起子培养物组合物的制作方法

专利名称：起子培养物组合物的制作方法
技术领域：
乳酸菌在全世界范围内广泛用于奶制品工业中，用来生产各种发酵乳制品，比如干酪、酸奶酪、酸奶油、酸乳酒、黄油和马奶酒。在制造上述产品中必须的用于启动和进行所期望的发酵的所选择的乳酸菌菌株通常称为“起子培养物”。通常用于食品工业的乳酸菌可分成包括Lactococcus、Leuconostoc和Pediococcus属的嗜温性乳酸菌和包括Streptococcus和Lactobacillus属的嗜热性乳酸菌。嗜温性乳酸菌具有约30°C的最佳生长温度，而嗜热性乳酸菌具有约40°C至约45°C的最佳生长温度。起子培养物可直接接种至牛奶而不经中间的转移和/或繁殖。这种起子培养物一般称为直投式(DVS)培养物或直投式接种(DVI)培养物。起子培养物一般可从商业制造商以冻干的(冷冻干燥的)、冷冻的或液体的形式获得。它们可仅包含单个乳酸菌种，但是也可以是包含两个或更多个不同乳酸菌种的混合培养物。为了保持冻干的(冷冻干燥的)、冷冻的和液体的起子培养物的高细胞数、改善的稳定性和/或活力和/或代谢活性，通常添加添加剂，比如，营养物和冷冻保护剂。在Miles Laboratories的EP-0259739-A1中，在冷冻之前，冷冻保护剂与柠檬酸和葡萄糖或含有葡萄糖键的碳水 化合物的组合物一起添加至培养物悬液并且随后冷冻干燥培养物。EP-0259739-A1中的冷冻保护剂可以是蔗糖、蛋白胨、酪胨、谷氨酸的盐、甘油、二甲基亚砜、非脂肪奶粉、酪蛋白、乳清、果糖或麦芽糖。柠檬酸和葡萄糖或含有葡萄糖键的碳水化合物的组合物用作冷冻保护剂的增效剂并且进一步增加冷冻干燥的培养物浓缩品的保存稳定性。ICI的W091/11509描述冷冻干燥的培养物，其包含抗坏血酸抗氧化剂和用作抗氧化剂增效剂的单羧酸α-氨基酸的组合物。所述组合物在冷冻之前添加至培养物并且随后冷冻干燥培养物。任选地，也添加碳水化合物和粘度诱导物和冷冻保护剂的组合物。冷冻保护剂可以是糖肽和/或其非毒性、水溶性盐、非脂肪脱脂奶粉和/或乳清粉末，或可以是碳水化合物，比如蔗糖、甘露醇、海藻糖、肌醇、核糖醇和这些碳水化合物的两种或更多种的组合。Chr.Hansen A/S的W000/39281描述液态(即非冷冻的)起子培养物，其包含在保存期间对培养物具有代谢活性稳定作用的添加剂。这些液态起子培养物作为商业上冷冻的和冷冻干燥的起子培养物的用途的有用备选替代物而出现。根据W000/39281，在保存期间对培养物具有代谢活性稳定作用的合适的添加剂是选自由下述物质组成的组的化合物:甲酸、甲酸盐、次磺酸盐(MP)、丝氨酸和参与核酸生物合成的化合物，包括腺苷-5'-单磷酸盐(AMP)、鸟苷-5'-单磷酸盐(GMP)、尿苷-5'-单磷酸盐(UMP)、胞苷-5'-单磷酸盐(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳清苷、胸苷、肌苷和任何这种化合物的衍生物。Chr.Hansen A/S的W02004/065584公开了包含冷冻保护剂的冷冻的乳酸菌。冷冻保护剂添加至细菌，然后冷冻细菌，产生细菌和冷冻保护剂的均匀混合物。术语“冷冻保护剂”在W02004/065584中定义为能够改善冷冻培养物的保存稳定性的物质。W02004/065584中冷冻保护剂可选自蛋白质、蛋白水解产物和氨基酸。这些冷冻保护剂的优选的合适例子包括选自由下述物质组成的组的这些:谷氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、酪蛋白酸钠、麦精、脱脂奶粉、乳清粉末、酵母提取物、谷蛋白、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、角蛋白和白蛋白。可选地，冷冻保护剂可以是碳水化合物。这些冷冻保护剂的优选的合适例子包括选自由下述物质组成的组的那些:戊糖(例如核糖、木糖)、己糖(例如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(例如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、低聚糖(例如棉子糖)、果糖(例如Actilight，fribroloses),多糖(例如麦芽糊精、黄原胶、果胶、藻酸酯、微晶纤维素、右旋糖酐、PEG)和糖醇(比如山梨糖醇、甘露醇)。