专利名称：用于生产l-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及用于生产L-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法。
背景技术：
L-2-氨基丁酸(L(+)-2_Aminobutyric acid),是一种非天然的手性α -氨基酸，分子式为C4H9NO2，主要用于合成治疗局限性及继发性全身性癫痫的疾病，同时也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇的关键手性前体。转氨酶法是目前广泛应用的生产L-2-氨基丁酸的方法。早期采用酮酸和谷氨酸为底物，在氨基酸转氨酶的作用下生成L-2-氨基丁酸，该法收率较低；后采用L-苏氨酸为原料，采用三酶体系制备L-2-氨基丁酸，该法产率低且有副产物影响产品的纯化；氨基酸氧化酶法是使用D-氨基酸氧化酶在金属催化剂的作用下制备L-2-氨基丁酸，该法成本高，不适合大规模工业应用。此外还有脱氢酶法、氨基酰化酶法等，但是存在生产成本过高以及酶活受到底物抑制的问题，因此工业应用效果不佳。因此本领域迫切需要开发高效经济的L-2-氨基丁酸的生产方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于构建发酵生产L-2-氨基丁酸的重组载体。本发明的另一目的在于提供一种用于发酵生产L-2-氨基丁酸的基因工程菌株。本发明的另一目的在于提供一种生产L-2-氨基丁酸的方法。本发明另一目的在于提供前述载体、工程菌株和生产方法的用途。在本发明的第一方面，提供了一种重组载体，所述重组载体具有编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列和编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列。在另一优选例中，编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列选自下组:大肠杆菌来源的ilvA基因、大肠杆菌来源的TdcB基因、芽孢杆菌来源的ilvAbs基因、鼠伤寒沙门氏菌来源的苏氨酸脱氨酶基因、或拟南芥来源的苏氨酸脱氨酶基因。在另一优选例中，编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列为:大肠杆菌来源的ilvA基因或大肠杆菌来源的TdcB基因。在另一优选例中，所述的L-氨基酸脱氢酶选自下组:L_亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-缬氨酸脱氢酶、L-苯丙氨酸脱氢酶。在另一优选例中，编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列选自下组:芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶编码基因、古球菌来源的L-丙氨 酸脱氢酶编码基因、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶编码基因、嗜热放线菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶编码基因，或芽孢杆菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶编码基因。
在另一优选例中，编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列为:芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因，嗜热芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因，或链霉菌来源的缬氨酸脱氢酶基因。在另一优选例中，所述的重组载体从5’端到3’端依次具有:第一启动子、苏氨酸脱氨酶编码序列和第一终止子、L-氨基酸脱氢酶编码序列和第二终止子。在另一优选例中，所述的重组载体从5’端到3’端依次具有:第一启动子、苏氨酸脱氨酶ilvA编码序列和第一终止子、L-亮氨酸脱氢酶基因IeuDH编码序列和第二终止子。在另一优选例中，苏氨酸脱氨酶ilvA编码序列来源于大肠杆菌W3110。在另一优选例中，L-亮氨酸脱氢酶基因IeuDH编码序列来源于芽孢杆菌BacillusCereus0在另一优选例中，所述的重组载体为pSUGAP-1lvA-leuDH，pSUGAP-1euDH-1IvA,pSUGAP-1lvA-BSleuDH, pSUGAP-Vdh-1IvA, pSUGAP-TdcB-leuDH， pSUGAP-TdcB-BSleuDH，或pSUGAP-Vdh-tdcBo在本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第一方面所述的载体或基因组中整合有本发明第一方面任一所述的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，较佳地为大肠杆菌细胞。在另一优选例中，所述的大肠杆菌是高表达苏氨酸的大肠杆菌。