细胞培养容器及细胞培养装置的制作方法

专利名称：细胞培养容器及细胞培养装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养容器和使用该细胞培养容器的细胞培养装置。
背景技术：
在使用自身的细胞或他人的细胞来进行疾病的治疗的再生医疗中，通常将从生命体采集的细胞进行培养使细胞的数量增加、或者以适当的形状使其形成组织后用于治疗。 关于用于治疗的细胞的培养，需要在称为细胞加工设施(Cell Processing Center :CPC)的细胞培养用洁净室中依据GMP (Good Manufacturing Practice :生产质量管理规范)来进行。这里的技术问题在于由于细胞培养是通过技术人员的手进行的，因此制备一名患者用的细胞都要花费很多的劳力和成本；以及存在由手动操作引起的生物学污染的风险。
作为解决这些技术问题的手段，开发出了在封闭体系中将细胞培养工序自动化的装置。该装置通过使用无需打开和关闭培养容器的盖子的操作的封闭体系培养容器，实现了细胞培养工序的自动化和生物学污染风险的降低。
另外，对于细胞来说，有在增殖过程中需要称为饲养细胞的营养细胞的细胞种和不需要营养细胞的细胞种。再生医疗中受到瞩目的ES (Embryonic Stem :胚胎干)细胞、 iPS (Induced Pluripotent Stem :诱导多功能干)细胞及皮肤上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞等细胞种通常需要饲养细胞。在将培养后的细胞用于治疗的情况下，饲养细胞和用于治疗的细胞优选以分离的状态进行培养。即，优选在具有双层培养层的细胞培养容器中进行细胞培养。然而，迄今为止所开发的封闭体系的细胞培养装置是对应于培养层为单层的细胞培养容器的装置构成，因此难以进行双层培养。
作为解决该技术问题的手段，提出了专利文献1、2中所示的培养装置。如果是这样的装置构成，则通过使用例如专利文献3、4中所示的具有双层培养层的细胞培养容器， 即可将ES细胞、iPS细胞、皮肤上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞等细胞种在封闭体系内进行自动培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献I :日本特开2006-149237号公报
专利文献2 :日本特开2008-271915号公报
专利文献3 :日本特开2008-271912号公报
专利文献4 :日本特开2008-271911号公报发明内容
发明要解决的技术问题
但是，当使用专利文献3、4中所示的具有双层培养层的细胞培养容器进行自动培养时，存在以下所述的技术问题。
在使用专利文献3中记载的封闭体系培养容器来自动地进行送废液的情况下，例如在专利文献1、2中记载了下述方法将装置接头处具备的培养液供给机构与细胞培养容器具备的弹性构件连接来进行培养液的送废液(参照专利文献I的权利要求I、专利文献2 的权利要求I)。
在这些方法中存在以下技术问题从因送废液管通过弹性构件的狭缝而产生的通气口发生漏液，经由通气口混入来自细胞培养空间外的含有微生物的粒子。
另外，用专利文献3中记载的封闭体系培养容器进行培养后，需要进行下述操作 从培养装置取出细胞培养容器，在即将使用细胞前将细胞培养容器内的培养液排出至安全柜内来回收细胞。要从细胞培养容器排出培养液，需要向设置在细胞培养容器的弹性构件中通过手工作业来插入某种配管。由于通过这样的手工作业进行操作，因此存在生物学污染的危险性提高的技术问题。
本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供解决这些技术问题的细胞培养容器和利用了该细胞培养容器的细胞培养装置。
用于解决技术问题的手段