冷冻保护剂的混合物也已被公开了。Chr.Hansen A/S的W02005/003327公开了冷冻的或冷冻干燥的培养物，其包含选自由下述物质组成的组的一种或多种冷冻保护剂:参与5’ -核酸生物合成的一种或多种化合物或任意这种化合物的一种或多种衍生物。发现冷冻的乳酸菌培养物中包含3%的甲酸钠降低保存稳定性。Chr.Hansen A/S的W02005/080548公开了包含冷冻保护剂的冷冻培养物。冷冻保护剂添加至培养物，然后冷冻培养物。Danisco的W02009/056979公开了冷冻的起子培养物组合物，其包含冷冻的细菌小球和分开的冷冻的甲酸盐和/或嘌呤小球并且还公开了包含冻干的细菌的冻干的起子培养物组合物，向所述组合物中添加粉末形式的甲酸盐和/或嘌呤。W02009/056979未公开在冷冻的细菌小球或冻干的细菌生产中使用冷冻保护剂。

考虑到起子培养物性能的重要性，本领域继续需要提供具有改善的代谢活性的起子培养物。本发明解决了该问题。发明详沭第一方面，本发明涉及制造起子培养物组合物的方法，所述组合物包含微生物、冷冻保护剂和至少一种刺激添加剂，所述方法包括下述步骤:a)在培养基中培养微生物；和b)从培养基中收集微生物；和c)添加冷冻保护剂至步骤b)中获得的微生物；和d)冷冻步骤c)中获得的微生物；和e)添加至少一种刺激添加剂至步骤d)中获得的微生物。在本发明方法的该第一种实施方式中，起子培养物组合物是冷冻的起子培养物组合物。在第二种实施方式中，步骤d)中获得的微生物经历冷冻干燥，然后在步骤e)中添加至少一种刺激添加剂至的冷冻干燥的微生物。冷冻干燥是本领域熟知的技术并且可包括步骤:冷冻微生物以获得冷冻的材料(步骤d))和随后降低周围的压力，同时添加足够的热以使得冷冻的材料中的冷冻水直接从固相升华至气相。可使用的冷冻干燥设备包括但不限于，旋转式汽化器冷冻干燥器，歧管冷冻干燥器和盘式冷冻干燥器。如果需要的话，可进行第二步骤，目的是去除未冷冻的水分子。确定合适的温度和压力曲线以实现满意的冷冻干燥是在本领域技术人员的知识经验范围内。冷冻干燥材料可为粉末或颗粒。“起子培养物”在本文定义为用于接种待发酵的培养基的含有微生物细胞的制齐U。本文所使用的“微生物”包括但不限于藻类、原生动物、病毒、细菌(比如乳酸菌、Brevibacterium 和 Propionibacterium)和真菌类(I:匕如 PeniciIlium、Geotrichum、Saccharomyces和Kluyveromyces属)。微生物可以是非修饰的(即野生型)或遗传修饰的。可使用或不使用重组DNA技术提供遗传修饰的微生物。在优选的实施方式中，微生物是真菌或细菌。优选的细菌是乳酸菌。在本上下文中，措辞“乳酸菌”表示一组革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动性的、微量需氧或厌氧细菌，其发酵糖产生酸。工业上最有用的乳酸菌在Lactococcus种、Streptococcus种、Enterococcus 种、Lactobacillus 种、Leuconostoc 种、Pediococcus 种和 Bifidobacterium种中找到。乳酸菌可分成嗜温性和嗜热性乳酸菌。Lactococcus、Leuconostoc和Pediococcus是属于嗜温性乳酸菌的属的例子。属于嗜热性乳酸菌的属的例子是Streptococcus和 Lactobacillus。Lactococcus种的例子是Lactococcus lactis。该种可进一步分成亚种，其包括但不限于 Lactococcus lactis cremoris、Lactococcus lactis lactis、Lactococcuslactis lactis 生物变型(biovar.) diacetylactis 和 Lactococcus lactis hordniae。Leuconostoc 种的例子是 Leuconostoc mesenteroides cremoris 和 Leuconostocparamesenteroides。