在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有选自下组的至少一个特征:(I)天冬氨酸激酶I基因thrA的1034位碱基发生C — T突变；(2)天冬氨酸激酶III基因IysC的1055位碱基发生C — T突变；(3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc启动子为trc启动子；(4)乙酰-CoA合成酶基因acs启动子为trc启动子；(5)选自下组的至少一个基因失活或敲除:二氨基庚二酸盐脱羧酶基因lysA、高丝氨酸琥珀酰转移酶基因metA、苏氨酸脱氢酶基因tdh、苏氨酸转运酶基因tdcC和调控基因 iclR。在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌THR。在本发明的第三方面，提供了本发明第二方面所述的宿主细胞在制备L-2-氨基丁酸中的用途。在本发明的第四方面，提供了一种生产L-2-氨基丁酸的方法，包括步骤:(i)在合适的培养条件下，培养本发明第二方面所述的宿主细胞；和(ii)从(i)的培养物中分离出所述的L-2-氨基丁酸。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1为酶切回收PSU27 18的电泳结果。
图2为PCR得到的GAP片段的电泳结果。图3为pSUGAP、pET28b_ilvA和pET28b_leuDH双酶切电泳检测结果，其中泳道I为 pET28b-1lvA、泳道 2 为 pET28b_leuDH、泳道 3 为 pSUGAP。图4为pSUGAP-1lvA和pSUGAP_leuDH的双酶切电泳检测结果，其中，泳道I和2为 pSUGAP-1lvA 1-2、泳道 3-7 为 pSUGAP-leuDH 1-5。图5为pSUGAP-1lvA和pSUGAP-leuDH分别用Bgl II和BamH I双酶切电泳检测结果，泳道I为pSUGAP-1lvA用Bgl II单酶切，泳道2为pSUGAP-1lvA用BamH I酶切，泳道 3 为 pSUGAP-leuDH 用 Bgl II 单酶切，泳道 4 为 pSUGAP-leuDH 用 BamH I 酶切。图6为pSUGAP-1IvA-1euDH的Sal I酶切电泳检测结果，其中SM为Specialmarker，包括 2354bp, 1703bp 和 1151bp ;泳道 1-6 为 pSUGAP-1IvA-1euDH 1-6。图7为pSUGAP-leuDH-1lvA的Xho I/BamH I双酶切电泳检测结果，泳道1-4为pSUGAP-leuDH-1lvA 1-4。图8为pSUGAP-leuDH-1lvA的HindIII酶切电泳检测结果，其中，泳道1-3为pSUGAP-leuDH-1lvA 1-3 ；SM 为 Special marker，包括 2354bp、1703bp 和 1151bp。图9为携带IeuDH和ilvA的克隆子THR/pSUGAP的鉴定结果，其中，图9a为THR/pSUGAP-leuDH-1lvA克隆子鉴定结果；泳道I为pSUGAP-leuDH-1lvA、泳道8为THR、泳道9-13 为 THR/pSUGAP-leuDH-1lvA 1-5 ;图 9b 为 THR/pSUGAP-1IvA-1euDH 克隆子鉴定结果，泳道 4-6 为 THR/pSUGAP-1lvA-leuDHl-3 ;泳道 7 为 pSUGAP-1euDH-1IvA ;泳道 9 为 THR。图10为THR/pSUGAP-TdcB-leuDH克隆子鉴定结果；其中，泳道I为pSUGAP-TdcB-leuDH,泳道 2-3 为 THR/pSUGAP-TdcB-leuDH 1-2,泳道 4 为 THR。图11为pSUGAP的质粒图谱。图12为pSUGAP-leuDH的质粒图谱。图13 为 pSUGAP-1lvA 质粒图谱。图14 为 pSUGAP-1IvA-1euDH 质粒图谱。图15 为 pSUGAP-leuDH-1lvA 质粒图谱。图16 为 pSUGAP-BSleuDH 质粒图谱。图17 为 pSUGAP-1IvA-BSleuDH 质粒图谱。图18 为 pSUGAP-Vdh 质粒图谱。图19 为 pSUGAP-Vdh-1lvA 质粒图谱。图20为pET24a_TdcB的质粒图谱。图21 为 pSUGAP-TdcB-leuDH 的质粒图谱。图22 为 pSUGAP-TdcB-BSleuDH 质粒图谱。图23 为 pSUGAP-TdcB 质粒图谱。图24 为 pSUGAP-Vdh-TdcB 质粒图谱。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次构建了包含苏氨酸脱氨酶编码基因和L-氨基酸脱氢酶编码基因的重组 载体，将该重组载体转化宿主菌，获得生产工程菌株，以葡萄糖为原料，通过发酵培养本发明构建的基因工程菌株而得到L-2-氨基丁酸。本发明方法成本低，产物浓度高，没有副产物影响，产物易于纯化，非常适于工业应用。术语载体的构建本技术领域人员可方便地用各种已知方法构建载体，包括具有编码苏氨酸脱氨酶的序列和L-氨基酸脱氢酶编码基因的载体，以及与之操作性相连的调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体，根据已知空载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组载体。在本方面的一个优选例中，构建的载体见表I。表I
