专利名称：向细胞中导入核酸的方法以及核酸复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及向靶细胞中导入双链核酸分子的方法、用于该方法的核酸载体的改良、以及利用前述核酸载体与双链核酸分子得到的核酸复合物。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)是以碱基长为2广25左右的低分子量双链RNA(siRNA)为诱因，碱基序列特异性地分解mRNA，从而抑制特定基因的表达的现象，与已经进入临床试验阶段的反义核酸相比，RNA干扰的有效性和碱基序列特异性更优异，因此强烈期待其在医药中的应用。然而，还残留有siRNA向细胞内的导入、在细胞内的稳定性和抑制效果的持续性的确保等大量需要解决的问题。由于包含siRNA的聚(寡)核苷酸为多聚阴离子，因此直接使用时，与疏水性的细胞膜的亲和性低，难以导入细胞内。另外，由于核酸酶会分解外源性的核酸，为了确保其在细胞内的稳定性和抑制效果的持续性，需要保护其不受细胞内存在的核酸酶的影响。鉴于上述问题，针对核酸向细胞内的导入，至今为止提出了各种方法，但这些方法大致分为使用病毒载体的方法和不使用病毒载体的方法。病毒载体是指欠缺复制能力的病毒，在使用了病毒载体的基因导入方法中，具有可以利用病毒的增殖方式的优点，使从进入细胞内至蛋白质合成均高效地推进这样的优点。作为病毒载体，使用来源于腺病毒、反转录病毒、慢病毒、腺相关病毒随伴々^> 7)的重组病毒载体(例如，参照专利文献1、非专利文献I)。然而，使用病毒载体的方法被指出存在因病毒而致癌等的危险性，实际上也确认存在死亡病例。另外，存在因产生病毒中和抗体而导致失活等问题，同时还伴随着难以大量生产、难以进行品质管理的问题。另一方面，作为不使用病毒载体而向靶细胞内导入核酸的方法，提出了磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、脂转染物法、显微注射法、流体动力学法、利用抗体、肽等载体与核酸的复合物的方法等各种方法(例如，参照非专利文献I)。然而，不使用病毒载体的现有核酸导入方法中，用于将以siRNA为首的核酸导入细胞中的基因医药构建无法说是充分的。即，正在寻求不限细胞种类、兼具实现高效且以高重现性导入核酸、提高对细胞内的核酸酶的耐性、提高序列特异性地与靶核酸结合以及亲和性、低细胞毒性等性质的新型核酸载体。截止至今，开发了各种向核酸载体、细胞中导入核酸的方法，近年来，使用了生物体内的信号肽等功能性肽的、向核酸载体和细胞中导入核酸的方法备受瞩目。例如有以下方法:使用核定位化信号肽(例如，参照专利文献2、3)、其它信号肽(例如，参照专利文献4)、设计肽(例如，参照专利文献5)，向细胞内导入阴离子性核酸的方法；组合使用利用糖修饰肽使细胞特异性提高的核酸载体(例如，参照专利文献6)、两亲性聚合物与肽结合而成的功能性分子(例如，参照专利文献7)、已有的核酸载体与肽的方法(例如，参照专利文献8)等。 现有技术文献
专利文献专利文献1:日本特开平10-146191号公报专利文献2:日本特表2003-514564号公报专利文献3:日本特开2001-288200号公报专利文献4:日本特表平10-506001号公报专利文献5:日本特开2002-316997号公报专利文献6:日本特开平11-290073号公报专利文献7:日本特表2003-503370号公报专利文献8:日本特开2004-65238号公报非专利文献非专利文献1:仲岛一范、北村义浩编著、“必f上手< ^ <遺伝子導入i発現解析
7。口卜 2 —羊土社、2003 年 9 月、ISBN978489706411
发明内容
如上所述，截止至今，开发了向各种核酸载体和细胞中导入核酸的方法，但尚无已经确定的方法。另外，这些方法中大多以DNA为 靶，因此并不一定适合将低分子量且反应性比DNA还高的siRNA导入至细胞中。本发明是鉴于所述情况而进行的，其目的在于，提供一种向细胞中导入核酸的方法、核酸载体和核酸复合物，所述方法能够将siRNA等双链核酸分子高效地导入靶细胞中，能够对双链核酸分子赋予对核酸酶的高耐性，且由细胞毒性带来的副作用风险小。用于实现前述目的的本发明的第一实施方式通过提供下述(1Γ(9)所述的向细胞中导入核酸的方法来解决上述问题。(I) 一种向细胞中导入核酸的方法，该方法具备以下工序:在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的前述碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、前述疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的折叠结构的肽链的核酸载体与前述双链核酸分子接触，介由前述碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及前述双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者，使前述双链核酸分子与前述肽链结合而形成核酸复合物的工序，以及，将前述核酸复合物导入细胞的工序。(2)根据(I)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组，前述疏水性氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组。(3)根据⑴或⑵所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述肽链具有(RL)n和(LR)n中任一者所示的氨基酸序列。(其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，η表示5以上且10以下的自然数。)(4)根据(1) (3)中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，在前述形成核酸复合物的工序中，前述双链核酸分子与核酸载体的摩尔比为1: 4 1:30。