Pediococcus 种的例子是 Pediococcus adidilacti 和 Pediococcuspentosaceus。Streptococcus 的例子是 Streptococcus thermophiIus 和 Streptococcussalivarius thermophilus。 Lactobacillus 种的例子是 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbruekii `ssp.Bulgaricus、 Lactobacillus casei 和 Lactobacillusacidophilus。起子培养物可包含一种微生物或可以是包含两种或更多种不同微生物的混合培养物。例如，起子培养物可包含3或4或5或甚至6或更多种不同的微生物。起子培养物可甚至包含益生菌。本发明的方法中，通过培养微生物并且分离培养的微生物生产微生物。为了获得足够量的微生物，优选在合适的发酵罐，例如至少50升，优选地至少100升的罐中进行相对大规模的发酵。微生物可培养为单种微生物，或在起子培养物是混合的起子培养物的情况下，可以是在混合的起子培养物的不同微生物的共发酵或共培养之后获得的微生物的混合物。共发酵和共培养是涉及发酵过程的同义词，其中2种或多种微生物作为混合物在同一个发酵过程中培养。可选地，可通过在培养单种微生物之后混合不同的微生物或通过将单种微生物与在共发酵或共培养之后获得的微生物混合获得混合的起子培养物。在一种实施方式中，在温度和/或pH控制下进行培养。可内部和/或外部pH控制，外部PH控制是优选的。内部pH控制包括但不限于，使用缓冲剂。外部pH控制包括但不限于，添加氨水、氢氧化钠或其他食品级苛性碱。pH控制在约5或更高的pH，优选地在5.0和7.0之间的pH。更优选地，pH控制在5.5和6.5之间，最优选的在5.8和6.3之间。
在有益于微生物生长的温度下进行培养一段时间直到达到期望的细胞浓度和培养物活性。通过冷却，培养可缓慢降低至例如低于10°c。首先，将微生物引入生长培养基并且在孵育步骤中微生物在生长培养基中生长/繁殖。换句话说，在引入步骤中，产生接种培养基并且在孵育步骤中，接种的培养基成熟产生培养物。生长培养基可以是适于菌株繁殖的任何生长培养基。其可以是合成生长培养基(即用型液体或需要先重构的粉末的培养基)、乳清或牛奶。发酵/培养之后，可通过技术人员熟知的技术，比如离心、(超)滤或其组合从生长培养基中回收/收获/隔离/分离有活力的细胞。隔离之后，获得微生物的浓缩培养物。可包装该浓缩的培养物用于随后的使用或在合适的条件下保存一段时间。优选地，隔离微生物具有至少lxl07cfu/ml,优选地至少lxl08cfu/ml,更优选地至少lxl09cfu/ml,更优选地至少lxl0lclcfu/ml,最优选地至少lxlOncfu/ml的有活力的细胞含量。或者，也可等分细胞用于随后的使用或保存，而不用先回收/收获/隔离/分离。“冷冻保护剂”在本文定义为用于保护细胞或组织在冷冻和融化期间免遭破坏的物质。冷冻保护剂可以是任何添加剂，只要其保护细胞或组织免遭在冷冻和融化期间的破坏。冷冻保护剂的例子包括但不限于糖(例如蔗糖、果糖、海藻糖)、多元醇(例如甘油、山梨糖醇、 甘露醇)、多糖(例如纤维素、淀粉、树胶、麦芽糊精)、聚醚(例如聚丙二醇、聚乙二醇、聚丁二醇)、抗氧化剂(例如天然抗氧化剂比如抗坏血酸、β_胡萝卜素、维生素Ε、谷胱甘肽、化学抗氧化剂)、油类(例如菜籽油、葵花籽油、橄榄油)、表面活性剂(例如Tween 20、Tween 80、脂肪酸)、蛋白胨(例如大豆蛋白胨、小麦蛋白胨，乳清蛋白胨)、胰蛋白胨、维生素、矿物质(例如铁、锰、锌)、水解产物(例如蛋白水解产物，比如乳清粉末、麦精、大豆)、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核苷、核碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺卩密唳、尿卩密唳、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷)、酵母提取物(例如Saccharomyces spp.