实现上述目的的本发明的细胞培养容器提供下述构成的细胞培养容器其是安装于细胞培养装置且保持和培养细胞的细胞培养容器，其具备保持培养液的培养液保持部； 用于供给、排出培养液的突起结构部；以及从突起结构部连通至培养液保持部的培养液流路。
另外，还提供下述构成的细胞培养装置其是在细胞培养容器内培养细胞的细胞培养装置，其具备保持细胞培养容器的培养台；用于保管培养液的培养液保管部；用于蓄积废液的废液收纳部；用于将培养液从培养液保管部供至细胞培养容器的送液管；以及从细胞培养容器回收废液并将废液送至废液收纳部的废液管，细胞培养容器具备保持培养液的培养液保持部；用于供给、排出培养液的突起结构部；以及从突起结构部连通至培养液保持部的培养液流路，且突起结构部与送液管和废液管的一端相连接。
发明效果
根据本发明的细胞培养容器，能够在全封闭体系内自动培养细胞。通过在全封闭体系内进行培养，能够抑制来自细胞培养空间外的含有微生物的粒子的侵入，从而能够安全、安心地实施细胞培养。
另外，在细胞培养结束后从细胞培养容器排出培养液时，也能够抑制来自细胞培养空间外的含有微生物的粒子的侵入，从而能够安全地回收培养后的细胞。


图I是表不第I实施例的细胞培养容器的图。
图2是表示第I实施例的细胞培养容器与管连接后的状态的图。
图3是表示第I实施例的细胞培养容器的各种突起结构的图。
图4是表示第I实施例的具有细胞培养容器的细胞培养装置的图。
图5是表示第I实施例的细胞培养结束后解除细胞培养装置与细胞培养容器的连接的方法的图。
图6是表不第I实施例的从细胞培养容器排出培养液的方法的图。
图7是表示第I实施例的从细胞培养容器回收再生组织的顺序的图。
图8是表示第I实施例的熔敷于细胞培养容器的透气膜的形状的图。
图9是表示第I实施例的变形例的单层型细胞培养容器的一个例子的图。
图10是表示第I实施例的变形例的单层型细胞培养容器的另一个例子的图。
图11是表示第I实施例的变形例的细胞培养容器中突起结构的位置的另一个例子的图。
图12是表示第I实施例的具体例I中制得的细胞培养容器框体的外观的图。
图13是表示第I实施例的具体例I中将透气膜等熔敷在制得的细胞培养容器框体上进行密封从而保持有培养液的状态的外观的图。图14是表示第I实施例的具体例I和比较例I中的相位差显微镜图像和剥离回收得到的细胞薄片的外观的图。
图15是表示第I实施例的具体例I和比较例I中的角膜上皮组织所含的细胞数的图。
图16是表示第I实施例的具体例I和比较例I中的角膜上皮组织切片的苏木精-伊红(HE)染色图像的图。
图17是表示第I实施例的具体例I和比较例I中的角膜上皮组织切片的免疫组织染色图像的图。
图18是表示第I实施例的具体例2和比较例2中的剥离回收得到的细胞薄片的外观的图。
图19是表示第I实施例的具体例2和比较例2中的角膜上皮组织切片的苏木精-伊红(HE)染色图像和免疫组织染色图像的图。
图20是表示第I实施例的具体例2和比较例2中的角膜上皮组织切片的免疫组织染色图像和P63阳性细胞率的图。
图21是表示第I实施例的具体例2和比较例2中的菌落检出图像和菌落形成率的图。
图22是表示第2实施例的细胞培养容器的剖面的图。
图23是表示第2实施例的细胞培养容器的(a)立体及(b)剖面的图。
图24是表示第2实施例的细胞培养容器的(a)上部及(b)倾斜照片的图。
图25是表示第3实施例的细胞培养容器的剖面的图。
具体实施方式
以下参照附图对本发明的各种实施例进行说明。但是，这些实施例只不过是用于实现本发明的一个例子，并不限定本发明的技术范围。另外，对于各图中共同的构成赋予相同的参照编号。另外，在本说明书中，有时将培养液称为培养基。
实施例I
<细胞培养容器的结构>
图I是表示第I实施例中的细胞培养容器的结构的一个例子的图。
