专利名称：防御素变体及其使用方法
技术领域：
本发明涉及具有抗病原菌活性的多肽以及编码该多肽的多核苷酸。本发明的方法利用这些抗病原菌多核苷酸和多肽控制植物病原体并且增强植物的病原抗性。
背景技术：
植物病害通常严重限制了农业生产力，因此影响了农耕作业的历程和发展。多种病原体导致植物病害，包括真菌、细菌、病毒和线虫。然而，在农作物传染病的致病病原中，真菌是经济上最重要的植物病原体群，它们每年造成大批适销食物、纤维和饲料损失。在传统上是通过农耕作业，包括轮作、使用农用化学品以及常规的繁育技术，来控制植物病害的发生。然而，使用化学品控制植物病原体会增加农民的成本，并且对生态系统造成有害影响。消费者和政府管理者等越来越关切生产和使用保护植物免受病原体侵害的合成农用化学品相关的环境危害。由于这些关切，管理者已禁止或限制使用更具危害性的化学品中的一些。通过繁育抗性作物在一定程度上控制了真菌病害的发生。然而，传统繁育方法是耗时的，且随着病原体的进化需要连续的努力来维持病害抗性。参见(例如)Groverand Gowthaman (2003) Curr.Sc1.84:330-340 (Grover 和 Gowthaman, 2003 年，《现代科学》，第84卷，第330-340页)。因此，研究人员对于开发用于控制植物病原体的新型替代方法表现出极大的兴趣，该方法与基于传统农用化学品的方法特性相比具有更低污染和环境危害风险，并且与常规繁育技术相比繁琐性更低。最近，农业科学家通过对植物进行基因工程操作使之表达抗病原蛋白，培育出了病原抗性增强的农作物。目前正不断努力，进行抗病原菌药剂的鉴别以及病害抗性植物的基因工程操作。因此，鉴于植物病原体，尤其是真菌病原体对作物产量和质量的显著影响，需要保护植物免受病原体侵害的新组合物和方法。
发明内容
提供了保护植物免受病原体侵害的组合物和方法。该组合物包含抗病原菌(尤其是抗真菌)多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。本发明所公开的多肽显示出对植物真菌病原体的抗病原菌活性。还提供了包含编码本发明所公开的抗病原菌多肽的核苷酸序列的多核苷酸。通过使用DNA改组鉴别多肽和编码该多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，与用于产生新型抗病原菌多肽编码序列的DNA改组事件的亲本多肽相比时，抗真菌多肽显示出具有改善的抗病原菌活性。组合物还包含表达盒，其包含编码本文所公开的抗病原菌多肽的多核苷酸。还提供了包含本发明所公开的多核苷酸和多肽的植物、植物细胞、种子和微生物。该组合物用于涉及在植物中诱导病原抗性，尤其是真菌抗性的方法。在特定实施例中，该方法包括将编 码抗病原多肽的至少一种多核苷酸引入植物。因此，抗病原多肽在植物中表达，并且病原体暴露于病原体攻击位点的优选蛋白质，从而增强病原抗性。组织优选的启动子可用于驱动抗病原菌蛋白在尤其易受病原体攻击的特定植物组织，例如根、叶、茎、维管组织和种子中的表达。病原体诱导型启动子也可用于驱动病原体感染位点处或附近抗病原菌蛋白的表达。还提供了抗病原菌组合物和制剂，以及将它们用于保护植物免受病原体，尤其是真菌病原体侵害的方法。在一些实施例中，组合物包含抗病原菌多肽，或包含具有编码抗病原菌多肽的多核苷酸与载体组合的微生物。使用这些组合物保护植物免受病原体侵害的方法包括通过(例如)喷雾、喷粉、撒播或种子包衣将抗病原菌组合物施用至植物病原体的环境。本发明所公开的方法和组合物可用于保护植物免受病原体，包括真菌病原体、病毒、线虫等等的侵害。本发明涵盖以下实施例:1.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO: 6、8、10或12中示出的氨基酸序列；以及(b)与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗病原菌活性。 2.实施例1的分离的多肽，其中所述多肽具有与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。3.实施例1或实施例2的分离的多肽，其中所述多肽具有抗真菌活性。4.实施例3的分离的多肽，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。5.实施例2的分离的多肽，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌(Colletotrichum graminocola)和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)中至少一者的改善的抗真菌活性。6.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列:(a) SEQ ID NO: 3、5、7或9中示出的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)编码与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。7.实施例6的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。8.实施例6的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。9.实施例8的分离的多核苷酸，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时具有改善的抗真菌活性。10.实施例8的分离的多核苷酸，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。11.包含实施例6-10中任一项的多核苷酸的表达盒。12.实施例11的表达盒，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在植物中表达的启动子。13.实施例11的表达盒，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在微生物中表达的启动子。14.包含实施例6-10中任一项的多核苷酸的宿主细胞。15.包含实施例11的表达盒的宿主细胞。16.包含有效连接至驱动在植物中表达的启动子的异源多核苷酸的植物，其中所述异源多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)编码与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。17.实施例16的植物，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。18.实施例16的植物，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。