、Kluyvermomycesa spp.或Torula spp.的酵母提取物)、牛肉提取物、生长因子和脂质。冷冻保护剂的例子也包含背景技术中引用的那些。本发明步骤c)中冷冻保护剂的添加可通过在合适的温度下使固体冷冻保护剂与步骤b)中获得的微生物混合合适的时间来完成。或者，添加剂的无菌溶液可与生物质混合。在一种实施方式中，添加剂选自由下述物质组成的组:冷冻保护剂、赋形剂、载体和营养物。冷冻步骤d)包括降低步骤c)中获得的微生物的温度至低于它们的冰点，从而有一个液体变成固体的相变。冷冻的材料可通过快速冷冻微生物来制造。快速冷冻可通过在适当的低温度下将微生物浸溃、喷射、喷雾、灌注或分散成为例如小滴、颗粒或薄流进入冷却培养基来进行。冷却培养基可为冷却的液体、冷却的固体或冷却的气体，例如液氮、液态二氧化碳或液态氦。在一种实施方式中，冷却培养基是液氮。在另一种实施方式中，将冷却培养基添加至微生物，这可通过例如将其灌注进入细胞的容器或将冷却的气流吹过或将冷却的气流起泡进入细胞悬液来实现。在另一种实施方式中，细胞放置在容器中并且容器与冷却培养基接触。冷冻的材料可具有小球或颗粒的形式。“刺激添加剂”在本文定义为增加前体材料(例如奶制品底物，例如牛奶)中微生物酸化活性的添加剂。换句话说，在刺激添加剂存在的情况下，前体材料中微生物的酸化活性比没有刺激添加剂的情况下前体材料中微生物酸化活性高。可通过如本文所述的试验测定酸化活性。在一种实施方式中，刺激添加剂是营养物。“营养物”在本文定义为在应用时可被微生物代谢并且可刺激酸化速度和/或微生物生长的化合物。刺激添加剂的例子包括但不限于抗氧化剂(例如天然抗氧化剂比如抗坏血酸、β_胡萝卜素、维生素Ε、谷胱甘肽、化学抗氧化剂)、蛋白胨(例如大豆蛋白胨、小麦蛋白胨、乳清蛋白胨)、胰蛋白胨、维生素、矿物质(例如铁、锰、锌)、水解产物(例如蛋白水解产物，比如乳清粉末、麦精、大豆)、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核苷、核碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷)、酵母提取物(例如Saccharomyces spp.、Kluyvermomycesa spp.、或Torula spp.的酵母提取物)、牛肉提取物、有机酸(例如甲酸或其盐或酯，例如甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵、甲酸钙、甲酸乙酯、甲酸甲酯)和生长因子。在优选的实施方式中，刺激添加剂是核碱基比如腺嘌呤、酵母提取物、甲酸或其盐或酯，例如甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵、甲酸钙、甲酸乙酯、甲酸甲酯。最优选的是腺嘌呤和甲酸或其盐或酯。刺激添加剂也可以是两种或更多种刺激添加剂的混合物。在优选的实施方式中，刺激添加剂是固体的，比如小球、颗粒、片剂或粉末。对于冷冻的起子培养物组合物，刺激添加剂可在方法的步骤e)中以固体形式，比如小球、颗粒、片剂或粉末添加。最优选地，刺激添加剂为冷冻形式，优选地为冷冻的小球。刺激添加剂可直接在冷冻之后添加至冷冻的微生物，或者，冷冻的细菌可在合适的条件下保存一段时间，然后将刺激添加剂添加至材料。对于冻干的起子培养物组合物，刺激添加剂可以固体形式，比如小球、颗粒、片剂或粉末，优选地颗粒或粉末，最优选地粉末形式添加。