图I (a)是俯视图，(b)是其A-A剖视图，(C)是其B-B剖视图。细胞培养容器I 是正方形且扁平形状的容器，其由聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯等兼具可塑性和刚性的塑料形成。框体2通过注塑成形等形成，在其内部形成有圆部3、4及5。而且，在圆部3上熔敷有透气膜6，在圆部4上熔敷有物质透过膜7，在圆部5上熔敷有透气膜8。关于透气膜6、8 和物质透过膜7在各圆部3、5、4上的熔敷，优选不使用会对细胞存活带来影响的粘接剂的热熔敷或超声波熔敷。通过上述各层和框体2，在本实施例中构成具有大致圆形形状的双层的培养液保持部28。
在图I中，9是向培养液保持部28供给、排出培养液的一对突起结构部。突起结构物9从细胞培养容器I的框体2的上表面向垂直于透气膜6、8的膜面的方向突出。14是从突起结构部9到圆形的培养空间即培养液保持部28的一对培养液流路。一对培养液通路14与培养液保持部28的各层中大致圆形形状的对置的侧面位置连接。如后所述那样， 这是为了当使细胞培养容器I垂直时，使一对培养液通路14与培养空间的最顶部及最底部连接。另外，还可以通过将圆部3、4及5设为楕圆部，使培养液保持部28为大致楕圆形状。
在为了在细胞培养容器I的上层培养需要来自细胞培养容器I的下层的营养成分的细胞种而使用细胞培养容器I时，物质透过膜7的平均孔径宜为蛋白质等能通过但细胞不能通过的大小。
透气膜6、8和物质透过膜7的原材料只要是聚碳酸酯或聚苯乙烯等具有透气性、 且能够观察细胞培养的透明的材料即可，但并不限于此。在通过热熔敷、超声波熔敷将对象物彼此进行熔敷的情况下，由于熔点的关系，框体2和透气膜6、8、物质透过膜7的材质优选相同或者熔点接近的材质。
如图2所示，设于细胞培养容器I的一对突起结构部9与细胞培养容器I 一体成形而成，并能够与由弹性构件形成的管10连接。管10的内径只要与突起结构部9的内径相等，则即使在如图2那样将突起结构部9与管10连接的状态下进行通液，也不会发生漏液。 突起结构部9的顶端形成梯形，但并不限于此形状，只要是图3的突起结构11、12那样能够与管10连接的形状即可。突起结构部9的高度没有特别限制，但从可用性的观点出发，只要是连接管10所需的高度即可。
对于具有这样的结构的本实施例的细胞培养容器1，通过用培养液填充由设于框体2的物质透过膜7及透气膜6、8形成的培养液保持部28，即可实现密闭空间内的细胞培养。当向培养液保持部28填充培养液时，为了不产生气泡，以成对的一侧的突起结构部9 位于下方的方式将培养容器I立起，从下侧的突起结构部9注入培养液，从上侧的突起结构部9排出培养液。因此，在双层结构的细胞培养容器I的情况下，为了有效地向上下层注液，需要如图I那样将细胞培养容器的突起结构部9、即上层的两个突起结构彼此及下层的两个突起结构彼此保持水平。另外，从突起结构部9到圆形的培养空间即培养液保持部28 的培养液流路14与细胞培养容器I垂直时的培养空间的最顶部及最底部连接。由此，能够有效地进行培养液注入和排出。另外，如上所述，本实施例的细胞培养容器I的中央的培养液保持部28形成大致圆柱或楕圆柱等圆形形状或楕圆形状的空间。这是为了将例如角膜等圆形或楕圆形的培养对象以圆形、楕圆形的原状进行回收。
另外，图I的细胞培养容器I不需要为双层型,可构成各种变形实施例。例如,根据所培养的细胞种，可以为如图9所示那样在框体29熔敷有透气膜30、31而成的单层型的细胞培养容器。进而，单层型的细胞培养容器还可以为下述结构如图10的具有底部的框体32那样进行成形，仅熔敷一张透气膜33。
进而，对于图I、图9、图10所示的各种变形实施例的细胞培养容器I的突起结构部9，当水平放置细胞培养容器1、29、32时，不需要设置在位于对应的各培养液保持部28之上的框体2的上表面，可以如图11那样位于细胞培养容器1、29、32的框体2的侧面。
接着，对使用了以上所说明的各种细胞培养容器的细胞培养装置的构成的一个例子进行说明。