19.实施例18的植物，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。20.实施例18的植物，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。21.实施例16-20中任一项的植物，其中所述核苷酸序列经过优化，以便在植物中表达。22.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物是选自细胞、种子和籽粒的植物部分。23.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物是单子叶植物。24.实施例23的植物，其中所述单子叶植物是玉米、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。
25.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物是双子叶植物。26.实施例25的植物，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。27.实施例16-20中任一项的植物，其中所述多核苷酸稳定整合到植物的基因组。28.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物显示出增强了对植物病原体的抗性。29.实施例28的植物，其中所述植物病原体是真菌。30.实施例29的植物，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。31.实施例16-20中任一项的植物，其中所述启动子是组织优选的启动子。32.实施例31的植物，其中所述组织优选的启动子选自叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子、茎优选的启动子和维管组织优选的启动子。33.实施例16-20中任一项的植物，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。34.实施例16-33中任一项的植物的转化种子。35.增强植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括为所述植物提供选自如下的多肽:(a)包含SEQ ID NO: 6、8、10或12中示出的氨基酸序列的多肽；以及(b)包含与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。36.实施例35的方法，其中所述多肽具有与SEQ ID NO: 6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少
一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。37.实施例35的方法，其中所述多肽具有抗真菌活性。38.实施例37的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。39.实施例37的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
40.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物是选自细胞、种子和籽粒的植物部分。41.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。42.实施例41的方法，其中所述单子叶植物是玉米、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。43.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。44.实施例43的方法，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。45.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物病原体是真菌。46.实施例45的植物，其中所述真菌是禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。47.实施例35的方法，其中所述植物种植在耕作区，其中所述耕作区具有所述植物病原体，或其中所述种植区的环境条件有利于所述植物病原体的生长。48.实施例35的方法，其中提供多肽包括将包含选自如下核苷酸序列的异源多核苷酸引入所述植物:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性 的多肽；以及(d)编码与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。49.实施例48的方法，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。50.实施例48的方法，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。51.实施例50的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。52.实施例50的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。53.实施例48-52中任一项的方法，其中所述多核苷酸稳定整合到植物的基因组。54.实施例48-52中任一项的方法，其中所述异源多核苷酸有效连接至所述植物中具有活性的启动子。55.实施例54的方法，其中所述启动子是组织优选的启动子。56.实施例55的方法，其中所述组织优选的启动子选自叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子、茎优选的启动子和维管组织优选的启动子。
57.实施例54的方法，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
