专利名称：缺铁性贫血相关血清铁浓度检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体涉及检测缺铁性贫血相关血清铁浓度的试剂盒，通过同时检测与缺铁性贫血密切相关的跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS6)和转铁蛋白受体2 (TfR2)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体缺铁性贫血症状程度。
背景技术：
缺铁性贫血是体内铁的储存不能满足正常红细胞生成的需要而发生的贫血。是由于铁摄入量不足、吸收量減少、需要量増加、铁利用障碍或丢失过多所致。形态学表现为小细胞低色素性贫血。缺铁性贫血不是ー种疾病，而是疾病的症状。缺铁性贫血是最多的ー种贫血，广泛地存在于世界各地，据世界卫生组织(WHO)调查报告，全世界约有10 — 30%的人群有不同程度的缺铁。男性发病率约10%，女性大于20%。亚洲发病率高于欧洲。发表在2008年4月13日的《自然ー遗传学》(Nature Genetics)杂志网络版上，来自美国的研究人员报告说，一个名为TMPRSS6的基因发生变异后，会导致出现ー种罕见疾病——“难治性缺铁性贫血症”。研究人员称，这ー发现将为治疗常见的铁失调症提供新思路。TMPRSS6是跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSSs)中的亚家族中的其中ー员。跨膜丝氨酸蛋白酶又名II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)是ー类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白家族。自1998年发现第一个跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS1 (hep sin) (Leytus等，1998)以来，至今已在人、小鼠和老鼠中发现二十多个成员，仅人类就有十几种。TMPRSS表达具有明显组织特异性，TMPRSS6主要在胎儿和成人肝脏中表达(Velasco等，2002)，而TMPRSS10主要存在于心脏(Yan等，1999)，这种表达模式说明不同TMPRSS參与不同生理过程。TMPRSS家族成员在分子量上差别巨大，如人TMPRSS1包含417个氨基酸残基，而TMPRSS10由1042个氨基酸构成，两者相差I倍以上，但基本结构却高度相似，均含四部分，从N端到C端依次为短细胞质结构域、跨膜结构域、主干区和丝氨酸蛋白酶结构域，后两者位于胞外，不同成员区别主要集中于主干区。根据主干区不同，TMPRSS可被进ー步分为四个亚家族HAT/DESC、h印sin/TMPRSS, matriptase 和 corin。HAT/DSEC 亚家族包括 TMPRSSlld (HAT)和 TMPRSSlle(DESC1),它们结构最为简单，主干区仅由单一SEA(sea urchin sperm protein, enteropeptidase, agrin)结构域构成。H印sin/TMPRSS亚家族包括TMPRSS1 5和TMPRSS13等，是包含种类最多的ー个亚家族，主干区包含清道夫受体富含半胱氨酸(scavenger receptorcys-rich, SRCR)结构域和低密度脂蛋白 A 类受体(low density lipoprotein receptorclass A, LDLa)结构域。matriptase 亚家族包括 TMPRSS14 (matriptase-1 )、TMPRSS6(matriptase-2)和TMPRSS7 (matriptase-3),其主干区除含有SEA结构域外，还包含2个CUB (complement protein subcomponents Cir/しls， urchin embryonic growth factorand bone morphogenetic protein I)结构域及3到4个串联重复LDLa结构域。corin亚家族目前只发现ー个成员TMPRSS10 (corin)，其结构最为复杂，主干区包含8个LDLa结构域，2个frizzled结构域和I个SRCR结构域。TMPRSS6表达具有肝脏特异性，其基因突变可造成人难治性缺铁性贫血(iron-refractory iron deficiency anemia, RDA)的发生(Finberg 等，2008),而 TMPRSS6基因突变小鼠也具有严重缺铁和贫血表型，对贫血病人和突变小鼠单纯给予高铁饮食都无法完全改善贫血，这说明TMPRSS6基因突变破坏了机体在缺铁情况下的铁吸收，从而导致贫血。1999年Kawabata等分别从TF-1细胞和HL-60细胞cDNA文库中克隆出长度分别为2. 9kb和2. 5kb的两个转录本，它们与TfR-I氨基酸序列有高度同源性，并分别命名为转铁蛋白受体 2_ a (transferrin receptor2- a , TfR2- a )和转铁蛋白受体 2-0 (transferrin rec印tor2-0，TfR2-0 )。TfR2基因定位于人类7号染色体(7q22)，长度约21kb。TfR2- a转录本含18个外显子，而TfR2- ^转录本缺乏对应于TfR2- a转录本的第I至第3外显子，故只有15个外显子，但其外显子1(相当于TfR2_ a转录本的外显子4)5’-端较之TfR2_ a外显子4具有一段由142个核苷酸组成的特有序列。TfR2-0转录本可能是同一基因可变剪接(alternative splicing)的产物。小鼠TfR2基因定位于第5号染色体，cDNA长度约2. 8Kb，两者的启动子序列也高度保守。由于可变剪接，小鼠TfR2基因可能存在三种不同长度的转录本。TfR2与TfRl基因结构上的最大差别在于前者无3’ -端未翻译区的IRE结构域，而TfRl在其3’ -未翻译区具有5个IRE结构。Kawabata等将TfR2-a转染入本身缺乏TfRl和TfR2的中国仓鼠卵巢(ChineseHamster Ovary, CH0)细胞，结果CHO细胞表面与生物素标记的转铁蛋白(Transferrin, Tf)的结合力显著增高，表明TfR2_a表达于CHO细胞表面并可与Tf 特异性结合，这种结合可被未标记的Tf竞争性抑制。此外，TfR2- a转染的CHO尚可将55Fe_Tf摄入细胞内，其摄铁能力类似于TfRl转染的CH0，表明TfR2- a与TfRl在Tf结合能力和摄取Tf铁等方面具有相似的功能，可能是细胞铁转运的另ー个重要分子途径。 野生型HFE蛋白(其突变导致遗传性血色病I )可与TfRl、^ 2微球蛋白结合形成杂三聚体，降低TfRl与其配体Tf的亲和性，负向调节细胞对Tf结合铁的摄取，是调节细胞铁转运的ー种重要分子。West等研究发现，TfRl与Tf结合的亲和性为TfR2与Tf结合亲和性的25倍，而且TfR2介导的细胞铁转运是两种不同的分子途径。但Deaglio等通过免疫组化研究发现，TfR2高水平表达于肠道绒毛细胞，提示TfR2可能是參与肠道铁吸收或铁转运的一种调节蛋白或机体铁状况的“感应分子”。Camaschella等首先在一个意大利家系中发现了ー种特殊类型的遗传性血色病(遗传性血色病III型)，这是由于TfR2基因6号外显子第750号核苷酸C被置换为G，从而导致第250号遗传密码子TAC (酪氨酸)变为终止密码TAG，这ー纯合无义突变(Y250X)导致TfR2失活。TfR2基因功能的缺失导致铁负荷增多的临床表型，提示TfR2的生物学功能可能在于铁稳态调控而非铁摄取。