以相对于冷冻培养物组合物重量的重量(wt/wt)测量，冷冻的起子培养物组合物包含，优选地从0.1%至90%、优选地从0.5%至85%、更优选地从1%至80%、甚至更优选地从2%至70%、最优选地从3%至65%、尤其从5%至60%的刺激添加剂。在另一种实施方式中，表示为[刺激添加剂重量]/[细胞重量]的刺激添加剂与细胞的比在0.01和25、优选地在0.02和20之间、更优选地在0.05和15之间、甚至更优选地在0.07和12之间、尤其在0.1和10之间。以相对于冷冻干燥的培养物组合物重量的重量(wt/wt)测量，冻干的起子培养物组合物包含，优选地从0.1%至90%、优选地从0.5%至85%、更优选地从1%至80%、甚至更优选地从2%至70%、最优选地从3%至65%、尤其从5%至60%的刺激添加剂。在另一种实施方式中，表示为[刺激添加剂重量]/ [细胞重量]的刺激添加剂与细胞的比在0.01和25之间、优选地在0.02和20之间、更优选地在0.05和15之间、甚至更优选地在0.07和12之间、尤其在0.1和10之间。在替代的实施方式中，将刺激添加剂添加至冷冻的材料并且所获得的冷冻的组合物经历升华。在一种实施方式中，本发明的方法还包括包装冷冻的或冷冻干燥的培养物组合物的步骤。组合物可包装在合适的袋(层压制品)、瓶、容器、罐、箱或任何合适的包装方式中。冷冻培养物组合物可在冷藏的情况下保持和运输延长的时间段。建议冷冻培养物组合物的保存温度低于-10°C、优选地低于-20°c、更优选地低于-30°c、甚至更优选地低于-40°c和尤其低于_50°C。
冷冻干燥的培养物组合物可不进行冷藏在干燥条件下保持和运输延长的时间段。但是，建议保存在低于0°C、更优选地低于15°C。在本发明制造冷冻干燥的起子培养物组合物的方法的具体的实施方式中，该方法包括一个步骤，其中冷冻干燥的微生物和/或添加至冷冻干燥的微生物的刺激添加剂和/或冷冻干燥的起子培养物组合物是经涂覆的。涂料可包含熟知的涂覆材料，比如油、黄油脂肪、麦芽糊精等等。可添加涂料以防止根据本发明的冷冻干燥的培养物组合物的组分结块和/或防止产品氧化和/或防止吸收潮气。在本发明的方法的具体的实施方式中，选自由赋形剂、载体和营养物组成的组的另一添加剂添加至微生物，然后冷冻。在第二方面，本发明提供优选地可通过本发明的方法获得的起子培养物组合物，其包含微生物、冷冻保护剂和至少一种刺激添加剂。包含微生物、冷冻保护剂和至少一种刺激添加剂的起子培·养物组合物可以是冷冻的起子培养物组合物或冷冻干燥的起子培养物组合物。微生物、冷冻保护剂和刺激添加剂与用于本发明的方法(本发明的第一方面)的本文之前描述的那些相同。根据本发明获得的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物典型地包含至少lxl07cfu/g、优选地至少lxl08cfu/g、更优选地至少lxl09cfu/g、甚至更优选地至少lxl0lclcfu/g、仍甚至更优选地至少lxlOncfu/g、尤其至少lxl012cfu/g、更尤其至少lxl013cfu/g的有活力的细胞的含量。以相对于冷冻培养物组合物重量的重量(wt/wt)测量，冷冻的起子培养物组合物包含，优选地从0.1%至90%、优选地从0.5%至85%、更优选地从1%至80%、甚至更优选地从2%至70%、最优选地从3%至65%、和尤其从5%至60%的刺激添加剂。在另一种实施方式中，表示为[刺激添加剂重量]/[细胞重量]的刺激添加剂与细胞的比在0.01和25之间、优选地在0.02和20之间、更优选地在0.05和15之间、甚至更优选地在0.07和12之间、尤其在0.1和10之间。以相对于冷冻干燥的培养物组合物重量的重量(wt/wt)测量，冻干的起子培养物组合物包含，优选地从0.1%至90%、优选地从0.5%至85%、更优选地从1%至80%、甚至更优选地从2%至70%、最优选地从3%至65%、和尤其从5%至60%的刺激添加剂。在另一种实施方式中，表示为[刺激添加剂重量]/[细胞重量]的刺激添加剂与细胞的比在0.01和25之间、优选地在0.02和20之间、更优选地在0.05和15之间、甚至更优选地在0.07和12之间、和尤其在0.1和10之间。如上所指出的，根据本发明的冷冻干燥的培养物组合物可以是涂覆的。本发明的一个方面涉及下述冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物，其比在冷冻之前添加刺激添加剂的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物具有更高的代谢活性，例如更高的酸化活性。