尸胺的制造方法

专利名称：尸胺的制造方法
技术领域：
本发明涉及使用具有尸胺生产能力的棒状菌群来制造尸胺的方法。
背景技术：
尸胺具有二胺结构，别名称为1，5_戊二胺或戊二胺等。近来，尸胺作为聚酰胺的单体原料而受到关注，因此期待大量生产。作为尸胺的制造方法，已知利用棒状菌群的发酵法，具体而言，已知有:通过下述棒状菌群的发酵来制造尸胺的方法，所述棒状菌群具有尸胺生产能力、并且作为尸胺前体物质的赖氨酸的合成能力得到强化(参考专利文献I 4、非专利文献I);或者通过下述棒状菌群的发酵来制造尸胺的方法，所述棒状菌群由于赖氨酸脱羧酶基因的拷贝数增加而使得赖氨酸脱羧酶活性得到强化(参考专利文献5)。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2004-222569号公报专利文献2:日本特开2002-223770号公报专利文献3:W02007/113127 号专利文献4:W02008/101850 号专利文献5:W02008/092720 号非专利文献非专利文献1:Stefaine Kind, Metabolic engineering.(代谢工程)12，341-351，(2010)

发明内容
发明要解决的问题本发明的课题为开发出比利用传统的发酵法制造尸胺的方法更有效且产率更高的尸胺制造工艺。解决问题的手段

本发明人发现，具有生产尸胺的能力、且在pH 5.5以下具有抗性的棒状菌群可用作尸胺生产菌，从而导致本发明的完成。gp，本发明提供了以下(I) (4)。(I) 一种尸胺的制造方法，包括培养具有生产尸胺的能力、且在pH 5.5以下具有抗性的棒状菌群。(2)根据(I)所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有赖氨酸脱羧酶活性。(3)根据(I)或(2)所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群选自由棒状杆菌属和短杆菌属构成的组。(4)根据(I)至(3)中任一项所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有高丝氨酸营养缺陷性和/或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性。
发明的效果根据本发明，与利用传统的发酵法制造尸胺的方法相比，能够更有效且更高产率地制造尸胺。
具体实施例方式如上所述，在本发明的方法中，使用了棒状菌群。棒状菌群为好氧性革兰氏阳性杆菌，传统上被分类为短杆菌属，但是现在也被包括在统一为棒状杆菌属的细菌中(Int.J.Syst.,Bacteriol., (1981) 41，p.225)。另外，包括与棒状杆菌属非常接近的短杆菌属细菌。作为这样的棒状菌群的例子，可以列举出:嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophylum)、醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、解烧棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacteriumcallunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium mellassecola)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)、叉开短杆菌(Brevivacteriumdivaricatum)、黄色短杆菌(Brevivacterium flavum)、7' L- ' /s' ^ r 1J 々 Λ.-1 'y
丨J 才 7 〗9 A (Brevivacterium immariophilum)、乳糖发酵短杆菌(Brevivacteriumlactofermentum)、玫瑰色短杆菌(Brevivacterium roseum)、解糖短杆菌(BrevivacteriumsaccharoIyticum)> 生硫短杆菌(Brevivacterium thiogenitalis)、产 氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、白短杆菌(Brevivacterium album)、寸 > 匕' ；s'
(Brevivacterium cerinum)、嗜氨微杆菌(Microbacterium
ammoniaphilum)。另外，作为各棒状菌群的具体菌株，可以举出:嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806，解烷棒状杆菌ATCC21511，帚石南棒状杆菌ATCC15991，谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13020、ATCC13060，百合花棒杆菌ATCC15990，栖糖蜜棒杆菌ATCC17965，有效棒杆菌AJ12340 (保藏编号:FERMBP_1539)，力士棒杆菌ATCC13868，叉开短杆菌 ATCC14020，黄色短杆菌 ATCC13826、ATCC14067、AJ12418 (保藏编号:FERMBP_2205)，I