<细胞培养装置的构成>
图4是示意地表示细胞培养装置15的整体构成的图，其是适用本实施例的细胞培养容器的细胞培养装置，其内部配置有具备能连接作为送液管或废液管的管的突起结构的细胞培养容器I。
在图4中，细胞培养装置15具有保持细胞培养容器I的培养台16和用于使培养台16旋转运动的驱动部17。另外，与细胞培养容器相连的送液管18及废液管19经由控制部20与培养液保管部21及废液收纳部22连接。培养液保管部21和废液收纳部22被收纳于例如设定为4°C的冷藏箱23中。而且，培养液适当地通过控制部20内的省略了图示的加热器等被加热到37°C后供至细胞培养容器I。
在培养台16的上面或下面设有具备ZYX可动轴24的细胞观察用设备25，可根据需要对正在培养的细胞的状态进行监控及记录。
另外，关于细胞培养容器I中的培养液的填充，以细胞培养容器内部不产生气泡的方式如下来进行。即，以与细胞培养容器I相连的送液管18位于下方的方式，通过驱动部17使培养台16沿箭头A方向垂直地立起，向细胞培养容器I填充细胞与培养液的混合液。填充细胞和培养液后，通过驱动部17使培养台16处于水平，在规定的温度、湿度、气体组成及浓度下实施规定时间的培养。当在培养过程中更换培养基时，以与细胞培养容器I 相连的废液管19位于下方的方式，通过驱动部17使培养台16沿箭头B方向垂直地立起， 从细胞培养容器I抽吸培养基。抽吸后，以与细胞培养容器I相连的送液管18位于下方的方式，使培养台16垂直地立起，向细胞培养容器I填充培养基。填充培养基后，再次通过驱动部17使培养台16处于水平，在规定的温度、湿度、气体组成及浓度下再次开始规定时间的培养。
<解除细胞培养结束后的细胞培养装置与细胞培养容器的连接>
图5是表示在本实施例中细胞培养结束后解除细胞培养装置15与细胞培养容器I 的连接的方法的图。通过在与细胞培养容器I的突起结构部9连接的管10的中途用夹具等封闭管的构件26将作为送液管或废液管的管10的中途遮断，将遮断后的顶端27用灭菌后的剪刀等切断，即可从细胞培养装置15取出细胞培养容器I。
容器的取出方法不限于上述记载的方法，也可以是下述方法预先在管的中途设置可实现封闭体系系统的构件，然后解除细胞培养容器与细胞培养装置的连接。
〈从细胞培养容器排出培养液〉
图6是表示从解除了与细胞培养装置15的连接的细胞培养容器I排出培养液的方法的图。通过以使想要排出培养液的一侧的突起结构位于下方的方式将细胞培养容器倾斜，即可简单地排出培养液。关于培养液的排出，为了防止再生组织的干燥，可以在即将需要制得的再生组织之前排出培养液。
〈从细胞培养容器回收再生组织〉
图7是表示从细胞培养容器回收再生组织的顺序的图。在图7中，71表示角膜上皮细胞，72表示NIH-3T3细胞。首先，从排出培养液后的细胞培养容器取下连接着的管，用割刀等除去熔敷于细胞培养容器I的上层的透气膜6。然后，用生理盐水等洗涤作为再生组织的角膜上皮细胞71后，即可回收再生组织。若如图8所示的变形例那样熔敷具有形状的一部分向细胞培养容器的圆部3突出的突出部的透气膜28，则无需切割透气膜，用镊子夹起即可除去透气膜28。另外，关于该突出形状，只要是可以用镊子夹起的形状即可，并不限于图8的形状。
关于作为再生组织的角膜上皮细胞71的回收方法，可以为以下方法使用了分散酶的方法；预先使细胞培养表面具备纤维蛋白凝胶、羊膜或温度响应性高分子等，从而能够以保持组织形状的状态从细胞培养容器I回收，但不限于这些方法。
以下，对使用了本实施例的细胞培养容器来培养角膜上皮细胞的角膜上皮组织制作方法及其结果的具体例进行说明。
(具体例I)
〈封闭体系细胞培养容器的制作方法〉