本发明的另一方面涉及下述冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物，其与在冷冻之前添加刺激添加剂的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物相比具有改善的保存期。可通过本领域技术人员已知的各种试验测量酸化活性。实施例部分给出了合适的酸化试验的例子。其中可测量酸化活性的合适培养基的例子是牛奶并且在该情况下，如本文所使用的“酸化活性”意思是当用根据本发明的培养物组合物(在冷冻或冷冻干燥之后添加刺激添加剂)接种并且与具有大概相同细胞数量和刺激添加剂浓度，但是其中在冷冻培养物之前添加刺激添加剂的培养物组合物相比较，牛奶的PH随着时间改变(即降低)。在本发明的第三方面，根据本发明的冷冻培养物组合物可存在于包装比如袋中。在一种实施方式中，包装可包含冷冻培养物小球/颗粒和刺激添加剂小球/颗粒的混合物或冷冻培养物小球/颗粒和刺激添加剂粉末的混合物。不同菌株可存在于一个包装中。不同的刺激添加剂可存在于一个包装中。另外，至少地包含有包含冷冻培养物组合物的包装和包含刺激添加剂的包装的试剂盒是本发明的一部分。包装可以是容器、袋、瓶、箱等。培养物和刺激添加剂可使用相同类型或不同类型的包装。包装的尺寸可相同或不同。如果需要的话，试剂盒可包含进一步的包装。这些包装可含有液态、冷冻干燥的或冷冻形式的培养物或进一步地固体或液态形式的添加剂。如之前指出的，冷冻干燥的培养物组合物和/或刺激添加剂可以是涂覆的。这防止结块等。本发明的第五方面涉及通过使用根据本发明的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物或试剂盒生产培养的食品或饲料产品的方法。所以，本发明也涉及制造发酵产物的方法，其通过将根据本发明冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物或试剂盒添加至底物并使得其发酵底物以生产发酵产物来实现。在一种实施方式中，生产培养的食品或饲料产品或发酵产物的方法包括下述步骤:a)用根据本发明的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物或试剂盒接种前体材料，b)用冷冻的和/或冷冻干燥的培养物培养前体材料，和c)生产/获得培养的食品。在使用试剂盒的情况下，可在相同时间下将包装添加至前体材料或可以任何顺序连续添加。底物或前体材料可以是食品底物比如大豆底物、肉底物、面包房用底物、葡萄酒、饮料、果汁或蔬菜制品或奶制品底物，例如牛奶。典型地，发酵产物或食品是奶制食品或源于奶制食品的食品或发酵牛奶品，例如干酪、酸奶酪、黄油、夸克奶酪、酸奶油、熟化乳酪、婴J L奶粉、乳酪甜点、冰淇淋、接种甜牛奶、黄油牛奶、酸乳酒、马奶酒、牛奶饮品、发酵的乳清饮品、发酵的牛奶或饮料酸奶酪 。在另一种实施方式中，发酵产物或食品是肉制品、蔬菜制品、饮品、甸甸酒制品、烤倍食品、果汁制品。干酪包括但不限于软干酪、埃曼塔拉(Emmenthal)干酪、软奶酪、菲达(Feta)奶酪、大陆(Continental)干酪、帕斯塔菲拉塔(Pasta Filata)干酪、切达(Cheddar)干酪和Grana干酪。在另一种实施方式中，冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物可在益生菌活性产品例如甜味嗜酸牛奶中用作益生菌。在另一种实施方式中，根据本发明的组合物可用于生产饲料产品，比如青贮饲料例如草或谷类材料。在第六方面中，本发明提供根据了本发明的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物或试剂盒在制造本发明另一方面的食品或饲料产品的方法中的用途。
