专利名称：一种制备甲壳素脱乙酰酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备甲壳素脱乙酰酶的方法，具体涉及一种通过生物发酵工艺用短柄梨孢帚霉brevicaulis)制备甲壳素脱乙酰酶的方法。
背景技术：
壳聚糖及其衍生物可被广泛用于医药、化妆品、食品、化工、农业、生物技术、高分子材料等许多领域，其主要来源于甲壳动物、植物、微生物等。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化的产物，一般把脱乙酰度大于70%的甲壳素称为壳聚糖。甲壳素脱乙酰制备壳聚糖，国内外大都采用45%Na0H在较高温度下脱去乙酰基，该方法碱耗量大，对环境造成严重的污染，产 品壳聚糖的特性不稳定(如脱乙酰度不均匀、分子量变化大、乙酰基所在的位置不能固定
O在甲壳素酶法脱乙酰制备壳聚糖的过程中，常用的酶有甲壳素酶、壳聚糖酶、甲壳素脱乙酰酶，从其作用机制分析，甲壳素脱乙酰酶是专一性的用于甲壳素脱去乙酰基的酶，它在脱乙酰的过程中，不会切断壳聚糖分子的的糖链，因此该酶在作用过程中不会降解甲壳素和壳聚糖。而甲壳素酶和壳聚糖酶甲壳素脱乙酰基的非专一性酶，甲壳素酶是甲壳素降解的专一性酶，壳聚糖酶是壳聚糖降解的专一性酶，这两种酶不适合于用来作为脱去甲壳素乙酰基的酶。甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase, E. C. 3. 5. 41,以下简称CDA)可以水解脱掉甲壳素上的乙酰基，因此，可以利用它代替现有的浓碱热解法生产高质量的壳聚糖；这不但可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，而且可以生产出某些用化学法不能生产的壳聚糖产品，如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄的壳聚糖产品，以及具有特定乙酰化位置的壳聚糖等。自1974 年,Araki Y.等最初从接合菌纲{Zygomycetes')的ifocor rouxii 中发现甲壳素脱乙酰酶以来，1982年Kauss等又从半知菌纲iPeuteromycetes)饱ColIetotrichum/化而^^/从/細應中发现该酶的存在。在对几种真菌的深入研究发现ifocor rouxii (鲁氏毛霉)、仙Wia coerulea (蓝色犁头霉)、nidulans (构巢曲霉)、两株Colletotrichum lindemuthianum (菜豆毛盘抱)，Rhizopus oryzae (米根霉)，Mucorracemosus (总状毛霉)和 Rhizopus nigricans (黑丰艮霉)Scopulari op si s brevicaulis(短柄梨孢帚霉)，Metarhizium anisopIiae (金龟子绿僵菌),Uromyces (单胞锈菌属)及Saccharomyces cerevisiae (啤酒酵母),具有产甲壳素脱乙酰酶的能力。另外还发现两种细菌KiArio alginolyticus (肠炎弧菌)及仰况i7i5■(枯草芽孢杆菌)也具有产甲壳素脱乙酰酶的能力。除上述微生物能产生甲壳素脱乙酰酶以外，有一些寄生在动、植物体内的生物体也具有产甲壳素脱乙酰酶的能力，给动、植物的生长和繁殖产生影响。在甲壳素脱乙酰酶产生菌的选择方面，Vadake R.从城市下水道的污泥中分离得到了一株具有产甲壳素脱乙酰酶活力的细菌；MawT.等人通过紫外诱变改良Gongronella butIeri (卵孢球托霉)，通过改良来提高该菌株产壳聚糖的能力，紫外诱变后获得了三株诱变菌株，他们的甲壳素脱乙酰酶的活力及壳聚糖的产量均提高了两倍；黄惠莉等人从海洋泥土中分离出产甲壳素脱乙酰酶菌株，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，其产酶适宜培养条件为pH4.0，添加金属离子Ca2+，培养时间为80h，温度为35°C，所得甲壳素脱乙酰酶作用的最适温度为40°C 50°C,最适pH为4. 