Roetto等尚发现另外两种TfR2基因的突变①TfR2基因第2号外显子84 88碱基间插入ー个碱基C导致移码突变，使第60号遗传密码编码的谷氨酸变为ー个终止密码(E60X) TfR2基因4号外显子上第515号的T与516号的A发生碱基颠换(transversion)，使172号遗传密码子编码的蛋氨酸变为赖氨酸(M172K)。Y250X使TfR2-a和TfR2-0失活，E60X使TfR2_ a失活，而M172K使TfR2_ a发生错义突变和可能阻碍TfR2-0的产生。此外，Girelli D等发现TfR2蛋白第594 597号丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酰氨缺失[AVAQ594-597del]而失活。Hoffman等则新近发现TfR2外显子10的一种少见的突变类型1391号G与1392号A发生碱基颠换，使TfR2蛋白第455号核苷酸精氨酸被谷氨酰氨置换(Arg455Gln ;R445Q)。Fleming等通过定位诱变(targetedmutagenesis)使小鼠TfR2蛋白第245号酪氨酸变为终止密码TAG (Y245X，相当于人类TfR2的Y250X)，这种纯合子小鼠肝铁含量和血清转铁蛋白饱和度明显增高，而脾脏铁含量则显著降低。小鼠TfR2突变动物模型铁负荷增多的临床表型非常类似于人类遗传性血色病III型，直接证明了 TfR2的基因异常可以导致机体铁符合增多，是參与铁稳态调节的重要分子。
发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个血清铁浓度相关基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgC12、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS6)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- CCCTACCTTCCTGGCA -3’下游引物序列5’- AGCCTGATTGTCTCAA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GCTCTTCaTCGCTG - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- GCTCTTCgTCGCTG - TAMRA -3’转铁蛋白受体2 (TfR2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- CCTGAGCAGGCTGGG -3’下游引物序列5’- CCCAAAATGCTGGGA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GCGGTACCTaATTCCTAT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - GCGGTACCTcATTCCTAT -TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积10 iil，其中Siil PCR反应液，2 检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读取，根据得到的ニ维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测血清铁浓度相关基因SNP位点，从而告知被检者患病风险数值，提前预防和控制，指导医师选择正确的临床治疗方案，有利于患者进行针对性治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个血清铁浓度相关基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整 合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体缺铁性贫血症状程度的评估也更便捷。
图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgC12、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。实施例2I.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS6)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- CCCTACCTTCCTGGCA -3’下游引物序列5’- AGCCTGATTGTCTCAA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GCTCTTCaTCGCTG - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- GCTCTTCgTCGCTG - TAMRA -3’转铁蛋白受体2 (TfR2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- CCTGAGCAGGCTGGG -3’下游引物序列5，-CCCAAAATGCTGGGA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GCGGTACCTaATTCCTAT - TAMRA -3’[0052]基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - GCGGTACCTcATTCCTAT -TAMRA -3’3.样本检测 选取30例血液样本，其中已确定患缺铁性贫血的为18例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积lOiil，其中8iU PCR反应液，姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 u I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 u I阳性对照和阴性对照，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95 V、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
权利要求1. ー种缺铁性贫血相关血清铁浓度基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2)、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测血清铁浓度相关基因位点是否发生突变从而评估个体缺铁性贫血症状程度的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个血清铁浓度相关基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体缺铁性贫血症状程度的评估也更便捷。
文档编号C12Q1/68GK202401069SQ2011205694
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司