专利名称：人体内肥胖基因位点检测的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体涉及检测人体内肥胖基因位点是否发生突变的试剂盒，通过同时检测与肥胖密切相关的过氧化酶基因(FTO)和黑皮质素家族受体基因(MC4R)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体肥胖程度从而达到对个体体重管理的目的。
背景技术：
从人类开始关注体重问题到现在经历了数次革命，而现在欧美国家正处于第三次革命，这就是风行欧美的“体重管理”，維持体重管理强调的是ー种健康的生活理念，因为人类已经清楚认识到了肥胖对生活带来的巨大影响。肥胖(obesity)已成为严重危害人类健康的社会问题。现有大约十亿的成年人是超重，体重指数(body mass index, BMI)超过25, 并且有3亿成年人是肥胖，BMI超过30。肥胖会导致严重的健康问题，降低生活期盼，对生活质量造成重要影响。肥胖和超体重会导致高血压、2型糖尿病、冠状动脉心脏病等严重疾病，从而大量増加死亡的风险。肥胖对阻塞性睡眠呼吸暂停和呼吸系统疾病、胆囊疾病、骨关节炎、非酒精性脂肪肝疾病、结肠癌等疾病的发展也很重要。因此，了解肥胖的原因并且有效控制肥胖的方法是现在肥胖和超体重人群所迫切需要的。随着“基因时代”的到来，人类已发现了数个与肥胖相关的基因，其中过氧化酶基因(FTO)和黑皮素家族受体基因(MC4R)与肥胖有显著关联。过氧化酶基因(FT0)，在下丘脑中的表达与调节食物摄取有夫，是目前发现与体重变化相关性最強的基因。FTO基因位于染色体16ql2. 2上，是非-血红素加双氧酶超家族I non-heme dioxygenase superfamily)的一个成贝。Gerken等进行实验得出，FTO mRNA在脑组织中表达最高,而在脑组织中，最高表达又是在下丘脑，下丘脑是控制能量平衡起关键作用的区域。在对下丘脑片段进行原位杂交时得出FTO mRNA高表达于弓状核、室旁核、背内侧核、腹侧正中核。这些都是控制能量平衡的关键部位。Robbens等得出FTO基因主要表达在神经元，而在星形胶质细胞和神经胶质细胞中则不表达，FTO基因表达与ー些食物相关调节基因存在关联，如胃肽等。这些表达差异说明FTO基因在神经调节饮食方面起到ー个特殊的作用。FTO基因的变异会导致肥胖，变异表现为单核苷酸多态性(SNP)，最近许多人在研究FTO基因的单核苷酸多态性的变异位点与肥胖的关联。Hinney等对487个极度肥胖的德国年轻人和442个健康瘦弱的德国年轻人进行全基因组扫描相关分析(genome wideassociation，GWA)得出证实有15种SNPs，其P值最低。15种SNPs中有6种SNPs存在同ー连锁不平衡模块中，并包括GWA SNP的最低P值。而另外的9种低P值SNPs在肥胖家族中没有得到证实，且这9种SNPs与连锁不平衡不相关。这说明了 FTO的变异对早期肥胖有很大的作用。Sculeri等利用全基因相关扫描显示了 FTO基因变异与肥胖相关性状(BMI，臀围，总体重)的关联。通过对4000名以上的撒丁人的检测，发现了在染色体16上具体的基因变异rs9930506和其它附近的基因变异与体重指数、臀围和总体重的关联。并且这种相关性不但在撒丁人中显示出来，同样也在欧美和西班牙美国人独立样本中显示出来。研究结果得出有8个单核苷酸(SNPs)重叠于肥胖的3个数量性状中。尤其是rs9930506和其附近的ー簇SNPs与体重指数、臀围、总体重有很强的关联。在这些SNPs中的2个，rs9939609和rs9926289，是位于I个内含子区域，FTO基因中的多种SNP为肥胖相关性提供了证据。FTO中的rs9939609SNP是单核苷酸多态性中置换的共同位点，近年来许多人都在研究这个位点的SNPs。Wa^len等实验得出对FTO基因的rs9939609与脂肪细胞功能和组织基因表达关联在306个健康妇女不同体重指数研究结果中现实FTO rs9939609的mRNA在肥胖人中表达增加。并且rs9939609的mRNA在脂肪细胞中比脂肪组织要高出很多。Frayling等利用全基因组相关研究对在美国患有2-型糖尿病的人群进行490 000正常染色体SNPs分析得出FT0基因中的SNPrs9939609与2-型糖尿病有很强的关联，而且这个 等位基因也与增长的BMI有很强的关联，这种SNP与2-型糖尿病的关联会被增长的BMI取消。这点说明FTO中的SNP是和BMI相关的。这个变异体已经在超过38000中的13种人群反应出来了。在带有这个变异体的成人与没带有这个变异体的成人相比，体重要重3kg多并多出I. 6倍得肥胖的风险，而且rs9939609这种相关性在7岁之后会上升并且反映了在肥胖中具体的增长。L6pez-Bermejo等对rs9939609SNP研究得出FT0 rs9939609与出生时的体重无关联，但是在出生后2周婴儿的全身、躯干、腹部等发现其与血清脂肪因子、体重相关，并且AA纯合子比T携帯者的血清脂肪因子的聚积要高出37%，且全身、躯干、腹部的脂肪堆积相应高出17%、20%、17%。