专利名称：预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及ー种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。ニ背景技术：
乳房炎是奶牛和奶山羊养殖中危害最严重的疫病，通常导致产奶量下降和乳制品质量下降。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌是造成乳房感染，引起临床和隐性乳房炎的主要致病菌，抗生素治疗乳房炎副作用很多；
传统的乳房炎疫苗多为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用，然而随着大規模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒カ返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与 免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。
发明内容
本发明的目的在于提供预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用，亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是ー种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤I)金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2)重组蛋白与转移因子佐剂的混合。上述步骤包括将ClfA、Hla及Sbi三种蛋白的功能区通过原核表达并纯化，制成多价亚单位疫苗，且ClfA的A区、Sbi的I - IV区为配体结合区。步骤I)中包括①设计引物必制备模板；(D PCR扩增与回收目的基因；(D目的基因的原核表达与纯化。上述步骤包括
①设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点
序列ClfA Genbank No. AB245457. I Hla Genbank No. AY449760. I Sbi Genbank No. AB050860. I
Hl: 5’ -CG^MIZ^3CAGATTCTGA-3’EcoRl
H2: 5' -GCCTtK^TTAATTTGTCAT -3’Xhol
Cl: 5，-CGfiMZZtPTAGCTGCAGAT-S'EcoRl
C2: 5’-CCG^^CTCATCAGGTTGTTCAGG-3，Xhol
SI: 5，-CG^MZZ^SATCAACAAAAAGCTT-3，EcoRl
S2: 5’-CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT-3’XhoI②制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37°C温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37°C摇床中培养过夜，取I mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，_20°C保存备用。③PCR扩增与回收目的基因
(1)扩增目的基因hla
反应体系(50 iiL):超纯水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, H1/H2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀；
PCR程序预变性94°C 5 min ;进入循环变性94°C 30 s，退火56°C 30 s，延伸72°CI. 5 min，共30个循环；最终延伸72°C 10 min ；
(2)扩增目的基因ClfA的A区
反应体系(50ii L):超纯水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, C1/C2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀；
PCR程序预变性94°C 5 min ;进入循环变性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°C
I.5 min，共30个循环；最终延伸72°C 10 min ；
(3)扩增目的基因Sbi的I,IIJILIVg
反应体系(50ii L):超纯水 32 u L, IOXTaq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4u L, MgC124uL, S1/S2各I ii L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀；
PCR程序预变性94 °C 5min ;进入循环变性94°C 30s，退火52°C 30s，延伸72°Clmin，共30个循环；最终延伸72°C IOmin ；
(4)回收PCR扩增产物
目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化こ锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用，_20°C保存备用；
④目的基因的原核表达与纯化
(1)表达载体的构建
分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切；
酶切体系(40 L):PCR 产物或 pET32a 载体 32 L，10XH Buffer 4 L, EcoRI / XhoI各 2 L ；
混匀后置于37°C水浴反应2 3h，目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16で过夜连接，得到重组质粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，产物4°C保存；
连接反应体系T4 Ligase Buffer 1 L，目的片段酶切产物6. 5 L，pET32a载体酶切产物 I. 5 L, T4 DNA Ligasel L ；
将连接产物转化入感受态细胞BL21 (DE3)，在Amp+平板上37°C培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；
(2)重组质粒的诱导表达
将上步筛选出的阳性重组菌按1:100接种到含氨苄的LB培养基中，转速为220r/min、37°C震荡培养至0D600=0.8 1.0时，加入IPTG诱导目的蛋白，诱导条件分别如下 pET-Hla IPTG 终浓度为 0. 5mmol/L, 37°C, 6h ； pET-CA IPTG 终浓度为 0. 5mmol/L，37°C，2h ； pET-Sbi IPTG 终浓度为 0. 5mmol/L, 37°C, 4h ；
表达产物用SDS-PAGE电泳检测；
(3)目的蛋白的纯化