(5)根据(1) (4)中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述双链核酸分子为siRNA。(6)根据(1) (5)中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述核酸复合物具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性。(7)根据(6)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述核酸复合物所含的前述双链核酸分子或前述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。(8)根据(7)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述信号肽具有下述的序列号1 13中任一个所不的氨基酸序列，QAKKKKLDK[序列号 I]SPQPKKKP[序列号 2]RQARRNRRRRffR[序列号 3]GPKKKRKV[序列号 4]NSAAFEDLRVLS[序列号 5]RQIKIffFQNRRMKffKKEN[序列号 6]GRKKRRQRRRPPQG[序列号 7]LPPLERLTL[序列号 8]ALQKKLEELELDE[序列号` 9]LALKLAGLDI[序列号 10]SLEGAVSEISLRD[序列号 11]LPVLENLTL[序列号 12]LASLMNLGMS[序列号 13]。(9)根据(J)或⑶所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述信号肽的末端结合于前述核酸载体所含的肽链或前述双链核酸的末端。本发明的第二实施方式通过提供下述的(10) (16)所述的核酸复合物来解决上述问题。(10) 一种核酸复合物，其中，该核酸复合物为在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的前述碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、前述疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β_折叠结构的肽链的核酸载体与双链核酸分子介由前述核酸载体的肽链所含的碱性氨基酸的侧链与前述双链核酸分子的磷酸基的静电相互作用而结合得到的。(11)根据(10)所述的核酸复合物，其中，前述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组，前述疏水性氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组。(12)根据(10)或(11)所述的核酸复合物，其中，前述肽链具有(RL)dP (LR)n中任一者所示的氨基酸序列。(其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，η表示5以上且20以下的自然数。)(13)根据(10) (12)中任一项所述的核酸复合物，其特征在于，前述双链核酸分子为siRNA。
(14)根据(10) (13)中任一项所述的核酸复合物，其中，前述双链核酸分子或结合于其的前述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。(15)根据(14)所述的核酸复合物，其中，前述信号肽具有上述的序列号f序列号13中任一个所示的氨基酸序列。(16)根据(14)或(15)所述的核酸复合物，其中，前述信号肽的末端结合于前述核酸载体所含的肽链或前述双链核酸的末端。本发明的核酸载体在具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，具有形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β -折叠结构的肽链。有报告称，形成折叠结构的肽与双链DNA等双链核酸分子可介由双链核酸分子与肽之间的氢键等而结合，从而形成复合物(例如，参照Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, vol.74(1977)，p.1458-1462)。本发明的核酸载体所含的肽链中，由于碱性氨基酸与疏水性氨基酸交替排列，因此在形成β -折叠结构时，具有正电荷的碱性氨基酸的侧链以约7nm的间隔配置在β-折叠结构的单面一侧。该间隔与核苷酸链中的磷酸基之间的间隔基本一致。因此，本发明的核酸载体在形成有β_折叠结构的肽链部分处介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者与双链RNA、双链DNA等双链核酸分子牢固地结合，从而可以大幅提高这些双链核酸分子的核酸酶耐性，同时，由于疏水性氨基酸的侧链露出至复合物的外面，因此由脂质双分子膜形成的细胞膜的透过性提高，从而可以提高向细胞中导入双链核酸分子的效率。另外，通过适当选择肽链部分的氨基酸序列，还可以增加与核酸载体的双链核酸分子的亲和性、碱基序列特异性。另外，本发明的核酸载体由于以多肽为基底，因此细胞毒性低，可以降低应用于基因治疗、基因制剂时的副作用。进而，通过用信号肽修饰等，还可以实现细胞内的定位化控制、增加细胞特异性，可以赋予增加核酸导入效率、降低基因治疗中的副作用等各种功能。本发明的向细胞中导入核酸的方法中，由于使用具有上述那样的特征的核酸载体向靶细胞中导入双链核酸分子，因此具有以下效果:能够将siRNA等双链核酸分子高效地导入靶细胞中，能够对双链核酸分子赋予对核酸酶的高耐性，且由细胞毒性带来的副作用的风险小。另外，本发明的核酸复合物在能够高效地向靶细胞内导入siRNA等双链核酸分子的同时，还具有对核酸酶的高耐性。进而，由于以多肽为基底，因此细胞毒性低，可以降低应用于基因治疗、基因制剂时的副作用，可以适合地用于这些用途。
