可以将植物胚胎分配到多孔基材30上。机械滑动臂40推动多孔基材30横跨真空壳体50。当移动多孔基材30横跨真空壳体50吋，多孔基材30的底表面接触真空壳体50的开ロ 60，同时开ロ 60与真空70相连通，致使从多孔基材30除去液体并且在胚胎的上方和周围引起空气并且穿过多孔基材30，所述胚胎被布置在多孔基材30的顶表面上。图2示意性地示出将多孔基材30从平台20的一段横跨真空壳体50的开ロ 60移动到在平台20的另ー侧上的段。在一些实施例中，由在本发明的实践中所使用的真空泵所产生的负压范围可以从约-0. 5psi至约_15psi，诸如从约-5psi至约_12psi。在一个实施例中，负压是约-IOpsi。 在一些实施例中，当进气ロ与真空源相连通吋，由真空源所产生的负压是常量。在一些实施例中，当进气ロ与真空源相连通吋，由真空源所产生的负压变化。在一些实施例中，多孔基材和进气ロ以在从约1毫米每秒至约45毫米每秒的范围内的速度相对于彼此移动，诸如从约1毫米每秒至约10毫米每秒。在一个实施例中，多孔基材和进气ロ以约3毫米每秒的速度相对于彼此移动。在一个实施例中，带有细长开ロ 60的真空壳体50的形状为矩形(例如棒形)并且取决于多孔基材的大小被设计大小，使得当在本发明方法中使用带有细长开ロ 60的真空壳体50吋，带有细长开ロ 60的真空壳体50将接触多孔基材的横截面的基本上所有的面积，但是在任何时候不会接触多孔基材的整个面积。在一个实施例中，带有细长开ロ 60的真空壳体50的大小和形状被设计为使得当在本发明的方法中使用带有细长开ロ 60的真空壳体时，带有细长开ロ 60的真空壳体在任何时候将接触小于多孔基材的整个面积的1%， 诸如从约0. 01%至约0. 1%、诸如约0. 02%至约0. 05%、诸如约0. 04%
本发明的方法密切地关注真空和在多孔基材的特定面积上的相关的气流，当开ロ 与真空源相连通吋，多孔基材的特定面积接近或基本上接触在进气口中的开ロ。当进气ロ 和多孔基材相对于彼此移动直到基本上所有的多孔基材已经接触进气口和真空为止时，密切地关注多孔基材的狭窄区域或狭窄带上的真空致使横跨多孔基材的整个表面更加一致地除去液体。此外，本发明的方法在不移动胚胎的位置的情况下从其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液体。本发明的方法与经由真空系统从其上布置有胚胎的多孔基材除去液体的诸如使用布氏漏斗的其它方法形成对照，其它方法的操作使得液体同时被吸引穿过整个多孔面积的孔，这可能导致横跨多孔面积的不均勻的液体除去和/或胚胎的位移。而且，与以前的方法相比，本发明允许更快速地从多孔基材和已布置的胚胎的表面除去液体。例如，以前的方法需要1. 5分钟至7分钟来充分地除去每个多孔基材的表面液体，而使用本发明的方法能够在不到一分钟中除去每个多孔基材的表面液体。考虑到对用以处理成千上万的胚胎的生产装置的要求，当前方法产生在效率上的显著提高。此外，虽然使用本发明的方法可以从已布置的胚胎的表面除去液体，但是，重要地，本发明的方法基本上不影响已布置的胚胎的水分含量或水势。一旦已经从其上布置有胚胎的多孔基材上除去残余液体，胚胎就可以经受进ー步的处理或处置。在一个实施例中，植物胚胎是子叶前期胚胎。在一个实施例中，本发明的方法包括如下步骤(a)在増殖培养基之内或増殖培养基之上培养胚性胚柄团以形成子叶前期胚胎；(b)提供具有顶表面和底表面的多孔基材；(c)将在步骤(a)中形成的子叶前期胚胎分配到多孔基材的顶表面上；(d)提供与真空源相连通的进气ロ，其中进气ロ的横截面面积小于多孔基材的底表面面积；(e)当进气ロ与真空源相连通吋，使进气口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，子叶前期胚胎被布置在多孔基材的相应的顶表面上，从而对接近进气ロ的多孔基材的底表面部分施加真空；以及(f)在进气ロ与真空源相连通的同吋，使进气口和多孔基材的底表面相对于彼此移动，直到多孔基材的底表面的基本上所有的期望区域已经接近进气ロ为止，从而从其上布置有子叶前期胚胎的多孔基材的期望区域除去液体。在一个实施例中，本发明的方法进ー步包括将布置在已经根据步骤(f)除去液体的多孔基材上的子叶前期胚胎转移到发育培养基的步骤。 在一个实施例中，植物胚胎是子叶胚胎。在一个实施例中，本发明的方法包括如下步骤(a)在发育培养基之内或发育培养基之上培养子叶前期胚胎以形成子叶胚胎；(b)对在步骤(a)中产生的子叶胚胎进行切単；(c)提供具有顶表面和底表面的多孔基材；(d)将在步骤(b)中切单的子叶胚胎分配到多孔基材的顶表面上；(e)提供与真空源相连通的进气ロ，其中进气ロ的横截面面积小于多孔基材的底表面面积；(f)当进气ロ与真空源相连通吋，使进气口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，子叶前期胚胎布置在多孔基材的相应的顶表面上，从而对接近进气ロ的多孔基材的底表面部分施加真空；以及(g)在进气 ロ与真空源相连通的同吋，使进气口和多孔基材的底表面相对于彼此移动，直到多孔基材的底表面的基本上所有的期望区域已经接近进气ロ为止，从而从其上布置有子叶前期胚胎的多孔基材的期望区域除去液体。