5^5. O之间。在甲壳素脱乙酰酶基因工程菌的构建方面，Ken T.等人在甲壳素酶的信号序列的共同作用下,将Iindemuthianum的甲壳素脱乙酰酶的基因克隆到coli的细胞中形成重组体，以N-乙酰氨基葡萄糖的五聚体作底物，对比了重组体的表达产物与出发菌的产物的酶学特性，同时对重组体的表达产物甲壳素脱乙酰酶的C-端和N-端分别接上6个组氨酸序列和12个氨基酸序列，对修饰后的酶的动力学参数k-作了研究，发现他们的脱乙酰特性比原始酶有了很大的改善，但脱乙酰效果降低，Shrestha B. '\% ColIetotrichumlindemu thi anum的甲壳素脱乙酰酶的基因克隆到/7ZcAia pas tor is中，并对其表达产生的甲壳素脱乙酰酶进行了分离和纯化；Kafetzopoulos D.等人将两种细菌的cDNA克隆到Mucor rouxii编码甲壳素脱乙酰酶的mRNA中，对他们表达产生的甲壳素脱乙酰酶进行分 离及特性和酶序列的研究；Martinou A.等}Saccharomyces cereFisiae (啤酒酵母)的甲壳素脱乙酰酶基因克隆到coli的细胞中并进行表达、纯化，表达产生的酶的分子量为35 kDa，该酶以胶体甲壳素作为底物使，其最适温度和pH分别为50°C和8. 0，催化脱乙酰的底物最小聚合度为2，催化活性被乙酸抑制，CoCl2可促进酶的催化活力，从酶的N-末端切去12个氨基酸残基或从C-末端切去27个氨基酸残基，该酶彻底失去活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的能产甲壳素脱乙酰酶的微生物发酵产酶的工艺条件及参数，以及提供一种甲壳素脱乙酰酶的分离纯化方法。为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复研究，最终获得了如下工艺路线
一种制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于将短柄梨孢帚霉(5bo/w/7aribrevicaulis)klCC 36840在PDA培养基的试管斜面上经活化后，将其接入到含有发酵培养基的发酵容器中，使其在PH6. 5-7. 0，温度27-29°C、转速200_240rpm的摇床上发酵90-100小时，然后经分离、盐析、纯化得甲壳素脱乙酰酶。上述制备甲壳素脱乙酰酶的方法，所述发酵培养基组成为3，6-0-羧甲基甲壳素2%、蔗糖 1%、蛋白胨 0. 4%、NaNO3 0. 2%、K2HPO4 0. 1%、KC10. 05%、MgSO4 0. 05%、ZnSO4 0. 05%。上述制备甲壳素脱乙酰酶的方法，优选地，所述分离、盐析、纯化步骤是将发酵产物离心分离出后用硫酸铵盐析，再将盐析产物离心分离后用Sephadex G_25和SephadexG-100纯化。上述制备甲壳素脱乙酰酶的方法，所述发酵容器为300ml容积的三角瓶，发酵培养基的装量为80ml。上述制备甲壳素脱乙酰酶的方法，发酵产甲壳素脱乙酰酶的温度为29°C，发酵产甲壳素脱乙酰酶的初始PH值为6. 5-7. 0，产菌丝体的温度为27'菌体繁殖的初始pH值为
6.50上述制备甲壳素脱乙酰酶的方法，所述发酵时间为96小时。
与现有技术相比，本发明制备甲壳素脱乙酰酶的方法具有如下显著的进步性
I)经检测表明，经本发明的发酵工艺使得短柄梨孢帚霉产甲壳素脱乙酰酶的效价高，每ml发酵液的活力单位最高可达36U，一个酶活单位(U)确定为以N-乙酰氨基壳六糖为底物，每分钟产生l/^moI乙酰基为一个单位。2 )本发明通过大量试验筛选获得了短柄梨孢帚霉产甲壳素脱乙酰酶的最佳条件，包括其最适碳源、氮源、主要原料分别为蔗糖、蛋白胨、3，6-0-羧甲基甲壳素，最适培养基 组成为(g/100ml) :3,6-0-羧甲基甲壳素 2%、蔗糖 1%、蛋白胨 0. 4%、NaNO3 0. 2%, K2HPO4
