专利名称：一种检测p52<sup>Shc</sup>/p66<sup>Shc</sup>基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，涉及核酸的检测试剂及其在肿瘤诊断分型和预后中的应用，尤其是一种检测p52shVp66shc；基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用。
背景技术：
近年来恶性肿瘤患者人数逐渐增加，已成为临床上导致患者死亡的主要因素之一。肿瘤标志物(Tumor Marker TM)在肿 瘤普查、诊断、判断预后、评价治疗疗效和高危人群随访等方面都具有较大的实用价值，是目前肿瘤学研究的关键问题之一。目前已经应用于临床的肿瘤标志物有甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等多种，但总体来说还是不够完善，临床仍然迫切要求更多更好的肿瘤标志物和检测试剂盒的发现/发明和临床应用。最新研究表明，肿瘤转移抑制基因p66shc；的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关，在正常体细胞中P66shc;稳定表达，而在肿瘤细胞中p66shc;表达失活，导致细胞绕过失巢凋亡途径，促进肿瘤的转移。小鼠实验证明，p66shc;是人体内一个重要的肿瘤转移抑制基因，该基因的表达失活大大促进了肿瘤的转移。因此，p66shc的表达水平可以成为一个潜在的、具有临床应用前景的肿瘤标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测p52shVp66shc；基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用，本试剂盒具有灵敏度高、成本低、检测方法简便、快速的优点。本发明的目的是这样实现的一种检测P52shVp66she基因表达模式的分子诊断试剂盒，试剂盒由RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和PCR反应体系组成，其中PCR反应体系含有特异扩增p52shc;基因的引物的序列为序列I和序列2 ;含有特异扩增p66shc;基因的引物的序列为序列3和序列4。而且，所述RNA抽提体系具体包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75 %乙醇和Nuclease-Free Water。而且，所述RNA逆转录反应体系具体包括oligo(dT)18、dNTP Mix,5XReverseTranscript Reaction Buffer、Nuclease-Free Water 和 Reverse Transcriptase。而且，所述PCR 反应体系具体包括Nuclease-Free Water、dNTP MixUOXPCRReaction Buffer、DNA聚合酶、引物序列I、引物序列2、引物序列3和引物序列4。一种检测P52shVp66she基因表达模式的分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于步骤如下(I)从临床获得实体肿瘤患者手术后的新鲜肿瘤样本，用RNA抽提体系提取样本的总RNA ；(2)使用RNA逆转录反应体系将该总RNA经逆转录反应转变为cDNA ；(3)以该cDNA为模板，用PCR反应体系通过PCR反应分别特异扩增p52she和p66she基因的目标DNA片段，将PCR产物送到生物技术公司测序；
(4)分析该PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图，计算p66she单等位基因表达模式的丢失程度，对肿瘤患者病理分型和预后作出判断。而且，所述步骤⑷将p52she基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为Xl和yl ;将p66shc;基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分,得到数值分别为x2和y2 ;根据下列公式计算p66shc;单等位基因表达模式丢失程度值LOM，根据表I判断患者的病理分期和预后，公式为
权利要求
1.一种检测p52shVp66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒，其特征在于试剂盒由RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系和PCR反应体系组成，其中PCR反应体系含有特异扩增p52shc;基因的引物的序列为序列I和序列2 ;含有特异扩增p66shc:基因的引物的序列为序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的检测p52sh7p66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒，其特征在于所述RNA抽提体系具体包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75%こ醇和Nuclease-FreeWater。
3.根据权利要求I所述的检测p52sh7p66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒，其特征在于所述RNA逆转录反应体系具体包括oligo (dT) 18、dNTP Mix、5 X Reverse TranscriptReaction Buffer、Nuclease—Free Water 和 Reverse Transcriptase。
4.根据权利要求I所述的检测p52sh7p66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒，其特征在于所述 PCR 反应体系具体包括Nuclease-Free Water > dNTP Mix、10XPCR ReactionBuffer、DNA聚合酶、引物序列I、引物序列2、引物序列3和引物序列4。
5.一种如权利要求I所述的检测p52shVp66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在干步骤如下 (1)从临床获得实体肿瘤患者手术后的新鮮肿瘤样本，用RNA抽提体系提取样本的总RNA ； (2)使用RNA逆转录反应体系将该总RNA经逆转录反应转变为cDNA； (3)以该cDNA为模板，用PCR反应体系通过PCR反应分别特异扩增p52sh。和p66sh。基因的目标DNA片段，将PCR产物送到生物技术公司测序； (4)分析该PCR产物在SNPrs8191981位点的测序峰图，计算p66she单等位基因表达模式的丢失程度，对肿瘤患者病理分型和预后作出判断。
6.根据权利要求5所述的检测p52shVp66she基因表达模式的分子诊断试剂盒的检测方法，其特征在于所述步骤(4)将p52she基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为Xl和yl ;将p66shc基因PCR产物在SNP rs8191981位点的测序峰图中C和T碱基下的峰面积通过方格法进行积分，得到数值分别为x2和y2 ;根据下列公式计算p66shc;单等位基因表达模式丢失程度值LOMjS据表I判断患者的病理分期和预后，公式为 xl-yl I χ2-γζ LOM = I-^2 公式lp66she单等位基因表达模式丢失程度值LOM计算公式 肿瘤患者P66shc;单等位基因表达模式丢失程度值LOM与病理分期和预后的关系表 LOM病理分期~ 预后 O 25%I优 25% 50% II良 50% 75% III中
7.—种如权利要求I所述的检测p52shVp66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的病理分型中的应用。
8.权利要求7所述的检测p52shVp66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的诊断分型中的应用，其特征在于所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。
9.一种如权利要求I中所述的检测？52^如661基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的预后中的应用。
10.权利要求9所述的检测p52sh7p66shc;基因表达模式的分子诊断试剂盒在实体肿瘤的诊断分型中的应用，其特征在于所述实体肿瘤为通过临床检查或触诊扪及到的有形肿块的肿瘤。
全文摘要
本发明涉及一种检测p52Shc/p66Shc基因表达模式的分子诊断试剂盒及其检测方法及应用，试剂盒由RNA抽提体系、RNA逆转录反应体系、PCR反应体系组成，其中所述PCR反应体系含有特异扩增p52Shc基因的引物序列为序列1和序列2；含有特异扩增p66Shc基因的引物序列为序列3和序列4。本发明的试剂盒对实体肿瘤患者的临床术后标本进行分析，根据其p52Shc/p66Shc基因表达模式，可判断患者的病理分型和预后。本试剂盒具有判断准确性好、灵敏度高、使用成本低和适用范围广等优点。
文档编号C12Q1/68GK102618640SQ201210066328
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者刘喆, 李西川, 马振毅 申请人:天津医科大学