匕' K々f丨J々Λ.^ 丨J才7 4 9 A ATCC14068，乳糖发酵短杆菌ATCC13869，玫瑰色短杆菌ATCC13825，解糖短杆菌ATCC14066，生硫短杆菌ATCC19240，产氨棒杆菌ATCC6871、ATCC6872,白短杆菌 ATCC15111，7"r V ^ ^ ^ V ^ ^ ATCC15112，嗜氨微杆菌
ATCC15354。上述棒状菌群可以从(例如)美国典型培养物保藏中心(ATCC)处购买获得。在ATCC中，每个菌株都附带有对应的登记号，该登记号记载在ATCC的目录中，可以参考该登记号购买获得各菌株。在本发明中，作为具有生产尸胺的能力的棒状菌群，优选使用通过从外部导入编码赖氨酸脱羧酶的多核苷酸而具有赖氨酸脱羧酶活性的棒状菌群。只要具有赖氨酸脱羧酶活性，即能够以赖氨酸为原料，通过对其进行脱羧而生产尸胺。赖氨酸脱羧酶优选为L-赖氨酸脱羧酶。另外，关于赖氨酸脱羧酶的来源也没有特别限制，但是优选使用来源于(例如)耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli ;大肠杆菌)、反会月形单胞菌(Selenomonas ruminamtium)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomycespilosus)、侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、卩遼氨基酸真杆菌(Eubacteriumacidaminophilum)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)、或者深海热球菌(Pyrococcus abyssi )的赖氨酸脱羧酶,更优选使用来源于安全性得到确认的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶。这些赖氨酸脱羧酶(有时被称为“LDC”)的氨基酸序列以及对其进行编码的碱基序列登记在数据库(GenBank)中。例如，在本发明中可优选使用的来源于大肠杆菌的LDC基因的碱基序列登记为GenBank Accession N0.M76411。本发明中使用的编码赖氨酸脱羧酶的基因可以根据所使用的棒状菌群的密码子使用频率对核酸序列进行再设计。需要说明的是，如上所述，来源于上述各生物的赖氨酸脱羧酶基因登记在数据库(GenBank)中，以生物名称和赖氨酸脱羧酶作为关键词进行检索即可以容易地得知各LDC基因的喊基序列。作为编码赖氨酸脱羧酶的基因，在具有其功能的范围内，除了上述各生物种类的天然LDC基因之外，还包括在这些LDC基因的各碱基序列中，发生I个或多个碱基的置换、缺失、插入或添加后的多核苷酸。这里，“多个”通常为I至40个的程度，优选I至30个，更优选I至20个，特别优选I至10个，最优选I至5个。另外，作为上述编码赖氨酸脱羧酶的基因，在具有其功能的范围内，可以列举出与构成该基因的多核苷酸或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的多核苷酸。这里，“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指(例如)将选自原来的碱基序列中任意至少20个、优选为25个、更优选为至少30个连续序列中的I个或多个核酸序列作为探针，使用公知的杂交技术(Current Protocols I MolecularBiology edit.Ausbel et al., (1987)Publish.John ffily&Sons Section 6.3-6.4)等进行杂交的核酸序列。此处作为严格条件，例如在50%甲酰胺的存在下，在杂交温度为37°C、作为更加严格的条件为42°C、作为进一步更严格的条件为65°C时，通过用0.1至2倍浓度的SSC溶液(I倍浓度的 SSC溶液的组成:150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)洗涤，由此可实现杂交。另外，作为上述编码赖氨酸脱羧酶的多核苷酸，在具有其功能的范围内，也可以为序列一致性通常在85%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为99%以上的多核苷酸。此处，“序列一致性”是指将进行序列比较的2个碱基序列排列以使两个序列的碱基尽可能多地一致(根据需要插入间隙)，用一致的碱基数除以全部碱基数并以百分率表示的数值。当2个序列的碱基数不同时，除以序列长的一方的碱基数。计算序列一致性的软件是众所周知的，在互联网上免费公开。这样的编码赖氨酸脱羧酶的基因也可以从本来的宿主以外而取得，还可以通过对从本来的宿主得到的基因进行本领域技术人员众所周知的体外突变处理、或者部位特异性突变处理而取得。向棒状菌群导入编码赖氨酸脱羧酶的基因(下面有时也称为“赖氨酸脱羧酶基因”或“LDC基因”，然而如上所述，其并不限于天然的基因)时，赖氨酸脱羧酶基因可以在维持于棒状菌群染色体外的质粒等中得到保持，也可以整合到棒状菌群的染色体中而得到保持。向棒状菌群的染色体中整合赖氨酸脱羧酶基因时，可以利用转座子，通过同源重组或其自身的转移能力而将赖氨酸脱羧酶基因导入棒状菌群的染色体中。