0.1%, KCl 0. 05%,MgSO4 0.05%、ZnSO4 0.05%。它们的最适用量分别为 1%、0. 4%、2% ;最适产酶条件为温度为29°C、初始pH为7. 0，在300ml三角瓶中最适培养基加量为80ml，最佳发酵时间为96h。3)采用了简单的三步法分离纯化甲壳素脱乙酰酶，即(NH4)2SO4盐析、SephadexG-25和S印hadex G-100分离纯化，酶的纯化倍数为74倍，酶的收率为37. 8%。4)本发明还提供了短柄梨孢帚霉甲壳素脱乙酰酶催化黑曲霉中甲壳素制备壳聚糖的工艺方法，且壳聚糖产品的脱乙酰度80%以上。
具体实施例方式以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例I短柄梨孢帚霉(5bo/w/7ari发酵产甲壳素脱乙酰酶 将短柄梨孢帚霉iScopulariopsis brevicaulis ) ATCC 36840在含有PDA固体培
养基(培养基的制备及组成取新鲜未发芽的土豆200g,去皮,切成3mmX3mm的块状,加A 800-1000ml水，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液中加入蔗糖(或葡萄糖)20g，琼脂15-20g,溶化后补水至1000ml,自然pH，分装到试管中(每管5ml), 121°C灭菌30min,制成斜面)的试管斜面上，在27°C活化两次。取一支活化的斜面菌种用3-5ml的无菌水洗下孢子，将孢子悬液接入到含有80ml发酵培养基(每IOOml发酵培养基组成为3，6_0_羧甲基甲壳素 2g、蔗糖 lg、蛋白胨 0. 4g、NaNO3 0. 2g、K2HPO4 0. lg、KCl 0. 05g、MgSO4 0. 05g、ZnSO4
0.05g)的容积为300ml的三角瓶中，于29°C、200rpm的摇床上发酵96小时。测定发酵液中甲壳素脱乙酰酶的活力为36U/ml。发酵液中甲壳素脱乙酰酶的活力测定方法在试管中加入100// I 50mM pH7. 5Tris-HCl缓冲液，然后加入100// I含100// g N-乙酰氨基壳六糖的水溶液及50// I经离心分离的发酵上清液，于30°C下反应30min，加入250// I 5%KHS04终止反应。在反应液中加入250// I 5% NaNO2,间断地摇动 15min，再加入 250// I 12. 5% (NH4) 2S04, 5min 后加入 250// I
0.5%3-甲基-苯并噻唑腙(MBTH),并在沸水中加热3min,冷却后加入250// I 0. 5% FeCl3,30min后于650nm处测定吸光值。以标准氨基葡萄糖盐酸盐作标准曲线。一个酶活单位为以N-乙酰氨基壳六糖为底物，每分钟产生I// mo I乙酰基为一个单位。实施例2短柄梨孢帚霉(5bo/w/7ariopsis发酵液中甲壳素脱乙酰酶的分离纯化
将上述发酵液1000ml，在4°C的条件下，于10，OOOXg离心30min，收集上清液800ml，向上清液中加入280g (NH4)2SO4,使(NH4)2SO4的浓度达到35% (W/V),待(NH4)2SO4完全溶解后静置2h，于18，OOOXg离心30min，收集上清液750ml，向上清液中继续加入337. 5g(NH4)2SO4,使溶液中(NH4)2SO4的浓度达到80%(W/V)，静置18h后于20，OOOXg离心30min，收集沉淀物，沉淀物溶解到200ml的去离子水中，于20，OOOXg离心30 min去除不溶性固形物，收集上清液，上清液通过16mm X 80cm的Sephadex G_25柱脱盐,上柱流速5ml/min,收集流出液至400ml,流出液经过16mm X80cm的Sephadex G-100柱分离各种蛋白组分,分离柱用50mmol Tris-HCl洗脱,分段收集洗脱液,用蛋白质核酸检测仪在280nm的条件下检测每部分洗脱液的蛋白质含量，测定每一组分甲壳素脱乙酰酶活力，将甲壳素脱乙酰酶活力较高的组分混合在一起，用IOOOOkDa的透析袋透析72h，透析后的酶液冷冻干燥即得酶粉。 实施例3短柄梨孢帚霉甲壳素脱乙酰酶催化黑曲霉中甲壳素制备壳聚糖