这些证实了共同的rs9939609SNP在人类早期阶段脂肪合成的作用，并掲示了这个SNP和血清脂肪因子，以及腹部脂肪堆积在出生后的显著关系。因FTO基因与肥胖有关而成为近年来的研究热点，FTO基因分布于下丘脑，參与调节饮食，其变异导致肥胖的发生。随着研究的深入，将进一歩掲示FTO基因在人体内的功能和特异调控机制，以及基因变异与疾病的关系，为疾病的防治提供新的治疗靶点。黑皮质素激素受体4 (Melanorcortin 4 Receptor, MC4R)基因属于黑皮质素激素受体(Melanorcortin Receptors, MCR)家族(Gantz et al.，1993)。这个家族是一类细胞膜上的G蛋白偶联受体(G-Protein-Coulped Receptor, GPCR)蛋白(Hadley etal.，1996)。到目前为止，在人体中，总共克隆到5个该家族成员，他们分别是MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R。所有这些蛋白都能结合黑皮质素激素类配体，包括从前阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin, POMC)中获取的促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotrophin，ATCH)和 a、|3、Y 型黑皮质素激素(Melanocyte-stimulating Hormones, MSH) (Hadleyand Haskell-Luevano, 1999)。所以,被称作黑皮质素激素受体家族。肥胖病是一个常见的流行病，关于对它机理的研究进行了很多年，现在比较成熟的理论是，肥胖病的产生很大程度上是体内能量代谢失衡的结果(Schwartz etal.，2000)。能量消耗和食物摄入是研究肥胖病的两个主要环节，如果这两个环节长期在体内无法得到平衡，将不可避免的导致肥胖。当然具体的情况需要对不同的病例进行具体的分析，环境和遗传的因素也会对肥胖病症造成影响(Clement et al.，2002)。1994年瘦素(I^ptin)发现后，越来越多的生理学证据表明L印tin參与到体内能量代谢的过程，Leptin及其所在通路是影响肥胖的ー个主要生理途径(Friedman andHalaas, 1998)。黑皮质素激素系统(Melanocortin system, MC)在Leptin通路之中，通过若干激动或拮抗性质的激素与相应的黑皮质素激素受体结合，激活细胞内下游信号传导通路，在中枢神经系统中调节摄食和能量代谢，从而在控制肥胖病症的发生过程中发挥重要作用(Cone，1999);同时，动物和人的遗传学的证据也证明MC4R和肥胖病相关。它已成为重要的治疗肥胖病的基因靶体(MacNeil et al.，2002)。值得注意的是MC4R与MC1R，MC2R和MC5R不同，只在中枢神经系统内參与对体内能量代谢的调节，它和MC3R共同属I^ptin-MC通路(Vergoni and Bertolini, 2000)。促黑激素皮质素受体-4 (MC4R)单核苷多态性位点rsl7782313位于MC4R基因下游188kb处，在对欧洲白人的研究中发现MC4R的rsl7782313危险等位基因C与体重指数(BMI)相关，并且携帯危险等位基因C会増加肥胖的发生风险。而后，为了分析在中国汉族人群中，MC4R单核苷酸多态性rsl7782313对BMI有无影响，及rsl7782313是否能够提高肥胖的发生风险，是否能够提高2型糖尿病的患病风险，国内的研究机构采用病例-对照研究设计，对2280人进行了糖尿病筛查，其中，2型糖尿病组1107人[年龄53± IOUean土SD):BMI 25. 23±3. 17]，健康组 1173 人[年龄 59±10 BMI 25. 27±3. 09]。在分析 rsl7782313对肥胖发生风险的影响时，BMI彡28kg/m2者納入肥胖组，BMI < 25kg/m2者作为对照组。采用sequenom MassARRAY SNP分型技术对rsl7782313位点进行基因分型。线性回归模 型应用于rsl7782313多态性对BMI影响的分析，用logistic回归分析rsl7782313对肥胖及糖尿病发生风险的影响。研究结果表明，本研究人群危险等位基因C的频率为24%，携帯危险等位基因C可以使BMI增加，^ =0. 24(P=0. 043)，rsl7782313对BMI的影响无性别差异。在显性遗传模式下，携带危险等位基因C可使肥胖发生风险增加25% [95% Cl (I. 006-1. 547)] (P=O. 043)]。rsl7782313与2型糖尿病的发生率无统计学相关性(P=O. 797)。最终得出结论是中国汉族人群MC4R基因单核苷酸多态性rsl7782313与BMI相关，携帯危险等位基因使BMI増加。在显性遗传模式下，rsl7782313会増加肥胖发生的风险。