首先，通过注塑成形制作图I所示的框体2 (材料采用聚碳酸酯)。图12表示实际制得的框体2的外观。通过超声波熔敷法，在图I的圆部3、5上熔敷透气膜，在图I的圆部4上熔敷物质透过膜(超声波熔敷机使用Branson公司制2000Xdt40 :0. 8)。熔敷于图I的圆部4、5的膜通过等离子体装置实施了亲水化处理(等离子体装置使用Samco公司制 PC-300)。图13表示各膜熔敷后在容器I内保持有培养液的状态的外观。
<角膜上皮细胞培养方法>
接着，对使用了制得的细胞培养容器的角膜上皮细胞的培养方法进行说明。在培养角膜上皮细胞的前一天，作为饲养细胞，将用丝裂霉素(Mitomycin)C (10 μ g/ml)在37°C 下处理2小时后的NIH-3T3细胞以达到2X IOVcm2的方式接种到细胞培养容器下层。在接种了 NIH-3T3细胞的次日，按照常规方法从由Funakoshi公司购入的兔眼球的角膜缘部采集角膜上皮细胞，在细胞培养容器的上层以达到4X IOVcm2的方式进行接种。关于培养液， 使用通常用于培养上皮系细胞的含5%FBS的KCM培养基。关于培养液的更换，细胞培养容器的上层下层均在开始培养的第5、7、9 16天进行一次。第9天以后的培养液更换为每隔24小时。
<角膜上皮组织的剥离方法>
在培养第16天，将组织剥离回收。关于组织的剥离，将分散酶(200U/ml)充满封闭体系细胞培养容器的下层，并在37°C下处理I小时后实施。
<角膜上皮组织的细胞数测定方法>
在培养第16天，使用O. 25%胰蛋白酶溶液从细胞培养容器回收细胞，台盼蓝染色后，用细胞计数装置(TC10、BiO-Rad公司制)测量细胞数，算出细胞培养容器的单位培养面积的细胞数。
<角膜上皮组织的组织切片制作、组织切片染色、免疫组织染色、菌落形成方法>
在培养第16天，在角膜上皮细胞与物质透过膜粘接的状态下按照常规方法实施冷冻包埋。通过切片机由冷冻包埋后的组织制作厚度为ΙΟμπι的切片。使用制得的切片， 按照常规方法进行苏木精-伊红染色、核染色、免疫组织染色。免疫组织染色使用抗Pan-CK 抗体(克隆号为Kspanl-8)、抗CK3抗体(克隆号为AE5)、抗密蛋白I抗体(克隆号为A10)、抗P63抗体(克隆号为4A4)。
在实施例I和比较例I中，由5张切片求出p63阳性细胞数/总细胞数，算出p63 阳性细胞率。为了求出菌落形成率，使用O. 05%胰蛋白酶溶液将制得的细胞薄片制成细胞悬浮液，将其中2000个细胞接种到预先以达到2X IOVcm2的方式接种了 NIH-3T3细胞的 IOcm培养皿中，用KCM培养基培养约10天。
(比较例I)
使细胞培养容器为市售的6孔板用细胞培养池(Cell Culture Insert、开放体系培养容器)、使角膜上皮细胞的接种数为2 X IOVcm2、培养天数为14天，除此以外均与具体例I同样地进行实验。
(具体例I、比较例I的结果)
图14是表示其左侧所示的具体例I、右侧所示的比较例I各自的(a)相位差显微镜图像、(b)细胞薄片外观的图。在具体例I中，可以无损伤地剥离回收细胞薄片。
图15是表示细胞薄片中所含的细胞数的图。具体例I与比较例I的细胞数大致相等，显著性差异检验的结果是两者没有显著性差异。
图16是表示其左侧的具体例I、右侧的比较例I中的角膜上皮组织切片的苏木精-伊红(HE)染色图像的图。在具体例I中，与比较例I同样地可确认到细胞层三层以上复层化而成的角膜上皮组织。
图17同样是表示其左侧所示的具体例I、右侧所示的比较例I各自的免疫组织染色图像的图。在具体例I中，如图17 (a)所示在上皮细胞中表达的CK蛋白质家族(PanCK) 在全部的细胞中表达，如图17 (b)所示在分化后的角膜上皮细胞中表达的CK3在基底层以外的细胞中表达，如图17 (c)所示在角膜上皮干细胞、角膜上皮前体细胞中表达的p63在基底层的细胞中表达，如图17 (d)所示作为上皮组织的屏障功能所需的紧密连接蛋白的密蛋白I在最表层中表达，确认了具体例I中制得的细胞薄片具有作为角膜上皮组织的功能。 另外，图17中的各照片内部所示的标尺(Bars)表示50 μ m。