58.包含根据实施例1-5中任一项的至少一种多肽的抗病原菌组合物。59.实施例58的组合物，还包含载体。60.保护植物免受植物病原体侵害的方法，该方法包括将根据实施例58的组合物施用至植物病原体的环境。61.实施例60的方法，其中所述组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子包衣的方法施用。62.实施例60的方法，其中所述植物病原体是真菌。63.实施例62的方法，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。64.包含有效连接至驱动在微生物中表达的启动子的至少一种异源多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)编码与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。65.实施例64的微生物，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID N0:4、6、8或10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。66.实施例64的微生物，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。67.实施例66的微生物，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。68.实施例66的微生物，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。69.包含根据实施例64-68中任一项的至少一种微生物的抗病原菌组合物。70.实施例69的组合物，还包含载体。71.保护植物免受病原体侵害的方法，该方法包括将根据实施例69的组合物施用至植物病原体的环境。72.实施例71的方法，其中所述组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子包衣的方法施用。73.实施例71的方法，其中所述植物病原体是真菌。74.实施例73的方法，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。
75.控制耕作区中的病原体的方法，所述方法包括:a)评估耕作区的环境条件是否存在病原体或条件是否有利于病原体生长；b)选择有效量的抗病原菌组合物，其中所述抗病原菌组合物为根据实施例58或实施例69的组合物；以及c)将所述抗病原菌组合物施用至作物、作物部分、种子或所述作物的耕作区。76.控制耕作区中的病原体的方法，所述方法包括:a)评估耕作区的环境条件是否存在病原体或条件是否有利于病原体生长；以及b)在耕作区种植包含有效连接至驱动在植物中表达的启动子的异源多核苷酸的作物种子或植物，其中所述异源多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列:(i)SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(ii)编码包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(iii)与SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及(iv)编码与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。77.实施例76的方法，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的 氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。78.实施例76的方法，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。79.实施例78的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。80.实施例78的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。81.实施例75-80中任一项的方法，其中所述病原体是真菌。82.实施例81的方法，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。本发明的这些和其他方面在以下给出的本发明具体实施方式
中更详细地公开。
图1示出了本发明所公开的五雄苦木(Picramnia pentandra)植物防御素(Pp-PDFl)变体氨基酸序列与Pp-PDFl氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的序列比对。
具体实施例方式提供了涉及诱导植物中的病原抗性，尤其是真菌抗性的组合物和方法。该组合物包含抗病原菌多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。具体地讲，提供了具有SEQ ID N0:6、8、10和12中示出的氨基酸序列的分离的多肽及其变体和片段。还提供了包含编码SEQ ID N0:6、
8、10和12中示出的氨基酸序列的核苷酸序列的分离的多核苷酸及其变体和片段。新型抗病原菌多肽和编码该多肽的核苷酸序列通过已知植物防御素序列，包括五雄苦木植物防御素Pp-PDFl的DNA改组生成。参见美国专利N0.6，911，577和7，396，980，每个专利全文以引用的方式并入本文。植物防御素包括硫堇、富含半胱氨酸的小肽、蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂等等。按照蛋白质结构分类(SCOP)系统，它们被称为防御素基因。防御素有防御作用，更具体地讲植物对病原体的防御中发挥作用，并且它们的一级和二级结构与昆虫防御素具有相似性。本发明的防御素归为蝎毒素样蛋白超家族和植物防御素家族。虽然不受任何作用机制的限制，但序列和相关基因在病害引起的病斑周围的表达可控制症状发展，如在过敏性反应(HR)中，通过控制蛋白酶介导的细胞死亡机制来控制症状发展。组合物也可以通过抑制病原体产生的蛋白酶或通过结合病原体的细胞壁组分直接起到抗病原菌蛋白的作用。第三，它们也可以作为扰乱膜功能，导致病原体细胞毒性的两亲性蛋白。防御素通常为富含半胱氨酸的小肽，并且显示出抗微生物活性。植物防御素通常包含约45-54个氨基酸，具有四个二硫键(Broekaert etal.(1995)Plant Physiol.(Bethesda) 108:1353-1358 (Broekaert 等 A, 1995 年，《植物生理学》，贝塞斯达，第108卷，第1353-1358页))。本发明的防御素抑制一系列病原体的生长，包括(但不限于):微摩尔浓度的真菌、线虫、细菌、昆虫和病毒。防御素通过多种机制抑制病原体损伤，包括(但不限于):膜离子渗透性的改变以及真菌靶标中菌丝分支的诱导(Garcia-Olmeda et al.(1998)Biopolymers, Peptide Science47:479-491(Garcia-Qlmeda等人，1998年，《生物聚合物(肽科学)》，第47卷，第479-491页)，以引用的方式并入本文)。此前公开的植物防御素(参见美国专利N0.6，911，577和7，396，980)根据序列同源性分为85组，并且用“CS”后面加三位数字来表示。用于产生本发明所公开的Pp-PDFl变体的DNA改组分析的Pp-PDFl多肽属于第18组，也可以用CS164来表示。全长Pp-PDFl多肽的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1和2中示出，而成熟Pp-PDFl多肽的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 3和4中示出。Pp-PDFl多肽及本发明所公开的其变体表现出至少对真菌禾谷镰孢菌(FGR)、禾生炭疽菌(CGR)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)(FVE)和玉米色二孢(Diplodia maydis) (DMA)的抗真菌活性。表I示出了 Pp-PDFl和改组的变体的IC50数据。表1.