收集诱导后的菌体，用PBS(pH7. 4)洗涤2次后重悬，冰上超声裂解细菌，至样品不再黏稠，裂解物12000r/min，4°C离心5min，收集上清，用镍柱纯化法纯化上清，得到目的蛋白，纯化产物用SDS-PAGE电泳检测。步骤2)的混合过程为将纯化得到的Hla蛋白在60°C水浴条件下处理30min，然后将Hla、CA、Sbi三种蛋白用pH7. 4的PBS稀释混合均匀，使各蛋白终浓度相同，再与转移 因子佐剂等体积混匀。上述亚单位疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下乳房炎亚单位疫苗即利用致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉，且省时省力具有显著疗效的新型疫苗。四
图I.基因clfa-A反的PCR的扩增结果 图2基因Hla的PCR的扩增结果 图3基因sbi的PCR的扩增结果 图4重组蛋白clfa-A反的SDS-PAGE分析 图5重组蛋白Hla的SDS-PAGE分析 图6重组蛋白Sbi的SDS-PAGE分析图。五具体实施例方式 乳房炎亚单位疫苗即利用致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。本疫苗研发时，选择基因基于以下事实ClfA、Hla及Sbi是金黄色葡萄球菌产生的毒力因子，在金黄色葡萄球菌感染宿主的过程中以特定的结构域发挥毒力作用。ClfA的A区(ClfA-A)是结合宿主细胞外基质中前卫蛋白与纤维蛋白原的功能性区域；Hla通过各个単体之间的相互作用形成攻膜复合物，在靶细胞表面打孔使其裂解，;Sbi的功能区(I、II、III、IV区)可以特异性地与宿主的IgG的Fe端结合，干扰抗体介导的调理吞噬作用从而抵抗宿主吞噬细胞的杀伤作用，还可以与补体C3d、补体调节蛋白H因子结合，阻止补体形成攻膜复合物。本发明预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法包括1)金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2)重组蛋白与转移因子佐剂的混合。步骤I)中包括以下步骤
I、设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点
序列ClfA Genbank No. AB245457. I Hla Genbank No. AY449760. I Sbi Genbank No. AB050860. I
Hl: 5’ -CG^MIZ^3CAGATTCTGA-3’EcoRl
H2: 5' -GCCTtK^TTAATTTGTCAT -3’Xhol
Cl: 5，-CGfiMZZtPTAGCTGCAGAT-S'EcoRl
C2: 5’-CCG^^CTCATCAGGTTGTTCAGG-3，Xhol
SI: 5，-CG^MZZ^SATCAACAAAAAGCTT-3，EcoRl
S2: 5’-CG^^TAATGCGTCTAATTGTTT-3’Xhol
ClfA, Hla与Sbi在金黄色葡萄球菌感染宿主的过程中分别起黏附、破坏宿主细胞、逃避免疫系统的作用。2、制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样。均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37°C温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37°C摇床中培养过夜。取I mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，_20°C保存备用。3、PCR扩增与回收目的基因 (I)扩增目的基因hla
反应体系(50 iiL):超纯水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, H1/H2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀。PCR程序预变性94°C 5 min ;进入循 环变性94°C 30 s，退火56°C 30 s，延伸72°C I. 5 min，共30个循环；最终延伸72°C 10 min，参见图2。(2)扩增目的基因ClfA的A区
反应体系(50ii L):超纯水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, C1/C2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀。PCR程序预变性94°C 5 min ;进入循环变性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°C I. 5 min，共30个循环；最终延伸72°C 10 min，参见图I。(3)扩增目的基因 Sbi 的 I ,IIJILIVg
反应体系(50ii L):超纯水 32 u L, IOXTaq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4u L, MgC124uL, S1/S2各I ii L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀。PCR程序预变性94°C 5min ;进入循环变性94°C 30s，退火52°C 30s，延伸72°Clmin，共30个循环；最终延伸72°C lOmin，参见图3。(4 )回收PCR扩增产物
目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用，_20°C保存备用。4、目的基因的原核表达与纯化
(I)表达载体的构建
分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切。酶切体系(40 L):PCR 产物或 pET32a 载体 32 L，IOXH Buffer 4 L, EcoRI /XhoI 各 2 L。混匀后置于37°C水浴反应2 3h。目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 1过夜连接，得到重组质粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，产物 4°C保存。连接反应体系T4 Ligase Buffer 1 L，目的片段酶切产物6. 5 L，pET32a载体酶切产物 I. 5 L, T4 DNA Ligasel L。将连接产物转化入感受态细胞BL21 (DE3)，在Amp+平板上37°C培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。
(2)重组质粒的诱导表达
权利要求
1.一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2)重组蛋白与转移因子佐剂的混合。
2.根据权利要求I所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于将ClfA、Hla及Sbi三种蛋白的功能区通过原核表达并纯化，制成多价亚单位疫苗，且ClfA的A区、Sbi的I - IV区为配体结合区。