图1为siRNA、核酸载体(RL)7和核酸复合物的圆二色性(CD)谱图。图2为显示核酸载体中的肽链长度对向Jurkat细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片。图3为显示核酸载体与双链核酸分子的摩尔比对向Jurkat细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片和荧光谱图。
图4为显示核定位化信号(NLS)肽和长链羧酸与(RL)7的共轭对向Jurkat细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片。
图5为显示核酸载体与双链核酸分子的摩尔比对向HeLa细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片和荧光谱图。图6为显示核输出信号(NES)肽与(RL)7的共轭对向HeLa细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片。图7为显示核酸复合物所含的siRNA在10%胎牛血清(FBS)中的经时变化的凝胶电泳的结果。图8为显示核酸复合物所含的siRNA在10%胎牛血清(FBS)中的经时变化的凝胶电泳的结果。图9为显示在核酸载体和RNAiFect的存在下对Jurkat细胞进行培养时的存活率的经时变化的图。图10为显示在核酸载体和RNAiFect的存在下对K562细胞进行培养时的存活率的经时变化的图。
具体实施例方式接着，针对将本发明具体化的实施方式进行说明，以供于理解本发明。本发明的第一实施方式涉及的向细胞中导入核酸的方法(以下，有时简称为“向细胞中导入核酸的方法”或“本方法”。)具备以下工序:在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β -折叠结构的肽链的核酸载体与双链核酸分子接触，介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与肽链之间的氢键的一者或两者，使双链核酸分子与前述肽链结合而形成核酸复合物的工序，以及将核酸复合物导入细胞的工序。
首先，针对本方法中使用的核酸载体(以下，有时简称为“核酸载体”。)和本发明的第二实施方式涉及的核酸复合物(以下，有时简称为“核酸复合物”或”复合物”。)进行更详细的说明。(I)核酸载体在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，核酸载体具有形成β_折叠结构的肽链，所述β_折叠结构中，具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侦U。如上所述，呈折叠结构的多肽链可以与双链DNA(dsDNA)等双链核酸分子形成复合物，尤其是，如果肽链呈现具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在折叠结构的单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的二级结构，则可以介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者，在两者之间形成稳定的结合。如此形成的核酸复合物中，疏水性氨基酸的侧链朝向外侧，因此与由复合物的脂质双分子膜形成的细胞膜的亲和性增大，导入细胞内的效率提高。对于肽链的氨基酸序列而言，只要是满足上述条件，即满足在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，可以形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β -折叠结构，介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者，在两者之间形成稳定的结合的条件，则没有特别限定。另外，β-折叠结构只要满足上述条件，也可以是平行β-折叠和反平行β-折叠结构中的任一种。β -折叠结构的形成可以使用圆二色性(CD)谱图等任意的公知方法进行确认。作为肽链的优选氨基酸序列，可列举出选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸与选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组中的疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列。碱性氨基酸和疏水性氨基酸的种类可以根据用于形成复合物的双链核酸分子的种类、结构等进行适当选择。另外，多肽链长度可以根据用于形成复合物的双链核酸分子的链长、即双链核酸分子具有的磷酸基(负电荷)的数量等进行适当选择。多肽链相对于双链核酸分子过短时，无法形成稳定的复合物，同时无法获得保护双链核酸分子不受核酸酶影响的效果。另一方面，多肽链相对于双链核酸分子过长时，由于碱性氨基酸残基所具有的正电荷，向细胞中导入核酸复合物的效率降低。作为更优选的肽链的氨基酸序列，可列举出(RL)dP (LR)1^任一项所示的氨基酸序列。其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基。精氨酸(R)残基含有胍基作为碱性基团，如下述的化学式所示的那样，由于其可与磷酸基强烈地相互作用，因此在形成稳定的复合物的方面是优选的。[化学式I]
权利要求
1.一种向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，该方法具备以下工序:在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的所述碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、所述疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与所述双链核酸分子接触，介由所述碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及所述双链核酸分子与所述肽链之间的氢键的一者或两者，使所述双链核酸分子与所述肽链结合而形成核酸复合物的工序；以及，将所述核酸复合物导入细胞的工序。