用本实施例的细胞培养容器制得的角膜上皮组织要求具有与用6孔板用细胞培养池(开放体系培养容器)制得的角膜上皮组织同等的品质。由图14 17的结果可知，通过具体例I制作出了与比较例I具有同等品质、且充分复层化而成的角膜上皮组织，这表示本实施例的细胞培养容器适于角膜上皮组织的制作。
(具体例2)
<对封闭体系培养容器的温度响应性高分子处理和角膜上皮细胞培养>
通过使作为温度响应性高分子单体的N-异丙基丙烯酰胺与封闭体系培养容器的细胞培养表面发生电子束聚合，从而制作温度响应性培养表面。确认在该培养表面上可正常地进行角膜上皮细胞的粘接、脱粘后，与具体例I同样地制作角膜上皮组织。
<角膜上皮细胞薄片的剥离>
在培养第16天，换成室温的新鲜培养液，在室温(约25°C)下静置30分钟。然后， 使用切成环状的亲水性PVDF膜(Mi 11 ipore公司制)作为支撑膜，从培养表面剥离回收细胞薄片。
<角膜上皮组织的组织切片制作、组织切片染色、免疫组织染色、菌落形成方法>
与具体例I同样地实施。
(比较例2)
使细胞培养容器为温度响应性高分子处理后的6孔板用细胞培养池(Cell Seed 公司制)，除此以外均与比较例I同样地进行实验。
(具体例2、比较例2的结果)
图18是表示其左侧的具体例2、右侧的比较例2中各自剥离回收得到的细胞薄片的外观的图。在具体例2中，可以无损伤地剥离。
图19是表示左侧的具体例2、右侧的比较例2中各自的角膜上皮组织切片的苏木精-伊红染色图像(图19 (a))及免疫组织染色图像的图。在具体例2中，如图19 (b)所示在上皮细胞中表达的CK蛋白质家族在全部的细胞中表达，如图19 (C)所示在分化后的角膜上皮细胞中表达的CK3在基底层以外的细胞中表达，如图19 (d)所示作为上皮组织的屏障功能所需的紧密连接蛋白的密蛋白I在最表层中表达。
图20是表示具体例2、比较例2中角膜上皮组织切片上的角膜上皮干细胞、角膜上皮前体细胞的存在和阳性细胞率的图。在具体例2中，如图20 (a)所示在角膜上皮干细胞、角膜上皮前体细胞中表达的P63在基底层的细胞中表达，阳性细胞率如图20 (b)所示在具体例2与比较例2之间没有显著性差异，两者均为30%以上。
图21是表示具体例2、比较例2中细胞薄片中所含的来自角膜上皮干细胞、角膜上皮前体细胞的菌落检出图像(图21 (a))及菌落形成率(图21 (b))的图。具体例2与比较例2之间没有显著性差异，两者均为3%以上。
实施例2
通过图22 图24对第2实施例的细胞培养容器的构成进行说明。
<细胞培养容器的结构>
图22是表示第2实施例中的细胞培养容器的结构(剖面图)的一个例子的图。细胞培养容器40是正方形的容器，由聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯等兼具可塑性和刚性的塑料形成。构成容器的框体34和盖部35通过注塑成形等形成，为可以将嵌入容器36插入内部的结构。嵌入容器可以是市售的嵌入容器，如BD公司制、Corning公司制、Greiner公司制等，只要是能够使用的产品即没有限定。在盖部35或框体34上设置O环等弹性构件41， 从而不会混入来自外部的气体或含有菌的粒子。关于盖部35与框体34的连接，可通过设于盖部34及框体35上的螺纹牙来固定，但不限于此。
在框体34上设有具有用于注入和排出空气及水蒸汽的突起结构38的流路37。在流路37的顶端安装管43。关于该流路37在框体上的位置，应根据导入容器内的培养液的量来改变，但只要位于培养液面的上部即可。另外，在框体34上还设有具有用于经由管43 注入和排出培养液的突起结构的流路42。该流路42优选以框体34的底面与流路42内径的最下部为相同高度的方式进行设置。这样可以有效地排出培养液。当更换全部培养液时， 只要将框体34适当地倾斜即可。