3.根据权利要求2所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于步骤I)中包括①设计引物；②制备模板；(D PCR扩增与回收目的基因；④目的基因的原核表达与纯化。
4.根据权利要求3所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于 ①设计引物 根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点 序列ClfA Genbank No. AB245457. I Hla Genbank No. AY449760. I Sbi Genbank No. AB050860. I Hl: 5’ -CG^MIZ^3CAGATTCTGA-3’EcoRl H2: 5' -GCCTtK^TTAATTTGTCAT -3’Xhol Cl: 5，-CGfiMZZtPTAGCTGCAGAT-S'EcoRl C2: 5’-CCG^^CTCATCAGGTTGTTCAGG-3，Xhol SI: 5，-CG^MZZ^SATCAACAAAAAGCTT-3，EcoRl S2: 5’-CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT-3’XhoI ②制备模板 提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37°C温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37°C摇床中培养过夜，取I mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，_20°C保存备用； ③PCR扩增与回收目的基因 (1)扩增目的基因hla 反应体系(50 iiL):超纯水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, H1/H2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀； PCR程序预变性94°C 5 min ;进入循环变性94°C 30 s，退火56°C 30 s，延伸72°CI.5 min，共30个循环；最终延伸72°C 10 min ； (2)扩增目的基因ClfA的A区 反应体系(50ii L):超纯水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, C1/C2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀； PCR程序预变性94°C 5 min ;进入循环变性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°CI.5 min，共30个循环；最终延伸72°C 10 min ； (3)扩增目的基因Sbi的I、II、III、IV区反应体系(50ii L):超纯水 32 u L, IOXTaq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4u L, MgC124uL, S1/S2各I ii L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加样后充分混匀； PCR程序预变性94°C 5min ;进入循环变性94°C 30s，退火52°C 30s，延伸72°Clmin，共30个循环；最终延伸72 °C IOmin ； (4)回收PCR扩增产物 目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用，_20°C保存备用； ④目的基因的原核表达与纯化 (1)表达载体的构建 分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切； 酶切体系(40 L):PCR 产物或 pET32a 载体 32 L，10XH Buffer 4 L, EcoRI / XhoI各 2 L ； 混匀后置于37°C水浴反应2 3h，目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 1过夜连接，得到重组质粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，产物4°C保存； 连接反应体系T4 Ligase Buffer 1 L，目的片段酶切产物6. 5 L，pET32a载体酶切产物 I. 5 L, T4 DNA Ligasel L ； 将连接产物转化入感受态细胞BL21 (DE3)，在Amp+平板上37°C培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定； (2)重组质粒的诱导表达 将上步筛选出的阳性重组菌按1:100接种到含氨苄的LB培养基中，转速为220r/min、37°C震荡培养至0D600=0.8 1.0时，加入IPTG诱导目的蛋白，诱导条件分别如下pET-Hla :IPTG 终浓度为 0. 5mmol/L, 37°C, 6h ；pET-CA IPTG 终浓度为 0. 5mmol/L，37°C，2h ；pET-Sbi IPTG 终浓度为 0. 5mmol/L, 37°C, 4h ； 表达产物用SDS-PAGE电泳检测； (3)目的蛋白的纯化 收集诱导后的菌体，用PBS (pH7. 4)洗涤2次后用重悬，冰上超声裂解细菌，至样品不再黏稠，裂解物12000r/min，4°C离心5min，收集上清，用镍柱纯化法纯化上清，得到目的蛋白，纯化产物用SDS-PAGE电泳检测。
5.根据权利要求4所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于步骤2)的混合过程为将纯化得到的Hla蛋白在60°C水浴条件下处理30min，然后将Hla, CA、Sbi三种蛋白用pH7. 4的PBS稀释混合均匀，使各蛋白终浓度相同，再与转移因子佐剂等体积混勻。
6.根据权利要求I所述的亚单位疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。本发明的目的在于提供预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用，亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。本发明通过以下步骤完成1)金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2)重组蛋白与转移因子佐剂的混合。
文档编号C12N15/31GK102698260SQ20121011669
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者姚运亮, 李 杰, 田婷婷, 罗军, 许君艳, 陈德坤 申请人:西北农林科技大学