权利要求
1.一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列: (a)SEQ ID N0:3、5、7或9中示出的核苷酸序列； (b)编码包含SEQID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列； (c)与SEQID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及 (d)编码与SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有与SEQIDN0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基； (d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基。
3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽，其中所述抗真菌活性与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时有所提闻。
4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽与包含SEQID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
5.—种表达盒,所述表达盒包含权利要求1所述的多核苷酸。
6.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达盒。
7.一种微生物,所述微生物包含权利要求5所述的表达盒。
8.一种植物或植物部分，所述植物或植物部分包含有效连接至驱动在所述植物中表达的启动子的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列: (a)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列； (b)编码包含SEQID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列； (c)与SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及 (d)编码与SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
9.根据权利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸编码具有与SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；(d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基。
10.根据权利要求8所述的植物，其中所述多肽与包含SEQID NO: 2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
11.根据权利要求8所述的植物，其中所述多肽与包含SEQID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
12.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是选自细胞、种子和籽粒的植物部分。
13.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
14.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。
15.—种增强植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括为所述植物提供选自如下的多肽: (a)包含SEQID N0:6、8、10或12中示出的氨基酸序列的多肽；以及 (b)包含与SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多肽具有与SEQID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基； (d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述多核苷酸稳定整合到所述植物的所述基因组。
18.一种抗病原菌组合物，所述抗病原菌组合物包含根据权利要求2所述的至少一种多肽。
19.根据权利要求18所述的组合物，还包含载体。
20.一种保护植物免受病原体侵害的方法，所述方法包括将根据权利要求18所述的组合物施用至植物病原体的所述环境。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子包衣的方法施用。
全文摘要
本发明涉及保护植物免受病原体，尤其是真菌病原体侵害的组合物和方法。组合物包括通过DNA改组生成的抗病原菌多肽的新型变体的氨基酸序列及其变体和片段，其表现出改善的抗病原菌活性。还提供了编码所述抗病原菌多肽的多核苷酸。还提供了一种使用本文所公开的所述多核苷酸诱导植物中的病原抗性的方法。还提供了包含抗病原菌多肽或具有本发明的抗病原菌多核苷酸与载体组合的微生物的组合物，以及使用这些组合物保护植物免受病原体侵害的方法。还公开了包含本发明的抗病原菌多核苷酸或多肽的植物、植物细胞、种子和微生物。
文档编号C12N15/82GK103154252SQ201180048727
公开日2013年6月12日 申请日期2011年8月19日 优先权日2010年8月23日
发明者J.J.恩格利什, S.L.格兰特, J.S.波拉克, J.L.里特兰德, G.A.桑达尔 申请人:先锋国际良种公司