专利名称：生态环境勘察中的微生物采集方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物采集方法，具体涉及一种生态环境勘察中的微生物采集方法。
背景技术：
丛枝菌根真菌(AMF)是一种普遍存在的内共生真菌，它能够与80%以上的陆生植物形成共生体。丛枝菌根真菌在维 持植物根际生态系统的稳定、促进植物的生长、提高宿主植物的抗逆性和提高退化土壤质量方面起着至关重要的作用。丛枝菌根真菌由菌根孢子(果)、丛枝体、泡囊、菌丝组成，它们都可以作为繁殖体。目前，菌根的分离纯化主要采用孢子作为供体，土壤中小孢子果、孢子和土生辅助细胞通常利用湿筛法采集。利用单一孢子作为菌源有诸多不利因素，首先，孢子侵染速度中等，菌种繁殖体数量积累较慢；其次，湿筛过程中孢子量少的土壤中由于土粒和有机颗粒的干扰，不容易分离孢子；同时湿筛过程中体积较大或较小的颗粒可能丢失。虽然利用孢子作为繁殖体可得到纯种，但是由单一菌源生产的菌剂在自然界中作用很难实现最大化，野外环境的改变、菌种之间的拮抗性和宿主植物对菌种的选择性等都会对单一菌源造成影响，由此生产的菌剂野外难以推广应用。丛枝菌根真菌是专性活体营养寄生菌，只有在活体植物根上形成菌根后才能繁殖成孢子和孢子果，实验室内很难复制菌根和宿主植物之间根际微环境，加之菌根繁殖体在土壤中的数量、存活时间、活性大小、侵染速率等方面差异性大，室内难以筛选出适合野外生长菌根菌群。因此，在随着菌根在矿区生态重建、土壤修复以及农业生物肥力等方面越来越广的应用情况下，野外原位采集丛枝菌根菌群和利用复合菌群生产菌剂就变的至关重要。
发明内容
针对现有技术中丛枝菌根真菌采集方法的不足，本发明提供一种生态环境勘察中的微生物采集方法。本发明提供一种生态环境勘察中的微生物采集方法，所述微生物为丛枝菌根真菌，所述采集方法包括以下步骤(I)制作采集菌袋选取孔径为30 μ m的布作为菌袋材料；用该菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的一端设有开口 ；(2)制备供试基质供试基质为目标采集区的土壤，将所述土壤过孔径为1_的筛子，然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用；(3)将步骤(2)中得到的供试基质装入步骤(I)中制作的菌袋中，填装完毕后，将所述菌袋的开口封闭；(4)将步骤(3)中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置，放置完成
后，覆盖土壤。优选地，所述微生物采集方法具体包括以下步骤(I)制作采集菌袋选取孔径为30 μ m的尼龙布作为菌袋材料；用该菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的长度为5 15cm、宽度为4 12cm、厚度为2 5cm ;菌袋的一端设有开Π ；(2)制备供试基质供试基质为目标采集区的土壤，将所述土壤过孔径为1_的筛子，然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用；(3)将步骤(2)中得到的供试基质装入步骤(I)中制作的菌袋中，每个菌袋的填装量为50 150g，填装完毕后，将所述菌袋的开口封闭；(4)将步骤(3)中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置，所述菌袋的放置方式为垂直放置，放置完成后，覆盖土壤。步骤(4)中，装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置包括将贴近所述宿主植物根部的土壤挖去，然后将所述装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置。步骤(I)中，所述菌袋具有防腐功能，即在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。 优选地，步骤(I)中，所述菌袋的长度为10cm、宽度为8cm、厚度为3cm ;且步骤(3)中，每个菌袋的填装量为I00g。优选地，步骤⑴中，所述菌袋的一端具有牵引绳。采集时，所述牵引绳系在宿主植物的茎干部，便于回收所述菌袋。本领域技术人员可以理解，为了方便，所述牵引绳优选设置在所述菌袋具有开口
