专利名称：一种氧化型辅酶i的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化型辅酶I的制备方法。
背景技术：
在目前所有发现的酶中，约有30-35%为氧化还原酶。在工业生物技术，特别是生物药物和精细化工行业中，氧化还原酶是最重要的酶类。在氧化还原酶所催化的反应中，生成产物的同时皆需要消耗一定的辅酶以进行电子和质子的转移。据统计，约80%的反应需要以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即氧化型辅酶I (简称NAD+，结构式参见式I)作为辅酶，约10% 的反应需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸即氧化型辅酶II (简称NADP+)作为辅酶，只有少量反应需要黄素(FAD、FMN)和辅酶Q(PQQ)作为辅酶。虽然添加复杂的辅酶再生体系使得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即氧化型辅酶I (NAD+)的需求量降低，但是由于其体系中辅酶转化数的限制，仍必须添加一定的辅酶才能保证氧化还原反应的顺利进行。可见，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即氧化型辅酶I (NAD+)具有广泛的用途和巨大的需求量，其重要性随着绿色化学工业的发展将会不断增加。目前工业中大量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸产品主要为从酵母中提取分离获得。该过程虽然工艺成熟，但是耗费能源和材料巨大，产品昂贵，限制了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产和其后续应用过程的开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的氧化型辅酶I 的制备方法。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案
一种氧化型辅酶I的制备方法，该方法使烟酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二钠盐 (ATP-Na2)在pH为5. (Γ8. O的缓冲溶液中，在烟酰胺核苷激酶(NRK)的催化作用下以及二价金属离子存在下，在温度30°C 40°C下反应得到氧化型辅酶I (NAD+)。根据本发明，所述的缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液或TEA缓冲溶液等。缓冲溶液的浓度一般为100 500 mM，优选为100 200禮。根据本发明的一个方面，所述反应开始时，所述的烟酰胺核苷和三磷酸腺苷二钠盐的浓度分别为5 50 mg/ml和1(T50 mg/ml。所述的烟酰胺核苷激酶以冻干粉形式加入， 且加入量为5"10 mg酶粉/ml缓冲溶液。优选地,加入量为5mg酶粉/ml缓冲溶液。根据本发明的一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下取一反应容器，加入缓冲溶液后，依次加入烟酰胺核苷、三磷酸腺苷二钠盐以及烟酰胺核苷激酶以及所述二价金属离子的盐，控制温度30°C 40°C，搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，至检测到三磷酸腺苷消耗完毕，停止反应。根据本发明，所述二价金属离子优选为镁离子或锰离子。特别优选地，所述二价金属离子优选为镁离子，含有二价金属离子的盐为氯化镁。
根据本发明的进一步实施方案停止反应后，依次经过滤，大孔树脂例如HZ-818 型大孔吸附树脂吸附，冻干处理获得所述氧化型辅酶I。根据本发明，原料烟酰胺核苷和烟酰胺核苷激酶可根据已知文献方法制备得到， 三磷酸腺苷二钠盐和其他原材料可商购获得，来源广泛。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点
本发明是一种利用微生物酶在温和条件下高效制备烟酰胺核糖二核苷酸即氧化型辅酶I的方法。与已存在的从酵母中分离提取的方法相比，本方法避免了传统方法的高能耗， 高原材料消耗和产物价格昂贵等缺点，具备酶催化过程所特有的反应条件温和、立体专一性强、催化效率高等特点，尤其是针对该反应的动力学特点，用一种酶一锅法催化两步偶联反应，简单有效，获得了较高的转化率(反应以底物ATP计算的转化率为8(Γ100%)。此外，本发明方法使用烟酰胺核苷激酶为催化剂，廉价易得。综合以上特点，本发明方法具备良好的产业化应用前景。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例I
在20 mL三口烧瓶中加入10 mL Tris-HCl缓冲溶液(100 mM,pH为I. 5)，依次加入烟酰胺核苷O； Med. Chem. 2007，见，份姑-6必7 ) 50 mg，三磷酸腺苷二钠盐55 mg，烟酰胺核苷激酶 iPLoS Biology, 2007, 5(10), 2220-2230) 10 mg,氯化镁 20 mM，于 37°C下，200 rpm搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，经过6小时反应后，检测三磷酸腺苷已经消耗完毕，停止反应。通过进一步的过滤，HZ-818型大孔树脂吸附，冻干，乙醇和水重结晶即可获得氧化型辅酶I产品，收率70%。实施例2
在20 mL三口烧瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲溶液(100 mM, pH为5. 8)，依次加入烟酰胺核苷U Med. Chem. 2007，邠，份姑-6必7 ) 50 mg，三磷酸腺苷二钠盐55 mg，烟酰胺核苷激酶OdZo夕沿2007，5(10),之如)5 mg，氯化锰20 mM，于37°C下，200 rpm 搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，经过10小时反应后，检测三磷酸腺苷已经消耗完毕，停止反应。通过进一步的过滤，AB-8型大孔树脂吸附，冻干，乙醇和水重结晶即可获得氧化型辅酶I产品，收率52%。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于该方法使烟酰胺核苷和三磷酸腺苷二钠盐在PH为5. (Γ8. O的缓冲溶液中，在烟酰胺核苷激酶的催化作用下以及二价金属离子存在下，在温度30°C 40°C下反应得到氧化型辅酶I。
2.根据权利要求I所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液或TEA缓冲溶液。
3.根据权利要求I所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液的浓度为100 500 mMo
4.根据权利要求I所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述反应开始时，所述的烟酰胺核苷和三磷酸腺苷二钠盐的浓度分别为5 50 mg/ml和1(T50 mg/ml。
5.根据权利要求I至4中任一项权利要求所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述的烟酰胺核苷激酶以冻干粉形式加入，且加入量为5 10mg酶粉/ml缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述的烟酰胺核苷激酶以冻干粉形式加入，且加入量为5mg酶粉/ml缓冲溶液。
7.根据权利要求I所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述制备方法的实施过程如下取一反应容器，加入缓冲溶液后，依次加入烟酰胺核苷、三磷酸腺苷二钠盐以及烟酰胺核苷激酶以及所述二价金属离子的盐，控制温度30°C 40°C，搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，至检测到三磷酸腺苷消耗完毕，停止反应。
8.根据权利要求7所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述二价金属离子为镁离子或锰离子。
9.根据权利要求8所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于所述含有二价金属离子的盐为氯化镁或氯化锰。
10.根据权利要求7所述的氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于停止反应后，依次经过滤，大孔树脂吸附，冻干处理获得所述氧化型辅酶。
全文摘要
本发明涉及一种氧化型辅酶I的制备方法，该方法使烟酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP-Na2)在pH为5.0~8.0的缓冲溶液中，在烟酰胺核苷激酶(NRK)的催化作用下以及二价金属离子存在下，在温度30℃~40℃下反应得到氧化型辅酶I(NAD+)。本发明采用生物催化的方法，利用烟酰胺核苷激酶一锅法制备氧化型辅酶，反应体系简单，条件温和，具备良好的产业化应用前景。
文档编号C12P19/32GK102605026SQ20121005623
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者庄季昌, 李斌, 梁晓亮, 陶军华, 鞠鑫 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司