需要说明的是，所导入的基因序列的构建或其确认方法可通过本领域技术人员所熟知的分子生物学技术完成，例如可以参考 Sambrook 等的 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork ；DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes I and II(D.N.Glovered.1985)；F.M.Ausubel 等(eds), Current Protocols in Molecular Biology (1994)JohnWilley&Sons, Inc.；PCR Technology: Principles and Application for DNAAmplication, H.Erlich, ed., Stockton Press,等。对上述基因构建体向棒状菌群中的导入方法没有特别限定，例如，可以通过原生质体法(Gene, (1985)，39，ρ.281-286)、电穿孔法(Bio/Technology, (1989)，7，1067-1070)
等导入。需要说明的是，导入外来的LDC基因并具有尸胺产生能力的棒状菌群如(例如)专利文献I所述的那样是公知的(参照下述参考例)。接下来，具体说明在pH 5.5以下具有抗性的棒状菌群。棒状菌群的野生型菌株在pH 5.5以下的BHI琼脂培养基中无法形成菌落，但是对于培养3天后形成菌落的菌株而言，能够判断其为在pH 5.5以下具有抗性的抗性株。需要说明的是，在本发明中，可以优选使用在PH 5.2以下具有抗性的抗性株。作为向棒状菌群赋予pH 5.5以下的抗性的方法，没有特别的限制，例如，只要使母株的染色体产生某种突变即可。向染色体中导入突变的技术有:通过UV、激光等的照射而产生突变的方法；以及使用乙磺酸甲酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)、4-二甲氨基苯重氮磺酸钠(DAPA)等诱变剂的方法等。另外，也可以利用在培养棒状菌群时产生的自然突变。需要说明的是，作为提供具有生产尸胺的能力、且在PH 5.5以下具有抗性的棒状菌群的方法，可以向具有生产尸胺的能力的棒状菌群赋予所述抗性，另外，也可以向已赋予了此抗性的棒状菌群以上述方式赋予 生产尸胺的能力。需要说明的是，上述突变诱发处理在微生物的突变诱发处理中所采用的公知条件下进行即可，例如，UV照射时，照射量取决于与光源的距离，然而通常进行10秒 30分钟的照射。另外，在用上述NTG等各种诱变剂进行处理时，处理浓度为(例如)100 μ g/ml 2 μ g/ml,优选为300 μ g/ml 1.3 μ g/ml,可以通过(例如)在此浓度的培养液中培养12小时 48小时来进行处理。在这种突变诱发处理后，在pH 5.5以下的BHI琼脂培养基上进行培养，并通过对形成了菌落的菌株进行筛选，由此能够获得在PH 5.5以下具有抗性的棒状菌群。需要说明的是，如以下实施例中具体描述的那样，由通过NTG处理而得到多个已获得了在pH 5.5以下的抗性的菌株可以得知，通过突变诱发处理，可以再现性地制作出在PH 5.5以下具有抗性的抗性株。另外，本发明中使用的棒状菌群优选为赖氨酸合成能力得到提高的突变株。作为赖氨酸合成能力得到提高的突变株，例如，可以利用解除了因L-赖氨酸或L-苏氨酸引起的反馈抑制的突变株。作为这些突变株的获得方法，例如，可以列举如下方法:对野生型菌株实施与上述例子相同的突变操作后，以S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性为指标进行选择，从成为具有L-赖氨酸生产性的突变株而获得的方法(参考专利文献I)。需要说明的是，如专利文献I所述，是否具有AEC抗性可以通过在含有50 μ g/ml AEC的基本琼脂培养基上于30°C培养24小时后是否发生增殖来进行判断。
或者，作为向野生型菌株赋予AEC抗性的更优选方法，有使用了基因工程技术的方法。对使用了基因工程技术的方法没有特别的限制，有(例如)使用了在棒状菌群中可以复制的重组DNA的方法，或者通过同源重组使染色体中的靶基因重组的方法。例如，可以通过具有突变型天冬氨酸激酶基因(有时被称为“脱敏型AK基因”)而获得S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性，该突变型天冬氨酸激酶基因是序列号14中所记载的氨基酸序列中的第311位的氨基酸残基被Thr以外的氨基酸置换而得到的。更优选的基因工程技术为通过将棒状菌群的染色体中的AK基因同源重组为脱敏型AK基因而重组的方法。另外，关于脱敏型AK基因，可以利用向AK基因中导入所需突变的众所周知的技术方法(例如定点突变)，相应的试剂盒也在市场上有售。另外，作为赖氨酸合成能力得到提高的突变株，除了 AEC抗性突变株之外，还可列举高丝氨酸营养缺陷型突变株。野生型菌株不具有高丝氨酸营养缺陷性，但是作为获得高丝氨酸营养缺陷型菌株的方法，可以列举这样的方法:与上述例子相同，例如，对野生型菌株实施突变操作后，以高丝氨酸营养缺陷性为指标进行选择，由成为具有L-赖氨酸生产性的突变株而获得的方法；或者通过基因工程技术使棒状菌群的高丝氨酸脱氢酶活性丧失的方法(专利文献I)。另外，作为向野生型菌株赋予高丝氨酸营养缺陷性的更优选方法，可以列举通过同源重组向染色体中的高丝氨酸脱氢酶基因(以下简称为HOM基因)中插入其它基因的方法等，由此使高丝氨酸脱氢酶活性丧失的方法。对所述其它基因没有特别的限制。