在盖部35上设有具有用于向嵌入容器内注入和排出培养液的突起结构的流路 39。该流路39优选以不会妨碍细胞观察的方式进行配置。流路39的长度宜为不会触及嵌入容器的底面的长度。
图23是表示图22所示的示意图的立体图。图23 (a)表示透视立体结构，图23 (b)表示剖面立体结构。图24表示试制本实施例的细胞培养容器所得到的试制品的外观。图24 (a)表示从上部方向拍摄的照片，图24 (b)表示从倾斜方向拍摄的照片。关于再生组织的回收，通过将盖部35从框体34取下即可容易地实现。
实施例3
图25表示第3实施例的细胞培养容器的构成。在图25中，与图22具有相同编号的部位表不同一物。
<细胞培养容器的结构>
如图25所示，在单层培养时，基本结构与实施例2相同，但通过制成使用新的没有流路的盖部44的细胞培养容器45，可以使用蓄积在框体42的内部空间46内的培养液进行细胞培养。
另外，对于第2、第3实施例的细胞培养容器，也可以通过将其设置在之前用图4说明过的细胞培养装置上，从而安全、安心地制作再生组织。
根据以上详细说明的各种实施例的细胞培养容器、细胞培养装置，通过将具有与突起匹配的内径且由弹性构件形成的管与突起直接连接，即可在完全不发生漏液的情况下向细胞培养容器内进行培养液的送废液，从而能够在全封闭体系内进行细胞的自动培养。 通过在全封闭体系内进行培养，可以抑制来自细胞培养空间外的含有微生物的粒子的侵入，从而能够安全、安心地实施细胞培养。
另外，在细胞培养结束后从细胞培养容器排出培养液时，无需在细胞培养容器内插入培养液回收用器具即可排出培养液，因此能够抑制来自细胞培养空间外的含有微生物的粒子的侵入，从而能够安全地回收培养后的细胞。0124]工业上利用的可能性0125]本发明作为细胞培养容0126]符号说明0127]I细胞培养容器0128]2框体0129]3、4及5圆部0130]6透气膜0131]7物质透过膜0132]8透气膜0133]9突起结构部0134]10管0135]11及12突起结构部0136]14培养液流路0137]15细胞培养装置0138]16培养台0139]17旋转运动的驱动部0140]18送液管0141]19废液管0142]20控制部0143]21培养液保管部0144]22废液收纳部0145]23冷藏箱0146]24XYZ可动轴0147]25细胞观察用设备0148]26封闭管的构件0149]28培养液保持部0150]34框体0151]35盖部0152]36嵌入容器0153]37、39、42 流路0154]38突起0155]40、45细胞培养容器0156]41弹性构件0157]43管0158]44盖部
权利要求
1.ー种细胞培养容器，其是安装于细胞培养装置并保持和培养细胞的细胞培养容器，其特征在于，具备 保持培养液的培养液保持部； 用于供给、排出所述培养液的突起结构部；以及 从所述突起结构部连通至所述培养液保持部的培养液流路。
2.如权利要求I所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述突起结构部和所述培养液流路各具备一対。
3.如权利要求I所述的细胞培养容器，其特征在于， 在所述培养液保持部的至少单面上具有透气膜以保持、培养细胞。
4.如权利要求I所述的细胞培养容器，其特征在干， 所述突起结构部能够连接由弹性构件形成的管。
5.如权利要求I所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述培养液保持部具有夹持物质透过膜的双层结构，且所述突起结构部和所述培养液流路形成在所述双层结构的各层中。
6.如权利要求I所述的细胞培养容器，其特征在于， 在所述培养液保持部的两面上具有透气膜以保持、培养细胞。
7.如权利要求3所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述培养液保持部的另ー单面与所述细胞培养容器的框体一体形成。