的一端。进一步地，为了使得所述菌袋能够垂直放置，所述牵引绳更优选设置在开口的一端的中部。步骤(2)中，所述灭菌可以采用本领域技术人员已知的任何方式进行；优选地，所述灭菌采用高温高压蒸汽灭菌。步骤(3)中，所述开口的封闭可以采用本领域技术人员已知的任何方式进行，例如采用缝合的方式将开口封闭。本发明提供的生态环境勘察中的微生物采集方法，进一步包括以下步骤在所述宿主植物一个生长季后，除去所述菌袋上部的土壤，取出所述菌袋，然后对所述菌袋内的包括孢子密度、菌丝密度、菌丝长度的指标进行测定。这些测定方法可以采用本领域技术人员已知的任何方法进行，例如孢子密度采用湿筛倾注法、菌丝密度采用网格交叉法。本发明的生态环境勘察中的微生物采集方法，利用孔径为30μπι的尼龙布制作菌袋采集菌丝体和孢子。菌丝体直径为3 7μ ，这样菌丝体可自由进入菌袋，而宿主植物根系等很难进入，此种情况下，宿主植物局部根系为获得养分，就迫使其共生体菌根及其附属物进入菌袋。菌袋中的供试基质经过过筛和灭菌，一定程度改善了供试基质的质地，同时排除了其它微生物的干扰，更有利于菌根及其附属物的生长。现有技术中，丛枝菌根分离每样需采集土样I. 5 2kg，然后在从这些土样中分离孢子，这样工作量往往较大。利用本发明的生态环境勘察中的微生物采集方法采集丛枝菌根很大程度解决了野外丛枝菌根采集的难题，菌袋内的供试基质只有约100g，同时人为地改变了菌袋内供试基质的理化性状及其质地，更有利于孢子和菌丝体的富集，这样很大程度上缩小了筛选范围并减少了工作量。利用本发明的生态环境勘察中的微生物采集方法，其中所述菌袋可以富集孢子和菌丝体，并将其作为菌剂生产的菌源，这就为野外生产丛枝菌根菌剂提供技术支持，也为菌剂在不同区域内推广应用提供理论基础。
具体实施例方式下面的实施例仅用于解释本发明，而非限制本发明。尼龙布购自北京市崇文振兴金属丝网商店，孔径为30μπι。孢子密度采用湿筛倾注法进行测定；菌丝密度采用网格交叉法进行测定。实施例I :(陕西榆林活鸡兔矿塌陷区丛枝菌根真菌的原位采集)选取孔径为30 μ m的尼龙布作为菌袋材料。该菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。菌袋的长度为10cm、宽度为8cm，菌袋的厚度为3cm;菌袋的一端设有开口 ；开口端的中部设有牵引绳。
供试基质采集地点位于陕西榆林神木县大柳塔镇高家畔，属于神东矿区活鸡兔矿采空塌陷区，供试基质为该塌陷区的退化土壤，并过孔径为1_的筛子，过筛后的土壤在装入上述菌袋前经高温高压蒸汽灭菌(12rc，2h)，自然风干。 将上述供试基质装入上述菌袋中，每个菌袋装入供试基质100g，填装完毕后，将所述菌袋的开口缝合。宿主植物为紫穗槐，紫穗槐选自活鸡兔矿塌陷区微生物复垦示范基地。供试紫穗槐的平均株高为43. 3cm，冠幅为26cm。试验于2011年4月17日进行，此时神东矿区的土壤已融冻，宿主植物处于返青季节。试验设计20个重复，即选择20株紫穗槐作为宿主植物，按照S型曲线选取紫穗槐，所选择的20株紫穗槐大小相近。将贴近紫穗槐根部的土壤挖去，然后将上述装有供试基质的菌袋紧靠紫穗槐根部垂直放置，放置深度为15cm，放置完成后覆盖土壤，并将菌袋的牵引绳系在紫穗槐的茎干部，以便回收菌袋。10月初取回所述菌袋并采集宿主植物根际土壤。10月正是研究区冰冻季节，该区的植物已停止生长，本试验是宿主植物的一个生长季。对采集的根际土壤和回收的菌袋内供试基质进行测定。宿主植物根际土壤中孢子密度、菌丝密度和IOOg土壤菌丝长度分别为15个/g、3. 