_5] 材料和方法冷冻的和冻干的组合物的酸化活性试验通过用实施例中指示的量的冷冻的或冻干的组合物，接种200g的9.5%再生脱脂牛奶(RSM)，来测量冷冻的和冻干的起子培养物组合物的酸化活性。在一个实验中，对于每种组合物，给牛奶加相同量的生物质。这允许针对一种培养物浓缩物的所有组合物，比较恒定的乳酸菌浓度下的酸化活性。另外，对于不同组合物的比较，刺激添加剂(例如甲酸钠或酵母提取物)的浓度保持相同。牛奶在31°C下(例如，对于嗜温性乳酸菌)或37°C (例如，对于嗜热性乳酸菌)孵育至少6小时。孵育期间连续检测pH。孵育期间，达到pH=5.5的时间(TTR，以分钟表示)用作组合物的酸化活性的测量值。酸化活性试验的精确度和再现性在±10分钟范围内。冷冻干燥冷冻培养物小球引入预调整至_25°C (冷凝器温度_68°C )的冷冻干燥装置(具有 Wizard 2.0 数据中心(SP Scientific)和真空泵(Edwards High Vacuum)的 VirTis 优势冷冻干燥器)。接着，装置的温度和压力设置为-10°C和50mbar，40小时；25°C和50mbar，3小时；和最终至25°C和300mbar，25小时以干燥产物。
实施例实施例1包含Streptococcus thermophiIus的冷冻培养物组合物的生产和酸化活性Streptococcus thermophilus菌株在合适的生长培养基上生长。发酵之后，离心发酵液并且获得包含约lxl0nCfU/ml的浓缩物。浓缩物分成两等批。冷冻之前，向一批添加刺激添加剂(甲酸盐)，而在冷冻之后向另一批添加刺激添加剂。详细地，冷冻的组合物如下制备。 组合物1:向一批培养物浓缩物添加50%(w/w)的甲酸钠溶液。获得的包含82.3%(w/w)的浓缩物和17.7%(w/w)的50%(w/w)甲酸钠溶液的组合物接着通过将其浸入液氮而被冷冻。获得的冷冻的产物(即冷冻的培养物小球)保存在_40°C下直到进一步使用。组合物I的甲酸钠含量是8.875%(w/w)，而82.25%(w/w)是冷冻培养物浓缩物而剩余的
8.875%(w/w)是来自甲酸钠溶液的水。组合物2:通过将培养物浓缩物浸溃在液氮中冷冻另一批的培养物浓缩物。向获得的冷冻的产物(即冷冻培养物小球)添加甲酸钠粉末。组合物的甲酸钠的含量是
9.73%(w/w);剩余90.27%(w/w)是冷冻培养物浓缩物。获得的组合物保存在_40°C下直到进一步使用。该组合物称为组合物2。组合物I和2含有相同的甲酸钠与冷冻培养物浓缩物的比。酸化活性:16mg的组合物I和14.59mg的组合物2用于“材料和方法”部分中描述的酸化测试。表I中的结果显示组合物2 (在冷冻之后添加甲酸钠)比组合物I (在冷冻之前，将甲酸钠添加至培养物浓缩物)具有更高的酸化活性。实施例2包含Streptococcus thermophilus的冷冻培养物组合物的另一种生产和酸化活性在根据实施例1的冷冻培养物组合物的生产中，将甲酸钠粉末添加至获得的冷冻的产物(即冷冻培养物小球)。在实施例2中，将冷冻的甲酸钠小球添加至获得的冷冻的产物(即冷冻培养物小球)。所有其他步骤和条件与实施例1相同。组合物3:向一批培养物浓缩物添加50% (w/w)甲酸钠溶液。获得的包含82.25% (w/w)浓缩物和17.75%(w/w)的50%(w/w)甲酸钠溶液的组合物接着通过将其浸溃入液氮中而被冷冻。获得的冷冻的产物(即冷冻培养物小球)保存在_40°C下直到进一步使用。组合物中甲酸钠含量是8.875%(w/w)，而82.25%(w/w)是冷冻培养物浓缩物而剩余的8.875%(w/w)是来自甲酸钠溶液的水。组合物3与组合物I相同。组合物4:通过将浓缩物浸溃如液氮冷冻另一批的培养物浓缩物。向获得的冷冻的产物(即冷冻培养物小球)添加冷冻的甲酸钠小球。这些小球含有40%(w/w)的甲酸钠，2%(w/w)的阿拉伯胶且剩余的是水。组合物中冷冻的甲酸钠小球含量是21.2%(w/w)，而剩余的78.8%(w/w)是冷冻培养物浓缩物。获得的组合物保存在_40°C下直到进一步使用。组合物3和4含有相同的甲酸钠和冷冻培养物浓缩物比。酸化活性:16.7mg的组合物3和18.Smg的组合物4用于“材料和方法”部分描述的酸化测试。表I中的结果显示组合物4 (在冷冻之后添加甲酸钠)比组合物3 (在冷冻之前，将甲酸钠添加至培养物浓缩物)具有更高的酸化活性。表1.冷冻培养物组合物
权利要求
1.制造起子培养物组合物的方法，所述组合物包含微生物、冷冻保护剂和至少一种刺激添加剂，所述方法包括下述步骤: a.在培养基中培养微生物；和 b.从所述培养基收集所述微生物；和 c.添加冷冻保护剂至步骤b)中获得的所述微生物；和 d.冷冻步骤C)中获得所述微生物；和 e.添加至少一种刺激添加剂至步骤d)中获得的微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)中获得的所述微生物经历冷冻干燥，之后步骤e)中将所述至少一种刺激添加剂添加至所述冷冻干燥的微生物。