发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个人体内肥胖基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，过氧化酶基因(FTO)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GGTTCCTTGCGACTG -3’下游引物序列5’- AACAGAGACTATCCA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GAATTTaGTGATG - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- GAATTTtGTGATG - TAMRA -3’黑皮质素家族受体基因(MC4R)上的SNP位点检测引物和探针为[0023]上游引物序列5’- GTTTAAAGCAGGAGAG -3’下游引物序列5’- TGAAGCTTTTCTTGTC -3’基因型ー荧 光探针序列5’-FAM - TGTATCCcGATGGA - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - TGTATCCtGATGGA -TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积lOiil，其中Siil PCR反应液，2iil检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95 V、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读取，根据得到的ニ维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测人体内肥胖基因SNP位点，从而告知被检者患肥胖症风险数值，提前预防和控制，指导医师选择正确的临床治疗方案，有利于被检者进行体重管理。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个人体内肥胖基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体进行体重管理也更便捷。
图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。实施例2[0041]I.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。[0043]2.引物及探针过氧化酶基因(FTO)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GGTTCCTTGCGACTG -3’下游引物序列5’- AACAGAGACTATCCA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GAATTTaGTGATG - TAMRA _3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- GAATTTtGTGATG - TAMRA -3’黑皮质素家族受体基因(MC4R)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5，-GTTTAAAGCAGGAGAG -3’下游引物序列5’- TGAAGCTTTTCTTGTC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - TGTATCCcGATGGA - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - TGTATCCtGATGGA -TAMRA -3’3.样本检测选取30例血液样本，其中已确定患肥胖症的为18例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积lOiil，其中8iU PCR反应液，姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 u I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 u I阳性对照和阴性对照，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
权利要求1. ー种人体内肥胖基因位点检测的试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2)、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测人体内肥胖基因位点是否发生突变从而达到对个体进行体重管理目的的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个人体内肥胖基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体进行体重管理也更便捷。
文档编号C12Q1/68GK202401074SQ20112056949
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司