专利名称：一株植物乳杆菌在花菜外包叶青贮中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株植物乳杆菌在花菜外包叶青贮中的应用。
背景技术：
花菜(Brassica oleracea)外包叶含有丰富的氨基酸、粗纤维、维生素及ー些微量元素等，是畜禽良好的饲料来源，但在收获期存在着量大易脱水、腐败，营养物质损耗快的特点，非常不易贮藏。花菜外包叶在我国资源丰富，但除了少部分被利用外，大部分被废弃，以堆积等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在制备青忙饲料中的应用，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5027。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3_I CGMCC No. 5027 的菌落呈现乳白色，边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能，30°C条件下，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到IO8 109cfu/mL，pH彡3. 5 ;其碳源发酵实验结果如表I所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1 CGMCC No. 5027具有以下生物学特性I)在起始pH2. 5 pH9. 0的条件下能够生长；2)在5°C 10°C或50°C温度环境下呈现微弱生长，在15で 45で条件下生长状况良好；3)在彡6. 5% NaCl的条件下生长状况良好。在上述应用中，所述青！)&饲料具体可为花菜(Brassica oleracea)外包叶青忙饲料，所述花菜(Brassica oleracea)外包叶青！)&饲料的青忙原料为花菜(Brassicaoleracea)外包叶；所述青贮饲料是将所述青贮原料在厌氧的条件下进行发酵得到的饲料。 本发明的另ー个目的是提供ー种青贮饲料的制备方法，包括如下步骤用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3_I CGMCC No. 5027 对如下 I)或 2)的青忙原料进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料I)花菜(Brassica oleracea)外包叶和麸皮以 66. 51 33. 49-82. 38 17. 62 的质量比混合制成的含水量为60% 70%的混合物；2)花菜(Brassica oleracea)外包叶和玉米糁以 66. 45 33. 55-82. 35 17.65的质量比混合制成的含水量为60% 70%的混合物；所述青贮饲料是将所述青贮原料在厌氧的条件下进行发酵得到的饲料。
在上述方法中，所述发酵按照每克所述青贮原料接种IO5 IO6Cfu所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 进行。在上述方法中，所述发酵的温度为室温，所述室温为15。。 25°C。在上述方法中，所述发酵的时间为30d 60d。上述任一所述方法制备得到的青贮饲料也属于本发明保护的范围。实验证明，利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3_ICGMCC No. 5027青忙花菜(Brassica oleracea)外包叶与麸皮或玉米糁混合成含水量为60% 70%的混合物， 30d或60d开封时未检测到大肠杆菌、酵母及霉菌，乳酸菌含量较高，pH较低(< 4. 5)，均不含易引起恶臭的丁酸。将含水量较高的花菜外包叶和含水量较低的麸皮或玉米糁混合成含水量为60% 70%的混合物青贮，不仅可以把含水量调整到适合青贮的水平，还由于混合后的饲料营养成分较为全面、均衡。饲喂此混合青贮饲料能够在保证干物质摄入量的同时，有效增加乳酸菌及其代谢产物的摄入量。应用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 青忙花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合成含水量为60% 70%的混合物，具有效率高、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
图I 为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 发酵液对革兰氏阳性及阴性指示菌的抑菌圈。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。MRS液体培养基溶剂为水，溶质为蛋白胨10. 0g/L，牛肉膏10. 0g/L，酵母膏5. Og/L,柠檬酸氢ニ铵2. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,吐温-801. 0g/L,こ酸钠5. 0g/L,磷酸氢ニ钾
2.0g/L，硫酸镁 0. 58g/L，硫酸锰 0. 25g/L，pH 值为 6. 5。MRS固体培养基每升上述MRS液体培养基添加15g琼脂制备得到的培养基。花菜外包叶为发育至花菜成熟时期的花菜(Brassica oleracea)外包叶,含水量为81. 1%，切割长度为5cm。麸皮为小麦最外层的表皮,小麦被磨面机加工后得到的,含水量为18. I %。玉米糁将玉米的成熟籽粒去皮后磨成的小颗粒，平均粒径为1mm，含水量为18. 2%。豆柏含水量为10%。红薯茎叶为发育至红薯成熟时期的红薯(Ipomoea batatas)茎叶经过刈割处理后得到的，平均粒径为2mm，含水量为75. 5%，切割为5cm长度。实施例I、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3_ICGMCC No. 5027 的分离、纯
化与鉴定取河南郑州地区青!)&玉米稻杆IOg,加入90mL蒸懼水，用震荡器震荡5min,KT1-KT5梯度稀释。分别从各梯度稀释液中取20 y L涂布于MRS固体培养基上，静置厌氧培养48h，挑取菌落形态、大小、顔色和光泽度等有明显差别的单菌落，重复划线，直至得到纯菌落。将菌株接种于MRS液体培养基中30°C培养24h，IOOOOrpm离心IOmin后，取20 y L上清液，以藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌(Escherichia coli)分别作为指不菌,用牛津杯双层平板法进行抑菌试验，如图I所示，从中筛选出抑菌效果好的Z3-1菌株。将Z3-1菌株在MRS固体培养基上培养24h后，观察菌落的大小、颜色、边缘状况及革兰氏染色镜检细菌形态。利用API 50CH检测Z3-1菌株对49种不同碳源的同化能力。结果Z3-1菌株菌落呈现乳白色，边缘整齐 ；Z3-1菌株细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；Z3-1菌株接触酶阴性，氧化酶阴性；Z3-1菌株具有较强的生长及产酸性能，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到IO8 109cfu/mL，pH く 3. 5。Z3-1菌株的碳源发酵实验结果如表I所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示。根据细胞显微形态、碳源发酵实验结果和16S rRNA基因序列数据，将菌株Z3-1鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),并于2011年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记编号为CGMCC No. 5027。表I. Z3-1菌株的碳源发酵实验结果
权利要求
1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1在制备青忙饲料中的应用，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5027。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述青忙饲料为花菜(Brassicaoleracea)外包叶青忙饲料。
3.ー种青贮饲料的制备方法，包括如下步骤用权利要求I所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 对如下 I)或 2)的青忙原料进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料 1)花菜(Brassicaoleracea)外包叶和麸皮以 66. 51 33. 49-82. 38 17. 62 的质量比混合制成的含水量为60% 70%的混合物； 2)花菜(Brassicaoleracea)外包叶和玉米糁以 66. 45 33. 55-82. 35 17. 65 的质量比混合制成的含水量为60% 70%的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵按照每克所述青贮原料接种IO5Cfu IO6Cfu 所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3_ICGMCC No. 5027 进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为室温，所述室温为15°C 25°C。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述发酵的时间为30d 60d。
7.权利要求3-6任一所述方法制备得到的青贮饲料。
全文摘要
本发明公开了一株植物乳杆菌在花菜外包叶青贮中的应用。所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027，可用于制备青贮饲料。所述青贮饲料可为花菜(Brassica oleracea)外包叶青贮饲料。实验证明，应用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027接种青贮花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合成含水量为60％～70％的混合物，30d～60d开封，pH较低，乳酸含量较高，具有效率高、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
文档编号C12N1/20GK102640886SQ20121011667
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者倪奎奎, 庞会利, 李东霞, 李宗伟, 焦浈, 王雁萍, 谈重芳 申请人:郑州大学