3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述刺激添加剂是营养物。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述刺激添加剂是固体。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述刺激添加剂是冷冻形式。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述刺激添加剂是粉末。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述刺激添加剂选自由核碱基、酵母提取物和甲酸或其盐或酯组成的组。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述起子培养物是混合培养物。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述微生物是真菌或细菌。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述细菌是乳酸菌。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括包装所述冷冻培养物组合物的步骤。
12.根据权利要求2-11任一项所述的方法，其特征在于冷冻干燥的微生物和/或添加至冷冻干燥的微生物的刺激添加剂和/或冷冻干燥的起子培养物组合物是经涂覆的。
13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于在冷冻之前，将选自由赋形剂、载体和营养物组成的组的添加剂添加至所述微生物。
14.能通过根据权利要求1-13任一项所述的方法获得的起子培养物组合物，其包括微生物、冷冻保护剂和至少一种刺激添加剂。
15.根据权利要求14所述的起子培养物组合物，其中所述起子培养物组合物是冷冻的。
16.根据权利要求14所述的起子培养物组合物，其中所述起子培养物组合物是冷冻干燥的。
17.试剂盒，其至少包含:含有冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物的包装和含有刺激添加剂的包装。
18.生产培养的食品产品的方法，所述方法包括下述步骤: a.用如权利要求14-17中限定的冷冻的和/或冷冻干燥的培养物组合物和/或用如权利要求18限定的试剂盒接种前体材料， b.用所述冷冻的和/或冷冻干燥的培养物培养所述前体材料，和 c.生产所述培养的食品产品。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述培养的食品产品选自由下述产品组成的组:奶制食品、源自奶制食品的产物、发酵牛奶品、肉制品、蔬菜制品、饮品、葡萄酒制品、烤倍食品和果汁制品。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于所述前体材料是奶制品底物。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述奶制品底物是牛奶。
22.如权利要求14-17中所限定的起子培养物组合物和/或如权利要求18中所述的试剂盒在制造食品或 饲料产品的方法中的用途。
全文摘要
本发明涉及包含微生物的冷冻的和冷冻干燥的起子培养物组合物。本发明也涉及生产冷冻的和冷冻干燥的起子培养物组合物的方法和使用它们的方法。
文档编号A23L1/03GK103249830SQ201180059413
公开日2013年8月14日 申请日期2011年12月8日 优先权日2010年12月10日
发明者皮姆·荷·范 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司