权利要求
1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体具有编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列和编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列选自下组: 大肠杆菌来源的iIvA基因、大肠杆菌来源的TdcB基因、芽孢杆菌来源的iIvAbs基因、鼠伤寒沙门氏菌来源的苏氨酸脱氨酶基因、或拟南芥来源的苏氨酸脱氨酶基因。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列为:大肠杆菌来源的ilvA基因或大肠杆菌来源的TdcB基因。
4.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，编码L-氨基酸脱氢酶的多核苷酸序列选自下组: 芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶编码基因、古球菌来源的L-丙氨酸脱氢酶编码基因、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶编码基因、嗜热放线菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶编码基因、嗜热芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因、或芽孢杆菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶编码基因。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，编码L-氨基酸脱氢酶的多核酸序列选自下组: 芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因，嗜热芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶编码基因，或链霉菌来源的缬氨酸脱氢酶基因。
6.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体从5’端到3’端依次具有:第一启动子、苏氨酸脱氨酶编码序列和第一终止子、L-氨基酸脱氢酶编码序列和第二终止子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求1-6任一所述的载体或基因组中整合有权利要求1-6任一所述的多核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的染色体具有选自下组的至少一个特征: (1)天冬氨酸激酶I基因thrA的1034位碱基发生C— T突变； (2)天冬氨酸激酶III基因IysC的1055位碱基发生C— T突变； (3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc启动子为trc启动子； (4)乙酰-CoA合成酶基因acs启动子为trc启动子； (5)选自下组的至少一个基因失活或敲除:二氨基庚二酸盐脱羧酶基因lysA、高丝氨酸琥珀酰转移酶基因metA、苏氨酸脱氢酶基因tdh、苏氨酸转运酶基因tdcC和调控基因iclRo
9.权利要求7-8任一所述的宿主细胞在制备L-2-氨基丁酸中的用途。
10.一种生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步骤: (i)在合适的培养条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；和 ( )从Q)的培养物中分离出所述的L-2-氨基丁酸。
全文摘要
本发明涉及用于生产L-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法。具体地，本发明涉及的重组载体包含苏氨酸脱氨酶编码基因和L-氨基酸脱氢酶编码基因以及合适的载体片段；本发明的基因工程菌株，是使用本发明提供的重组载体转化宿主菌得到；生产L-2-氨基丁酸的方法是通过发酵培养本发明提供的基因工程菌而获得的。本发明以葡萄糖为原料，通过发酵培养本发明构建的基因工程菌株而得到L-2-氨基丁酸。本发明方法成本低，产物浓度高，没有副产物影响，产物易于纯化，非常适于工业应用。
文档编号C12N5/10GK103215291SQ201210015308
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者杨晟, 陶荣盛, 朱傅赟, 赵丽丽, 蒋宇, 杨俊杰, 孙周通, 沈正权, 黄鹤, 孙梁栋, 董枫, 刘映淼 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心, 上海工业生物技术研发中心