在一个实施例中，本发明的方法进ー步包括如下步骤使布置在已经根据步骤 (g)除去液体的多孔基材上的子叶胚胎经受ー项或多项进ー步处理，诸如层积、放置到已加 エ的种子中、以及萌芽。发育、层积、和萌芽的在体細胞胚胎发生过程中的步骤是本领域已知的。例如在美国专利No. 7，785，884中公开了用于每个步骤的示例性培养基和条件。本发明的方法能够用于需要从胚胎和/或从其上布置有胚胎的多孔基材除去表面液体的体細胞胚胎发生过程中的任何步骤。适合于在本发明的方法中使用的植物胚胎可以来自于任何植物物种，诸如双子叶植物类或单子叶植物类、裸子植物内等。松柏科植物胚胎适合于在本发明的方法中使用并且松柏科植物胚胎可以来自于任何松柏科植物物种，包括但不限于火炬松和花旗松。虽然已经示出并描述了例证性实施例，但是应了解，在不脱离本发明精神和范围的情况下，能够做出各种改变。
权利要求
1.ー种用于从多孔基材除去液体的方法，植物胚胎布置在所述多孔基材上，所述方法包括如下步骤(a)提供具有顶表面和底表面的多孔基材；(b)将植物胚胎布置到所述多孔基材的顶表面上；(c)提供与真空源相连通的进气ロ，其中所述进气ロ的横截面面积小于所述多孔基材的底表面面积；(d)在所述进气ロ与所述真空源相连通吋，使所述进气口和所述多孔基材的底表面的一部分彼此接近，所述多孔基材具有布置在相应的顶表面上的植物胚胎，从而对接近所述进气ロ的所述多孔基材的底表面的所述部分施加真空；以及(e)在所述进气ロ与所述真空源相连通的同吋，使所述进气口和所述多孔基材的底表面彼此相对移动，直到基本上所述多孔基材的底表面的所有期望区域已经接近所述进气ロ 为止，从而从布置有植物胚胎的所述多孔基材的期望区域除去液体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述进气ロ与所述真空源相连通吋，所述进气 ロ基本上接触具有布置在相应的顶表面上的植物胚胎的所述多孔基材的底表面的所述部分。
3.根据权利要求1所述的方法，进ー步包括在所述进气ロ与所述真空源相连通时重复步骤(d)和(e)，直到基本上所述多孔基材的所有的底表面已经接近所述进气ロ为止。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述进气口和所述多孔基材的底表面彼此相对移动时，所述进气ロ持续地与所述真空源相连通。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在所述进气口和所述多孔基材的底表面彼此相对移动时，所述进气ロ间歇地与所述真空源相连通。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述进气ロ保持静止，并且所述多孔基材被移动越过所述进气ロ。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔基材保持静止，并且所述进气ロ被移动越过所述多孔基材的底表面。
8.根据权利要求1所述的方法，进ー步包括如下步骤在所述进气ロ与所述真空源相连通吋，在所述进气口和所述多孔膜的底表面彼此相对移动吋，在被布置在所述多孔基材的顶表面上的胚胎上和在该胚胎周围引起空气对流，从而促进通过蒸发从布置的胚胎的表面除去液体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述进气ロ由具有开ロ的壳体覆盖。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述壳体中的所述开ロ具有从约0.001英寸至约0.01英寸的宽度。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述进气ロ与具有从约-0.5psi至约-15psi的范围内的负压的真空源相连通。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述进气ロ与所述真空源相连通时，所述真空源的负压是恒定的。
13.根据权利要求11所述的方法，其中在所述进气ロ与所述真空源相连通时，所述真空源的负压变化。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述进气口和所述多孔基材以从约1毫米每秒至约45毫米每秒的速度彼此相对移动。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔基材是聚合膜。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述聚合膜是尼龙膜。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物胚胎是子叶前期胚胎。
18.根据权利要求17所述的方法，进ー步包括将所述子叶前期胚胎转移到发育培养
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物胚胎是子叶胚胎。
20.根据权利要求19所述的方法，进ー步包括使所述子叶胚胎经受层积、插入到加工的种子中以及萌芽处理中的ー个或多个。
全文摘要
本发明涉及在植物体细胞胚胎发生中从多孔基材除去液体的方法。本发明提供了从多孔基材除去液体的方法，植物胚胎布置在所述多孔基材上。
文档编号C12N5/04GK102559574SQ20111045369
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者帕特里克·M·布劳内尔, 拉蒙·C·德祖特, 罗伯特·A·斯塔尔 申请人:韦尔豪泽Nr公司