19m g—1和319m。对回收的菌袋内的孢子密度、菌丝密度和菌丝长度进行测定，菌袋内的孢子密度高达33个/g、菌丝密度为6. 04m · g'菌袋内总菌丝长度为604m。所述菌袋内的孢子密度和菌丝密度要比紫穗槐根际土壤分别高出18个/g和2. 85m · g'说明本发明的微生物采集方法可以大大提高野外丛枝菌根真菌的采集量和采集速度。实施例2 (神东矿区补连塔矿塌陷区丛枝菌根真菌的原位采集)选取孔径为30 μ m的尼龙布作为菌袋材料。该菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。菌袋的长度为10cm、宽度为8cm，菌袋的厚度为3cm;菌袋的一端设有开口 ；开口端的中部设有牵引绳。试验地选在神东矿区补连塔矿，供试基质为该矿塌陷区退化土壤，并过孔径为1_的筛子，过筛后的土壤经高温高压蒸汽灭菌(121°C，2h)，自然风干。将上述供试基质装入上述菌袋中，每个菌袋装入供试基质100g，填装完毕后，将所述菌袋的开口缝合。宿主植物为沙柳。沙柳的平均株高为136. 5cm，冠幅为96. 2cm。
试验于2011年4月18日进行，此时神东矿区的土壤已融冻，宿主植物处于返青季节。试验设计20个重复，即选择20株沙柳作为宿主植物，按照S型曲线选取紫穗槐，所选择的20株紫穗槐大小相近。将贴近沙柳根部的土壤挖去，然后将上述装有供试基质的菌袋紧靠沙柳根部垂直放置，放置深度为15cm，放置完成后覆盖土壤，并将菌袋的牵引绳系在沙柳的茎干部，以便回收菌袋。10月初取回所述菌袋并采集宿主植物根际土壤，对回收的菌袋内的供试基质和沙柳根际土壤中孢子密度、菌丝密度和IOOg土壤中菌丝长度进行测定。结果，菌袋内的孢子密度、菌丝密度和菌丝长度分别达到21个/g、4. 74m -g^1和4. 74m,而根际土壤中孢子密度、菌丝密度和菌丝长度分别为11个/g、l. 91m · g—1和I. 91m。所 述菌袋内的孢子密度和菌丝密度要比沙柳根际土壤高出10个/g和2. 83m · g'说明本发明的微生物采集方法可以显著提高野外丛枝菌根真菌的采集率，缩短丛枝菌根真菌的采集时间。实施例3 (宁夏煤矸石山复垦区丛枝菌根真菌的原位采集)选取孔径为30 μ m的尼龙布作为菌袋材料。该菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。菌袋的长度为10cm、宽度为8cm，菌袋的厚度为3cm;菌袋的一端设有开口 ；开口端的中部设有牵引绳。试验地点在宁夏大武口洗煤厂煤矸石山，该地位于宁夏回族自治区石嘴山市，属于中温带干旱气候区，降水稀少而集中，光照充足，蒸发强烈，空气干燥，极不利于植物的生长。本试验地点选择煤矸石山上，煤矸石山上铺了 O. 8 Im厚的河沙作为生长基质，试验区为中国矿业大学(北京)矿区微生物复垦示范基地。供试基质为矸石山上废弃砂质，并过孔径为Imm的筛子，过筛后经高温高压蒸汽灭菌(12rC，2h)，自然风干。将上述供试基质装入上述菌袋中，每个菌袋装入供试基质100g，填装完毕后，将所述菌袋的开口缝合。宿主植物是当地先锋植株白蜡，白蜡的平均株高为217cm，冠幅为151cm。试验于2011年4月25日进行，此时宁夏地区的土壤已融冻，宿主植物处于返青季节。试验设计20个重复，即选择20株白蜡作为宿主植物，按照S型曲线选取白蜡，所选择的20株白蜡大小相近。将贴近白蜡根部的土壤挖去，然后将上述装有供试基质的菌袋紧靠白蜡根部垂直放置，放置深度为15cm，放置完成后覆盖土壤，并将菌袋的牵引绳系在白蜡的茎干部，以便回收菌袋。10月初取回菌袋并采集宿主植物根际土壤，对回收菌袋内的供试基质和白蜡根际土壤孢子密度、菌丝密度和IOOg土壤中菌丝长度进行测定。结果，菌袋内孢子密度、菌丝密度和菌丝长度分别为28个/g、5. 66m · g—1和566m，而白蜡根际土壤中孢子密度、菌丝密度和菌丝长度分别为13个/g、2. 81m · g—1和281m。所述菌袋内的孢子密度和菌丝密度要比白蜡根际土壤高出15个/g和2. 85m · g'说明本发明的微生物采集方法可以显著提高野外丛枝菌根真菌的采集率，缩短丛枝菌根真菌的采集时间。本领域技术人员可以理解，在本说明书的教导之下，可以对本发明做出一些修改或变化。这些修改和变化也应当在本发明权利要求所限定的范围之内。