8.如权利要求3所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述透气膜熔敷在所述培养液保持部的至少单面上，且在其外周的一部分上具备突出的突出部。
9.如权利要求3所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述突起结构部从所述细胞培养容器的框体的上表面向与所述透气膜的膜面垂直的方向关出。
10.如权利要求3所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述突起结构物从所述细胞培养容器的框体的侧面向与所述透气膜的膜面平行的方向突出。
11.如权利要求2所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述培养液保持部具有大致圆形形状，且ー对的所述培养液流路与圆形形状的对置的位置连接。
12.如权利要求I所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述培养液保持部具备保持所述培养液的框体和覆盖所述框体的上部的盖部，且所述培养液流路设在所述框体上。
13.如权利要求2所述的细胞培养容器，其特征在于， 所述培养液保持部具备保持所述培养液的框体和覆盖所述框体的上部的盖部，且ー对的所述培养液流路中的ー个设在所述框体上，另ー个设在所述盖部上。
14.ー种细胞培养装置，其是在细胞培养容器内培养细胞的细胞培养装置，其特征在于，具备 保持所述细胞培养容器的培养台；用于保管培养液的培养液保管部； 用于蓄积废液的废液收纳部； 用于将所述培养液从所述培养液保管部供至所述细胞培养容器的送液管；以及 从所述细胞培养容器回收废液并将该废液送至所述废液收纳部的废液管， 所述细胞培养容器具备保持所述培养液的培养液保持部；用于供给、排出所述培养液的突起结构部；以及从所述突起结构部连通至所述培养液保持部的培养液流路，且所述突起结构部与所述送液管和所述废液管各自的一端相连接。
15.如权利要求14所述的细胞培养装置，其特征在于， 所述突起结构部和所述培养液流路具备一対。
16.如权利要求14所述的细胞培养装置，其特征在于， 所述细胞培养容器在所述培养液保持部的至少单面上具有透气膜以保持、培养所述细胞。
17.如权利要求14所述的细胞培养装置，其特征在于， 所述送液管和所述废液管是利用由弹性构件形成的管构成的。
18.如权利要求14所述的细胞培养装置，其特征在于， 进ー步具有进行旋转运动的驱动部，所述驱动部用于旋转所述培养台以使搭载的所述细胞培养容器呈保持为水平的状态和保持为垂直的状态。
19.如权利要求18所述的细胞培养装置，其特征在于， 所述细胞培养容器的所述培养通路在通过所述驱动部而保持为垂直的状态下与所述培养液保持部的最顶部及最低部连接。
20.如权利要求15所述的细胞培养装置，其特征在于， 所述培养液保持部具备保持所述培养液的框体和覆盖所述框体的上部的盖部，且ー对的所述培养液流路中的ー个设在所述框体上，另ー个设在所述盖部上。
全文摘要
本发明提供一种细胞培养容器，其能够防止来自细胞培养空间外的含有微生物的粒子的侵入和防止来自细胞培养空间的漏液，从而能够安全、安心地制作再生组织。本发明的细胞培养容器是安装于细胞培养装置并保持和培养细胞的细胞培养容器，其特征在于，具备保持培养液的培养液保持部；用于供给、排出上述培养液的突起结构部；以及从上述突起结构部连通至上述培养液保持部的培养液流路。
文档编号C12M1/00GK102985526SQ20118003404
公开日2013年3月20日 申请日期2011年7月7日 优先权日2010年7月16日
发明者中岛亮太, 守谷腾, 小林丰茂, 松冈志津, 野崎贵之, 森圭祐 申请人:株式会社日立制作所