2.根据权利要求1所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组，所述疏水性氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述肽链具有(RL)1^P (LR)n中任一者所示的氨基酸序列， 其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，η表示5以上且20以下的自然数。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，在所述形成核酸复合物的工序中，所述双链核酸分子与核酸载体的摩尔比为1: Γ1:30。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述双链核酸分子为siRNA。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述核酸复合物具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性。
7.根据权利要求6所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述核酸复合物所含的所述双链核酸分子或 所述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。
8.根据权利要求7所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述信号肽具有下述的序列号广序列号13中任一个所示的氨基酸序列， QAKKKKLDK[序列号 I] SPQPKKKP[序列号 2] RQARRNRRRRffR[序列号 3] GPKKKRKV[序列号 4] NSAAFEDLRVLS[序列号 5] RQIKIffFQNRRMKffKKEN[序列号 6] GRKKRRQRRRPPQG[序列号 7] LPPLERLTL[序列号 8] ALQKKLEELELDE[序列号 9] LALKLAGLDI[序列号 10] SLEGAVSEISLRD[序列号 11] LPVLENLTL[序列号 12] LASLMNLGMS[序列号 13]。
9.根据权利要求7或8所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述信号肽的末端结合于所述核酸载体所含的肽链或所述双链核酸的末端。
10.一种核酸复合物，其特征在于，该核酸复合物为在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的所述碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、所述疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与双链核酸分子介由所述核酸载体的肽链所含的碱性氨基酸的侧链与所述双链核酸分子的磷酸基的静电相互作用而结合得到的。
11.根据权利要求10所述的核酸复合物，其特征在于，所述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组，所述疏水性氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组。
12.根据权利要求10或11所述的核酸复合物，其特征在于，所述肽链具有(RL)1^P(LR)n中任一者所示的氨基酸序列， 其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，η表示5以上且20以下的自然数。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的核酸复合物，其特征在于，所述双链核酸分子为siRNA。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的核酸复合物，其特征在于，所述双链核酸分子或结合于其的所述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。
15.根据权利要求14所述的核酸复合物，其特征在于，所述信号肽具有下述的序列号f序列号13中任一个所示的氨基酸序列， QAKKKKLDK[序列号 I] SPQPKKKP[序列号 2] RQARRNRRRRffR[序列号 3] GPKKKRKV[序列号 4] NSAAFEDLRVLS[序列号 5] RQIKIffFQNRRMKffKKEN[序列号 6] GRKKRRQRRRPPQG[序列号 7] LPPLERLTL[序列号 8] ALQKKLEELELDE[序列号 9] LALKLAGLDI[序列号 10] SLEGAVSEISLRD[序列号 11] LPVLENLTL[序列号 12] LASLMNLGMS[序列号 13]。
16.根据权利要求14或15所述的核酸复合物，其特征在于，所述信号肽的末端结合于所述核酸载体所含的肽链或所述双链核酸的末端。
全文摘要
本发明公开了一种向细胞中导入核酸的方法以及用于其的核酸复合物，所述方法具备以下工序在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有下述肽链的核酸载体与双链核酸分子接触，介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及氢键的一者或两者，使前述双链核酸分子与前述肽链结合而形成核酸复合物，其中，所述肽链形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构。
文档编号C12N15/09GK103180440SQ20118003411
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月7日 优先权日2010年7月10日
发明者藤井政幸 申请人:学校法人近畿大学