权利要求
1.一种生态环境勘察中的微生物采集方法，所述微生物为丛枝菌根真菌，所述采集方法包括以下步骤 (1)制作采集菌袋选取孔径为30u m的布作为菌袋材料；用该菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的一端设有开口； (2)制备供试基质供试基质为目标采集区的土壤，将所述土壤过孔径为Imm的筛子，然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用； (3)将步骤(2)中得到的供试基质装入步骤(I)中制作的菌袋中，填装完毕后，将所述菌袋的开口封闭； (4)将步骤(3)中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置，放置完成后，覆盖土壤。
2.根据权利要求I所述的微生物采集方法，其特征在于，所述采集方法具体包括以下步骤 (1)制作采集菌袋选取孔径为30的尼龙布作为菌袋材料；用该菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的长度为5 15cm、宽度为4 12cm、厚度为2 5cm ;菌袋的一端设有开口 ； (2)制备供试基质供试基质为目标采集区的土壤，将所述土壤过孔径为1_的筛子，然后将过筛后的土壤灭菌并干燥备用； (3)将步骤⑵中得到的供试基质装入步骤⑴中制作的菌袋中，每个菌袋的填装量为50 150g，填装完毕后，将所述菌袋的开口封闭； (4)将步骤(3)中得到的装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置，所述菌袋的放置方式为垂直放置，放置完成后，覆盖土壤。
3.根据权利要求2所述的微生物采集方法，其特征在于，步骤(4)中，装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置包括将贴近所述宿主植物根部的土壤挖去，然后将所述装有供试基质的菌袋紧靠宿主植物根部放置。
4.根据权利要求3所述的微生物采集方法，其特征在于，步骤(I)中，所述菌袋的长度为10cm、宽度为8cm、厚度为3cm ;且步骤(3)中，每个菌袋的填装量为100g。
5.根据权利要求4所述的微生物采集方法，其特征在于，步骤(I)中，所述菌袋的一端具有牵引绳。
6.根据权利要求5所述的微生物采集方法，其特征在于，所述牵引绳设置在所述菌袋具有开口的一端，并设置在所述具有开口的一端的中部。
7.根据权利要求6所述的微生物采集方法，其特征在于，步骤(2)中，所述灭菌是采用高温高压蒸汽灭菌。
8.根据权利要求I 7任一项所述的微生物采集方法，其特征在于，所述微生物采集方法进一步包括以下步骤 在所述宿主植物一个生长季后，除去所述菌袋上部的土壤，取出所述菌袋，然后对所述菌袋内的包括孢子密度、菌丝密度、菌丝长度的指标进行测定。
全文摘要
本发明涉及一种生态环境勘察中的微生物采集方法。所述微生物采集方法中的微生物为丛枝菌根真菌，所述采集方法包括步骤制作采集菌袋、制备供试基质、将所述供试基质装入所述菌袋并封闭以及投放所述菌袋。利用本发明的生态环境勘察中的微生物采集方法，其中所述菌袋可以富集孢子和菌丝体，在很大程度上缩小了筛选范围并减少了工作量。
文档编号C12N1/14GK102757901SQ20121013510
公开日2012年10月31日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者张凯, 毕银丽 申请人:中国矿业大学(北京), 中国神华能源股份有限公司