将15g黑曲霉中的甲壳素分散到800 ml 50 mmol Tris-HCl pH 7. 5的缓冲溶液中，加入0. 15-0. 30g上述甲壳素脱乙酰酶，在55°C下连续搅拌8h，在IOOOOXg的条件下离心20min收集固形物，固形物用IOOml的去离子水洗涤3次后，加入100ml 2% (W/V)醋酸溶液，在30°C下连续搅拌16h，在IOOOOXg的条件下离心20min收集上清液，向上清液中加入40%(ff/V) NaOH调整pH到9. 0，在12000 X g的条件下离心20min收集固形物，固形物分别用IOOml去离子水洗涤3次后，再用95% (V/V)乙醇洗涤3次并冷冻干燥即得壳聚糖，壳聚糖产品的脱乙酰度80%以上。
权利要求
1.一种制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于将短柄梨孢帚霉(5bo/w/7aribrevicaulis)klCC 36840在PDA培养基的试管斜面上经活化后，将其接入到含有发酵培养基的发酵容器中，使其在PH6. 5-7. 0，温度27-29°C、转速200_240rpm的摇床上发酵90-100小时，然后经分离、盐析、纯化得甲壳素脱乙酰酶。
2.如权利要求I的制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为.3，6-0-羧甲基甲壳素 2%、蔗糖 1%、蛋白胨 0. 4%、NaNO3 0. 2%、K2HPO4 0. 1%、KC10. 05%、MgSO4.0.05%、ZnSO4 0. 05%。
3.如权利要求I的制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于所述分离、盐析、纯化步骤是将发酵产物离心分离出后用硫酸铵盐析，再将盐析产物离心分离后用Sephadex G_25和 Sephadex G-100 纯化。
4.如权利要求I的制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于所述发酵容器为300ml容积的三角瓶，发酵培养基的装量为80ml。
5.如权利要求I的制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于发酵产甲壳素脱乙酰酶的温度为29°C，发酵产甲壳素脱乙酰酶的初始pH值为6. 5-7. 0，产菌丝体的温度为27°C，菌体繁殖的初始pH值为6.5。
6.如权利要求I的制备甲壳素脱乙酰酶的方法，其特征在于所述发酵时间为96小时。
全文摘要
本发明涉及一种制备甲壳素脱乙酰酶的方法，该方法用短柄梨孢帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)作甲壳素脱乙酰酶产生菌，经活化后将其接入到含有发酵培养基的发酵容器中，使其在pH值为6.5-7.0之间，温度在27-29oC、转速200-240rpm的摇床上发酵90-100小时，发酵液经分离、盐析、纯化得甲壳素脱乙酰酶产品。利用本发明的方法制备的甲壳素脱乙酰酶每ml发酵液的活力单位最高可达36U。
文档编号C12N9/80GK102676485SQ20121013496
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者王常高, 蔡俊, 郑化 申请人:湖北工业大学