优选为LDC基因，更优选在野生型菌株中LDC基因能够组成性表达的启动子和基因盒。在本发明中，通过对所述具有尸胺生产能力、且对2，2_硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群进行培养来制造尸胺。作为培养方法，可以使用分批培养、流加培养或连续培养。在连续培养时，优选通过(例如)日本特开2008-104453号公报中所记载的公知方法进行连续培养。作为用于制造尸胺的培养用培养基，可以使用含有可同化的碳源和氮源及无机盐类等的普通的营养培养基·。作为碳源，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解产物等糖类，乙醇等醇类，醋酸、乳酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨，氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机和有机铵盐类，尿素，其它含氮化合物，以及肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、大豆水解产物等含氮有机物。作为无机盐，可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、碳酸钙等。此外，根据需要，可以添加生物素、硫胺素、维生素B6等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸等培养基添加物来替代。另外，也可以向培养用培养基中预先添加作为尸胺前体的赖氨酸。若向培养用培养基中预先添加赖氨酸，则棒状菌群将赖氨酸摄入菌体内，赖氨酸脱羧酶以赖氨酸为基质将其转变为尸胺，因此能够提高尸胺的制造效率。向培养用培养基中预先添加赖氨酸时，作为培养用培养基中的赖氨酸浓度，并没有特别的限制，但是优选不会对棒状菌群的增殖造成恶劣影响、且不会对赖氨酸脱羧酶造成阻碍的浓度，具体而言优选为0.0lM至2M。所添加的赖氨酸优选为L-赖氨酸。另外，所添加的赖氨酸可以为游离体，也可以为赖氨酸盐，但优选赖氨酸盐，作为赖氨酸盐，优选赖氨酸盐酸盐或来源于下述二羧酸的赖氨酸.二羧酸盐，作为更优选的具体例子，可以举出赖氨酸.己二酸盐、赖氨酸.癸二酸盐、赖氨酸.1，12-十二烷二羧酸盐、赖氨酸 琥珀酸盐、赖氨酸.间苯二甲酸盐、赖氨酸 对苯二甲酸盐，作为更优选的具体例子，可以举出赖氨酸.己二酸盐。对培养条件没有特别的限制，在振荡培养、深部通气搅拌培养等好氧条件下进行培养。培养温度一般为25°C至42°C，优选为28°C至38°C。培养时间通常为I天至6天。对于培养pH的调节，调节为碱性时优选使用氨，调节为酸性时优选使用盐酸或二羧酸，更优选使用二羧酸。使用这些中和剂将培养PH调节到5至8，优选最好控制在pH 6.5至7.5。此外，对中和剂的状态并没有限制，以气体、液体、固体或水溶液形式使用。特别优选水溶液。对优选用作中和剂的二羧酸没有特别限定，但是优选的是，除了上述2个羧基以夕卜，实质上不存在其它官能团的二羧酸。这里所说的官能团为在聚酰胺聚合反应(作为反应条件，例如，反应温度250至270°C，压力10至20kg/cm2，反应时间I至5小时)时，与氨基或羧基等反应，造成聚合物的分支、或使聚合物的结晶度下降(结晶度80%以下)的反应基团，例如，氨基或羧基就符合该官能团，除此以外，酸性基团(磺酸基、磷酸基、酚羟基等)、碱性基团(肼基等)、质子极性基(羟基等)、具有断裂性的基团(环氧基、过氧化基等)或者其它反应性高的基团(异氰酸根基)也符合该官能团。另一方面，卤素取代基、芳香性取代基、醚基、酯基、酰胺基等反应性低，不符合这里所说的官能团。作为二羧酸，更优选的是由下列通式(I)、(2)或(3)所表示的二羧酸。 HOOC- (CH2) m-C00H (I)(通式(I)中，m=0至 16)。[化学式I]`
权利要求
1.一种尸胺的制造方法，包括培养具有生产尸胺的能力、且在pH 5.5以下具有抗性的棒状菌群。
2.根据权利要求1所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有赖氨酸脱羧酶活性。
3.根据权利要求1或2所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群选自由棒状杆菌属和短杆菌属构成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有高丝氨酸营养缺陷性和/或S-(2-氨乙基)-L`-半胱氨酸抗性。
全文摘要
本发明公开了一种与利用传统的发酵法的制造方法相比，可以更有效且产率更高地制造尸胺的新型尸胺制造方法。所述尸胺的制造方法包括培养具有生产尸胺的能力、且在pH 5.5以下具有抗性的棒状菌群。优选所述棒状菌群具有赖氨酸脱羧酶活性，另外，优选所述棒状菌群具有高丝氨酸营养缺陷性和/或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性。
文档编号C12N15/09GK103249839SQ201180059401
公开日2013年8月14日 申请日期2011年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者佐佐木七生, 耳塚孝, 泽井秀树, 泽井健司 申请人:东丽株式会社