专利名称：一株大豆抗原蛋白降解菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物领域，涉及一株大豆抗原蛋白降解芽孢杆菌菌株及其在发酵豆柏生产中的应用。
背景技术：
豆柏是一种优质的植物蛋白饲料，具有蛋白含量高，氨基酸组成合理，动物对其利用率高的特点。近年来又发现大豆中含有丰富的提高动物免疫力的大豆异黄酮等物质，更是受到人们的欢迎。但是豆柏中存在的大豆抗原蛋白是一种热稳定性抗营养因子，严重影响到仔猪等幼龄动物的机体健康和生长速度，表现为小肠结构受损，食糜滞留时间缩短，营养物质的转运、吸收紊乱，导致消化不良、腹泻和生长受阻。现已确定仔猪对大豆抗原蛋白的过敏反应是引起仔猪腹泻的主要原因之一。如何降低和去除豆柏中的大豆抗原蛋白，进而提高豆柏的营养价值和安全性成为饲料工作者研究的热点。大豆抗原蛋白的热稳定性强，是大豆中对动物(特别是幼龄动物)影响最大的一类抗营养物质。在去除豆柏中大豆抗原蛋白的方法中，利用生物酶处理豆柏效果较好，但是成本较高，而微生物发酵法作为一种无害的、高效的、低成本的处理方法成为目前处理豆柏的一种趋势。但是从目前市场来看，质量良莠不齐，同一产品质量不稳定，是发酵豆柏产品的主要问题。这主要是由于发酵用的菌种性能不稳定，产酶能力不高，针对性差等原因所导致。因此获得能够降解豆柏中大豆抗原蛋白、高产蛋白酶和性能稳定的菌株是生产质量稳定的发酵豆柏，提高豆柏的营养价值和安全性的基础。
发明内容
本发明的目的就是针对豆柏中存在的大豆抗原蛋白会引起仔猪腹泻和生长受阻 这一问题，提供一株能够降解豆柏中大豆抗原蛋白的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株。本发明生产的菌株能够降解豆柏中的大豆抗原蛋白，降低其对仔猪的抗营养作用，提高豆柏在仔猪饲料中的应用价值。本发明的另一个目的在于提供该枯草芽孢杆菌菌株在发酵豆柏中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的
一株大豆抗原蛋白降解菌株，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(feci77i/5· subtil is)HN013，已于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 5788。所述的枯草芽孢杆菌菌株的个体形态特征为细胞大小通常为(0.7μπι
O.8 μ m) X (2. O μ m 3. O μ m),杆状,很少成连,无荚膜,芽孢呈椭圆形或柱形，中生或偏生。菌落形态为规则圆形，白色，表面湿润，中间隆起，边缘光滑。所述的枯草芽孢杆菌菌株的主要生理生化特性为革兰氏反应阳性，接触酶阳性，能发生乙酰甲基甲醇反应；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；培养温度20°C 40°C，最适生长温度23°C 25°C，pH6 8，最佳pH7. 2。产蛋白酶能力较高，达到539. 5 U/mL。该菌株的16 S rDNA序列全长共1463 bp,经Genbank比对相似性达至Il 99. 8% 确定为枯草芽孢杆菌。有益效果
本试验通过初筛、复筛，最终得到一株能够降解豆柏中大豆抗原蛋白的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株HN013，对其生物学特性和产蛋白酶能力进行了研究，并在发酵豆柏中的得到了成功应用。该菌株能够降解豆柏中的大豆抗原蛋白，降低其对仔猪的抗营养作用，提高豆柏在仔猪饲料中的应用价值。具体实施例方式实施例I枯草芽孢杆菌subti I is) HNO13菌株的获得
I、培养基
富集培养基牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水lOOOmL，调节pH至7. 2 ;初筛培养基牛肉膏3 g，酪素10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水lOOOmL，调节pH至7. 2 ;种子培养基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g, KH2PO4 I g, MgSO4 0. 2 g, Na2CO3 10 g,蒸懼水IOOOmL,调节pH至7. 2 ;发酵培养基豆柏40 g，蒸馏水IOOOmL,调节pH至7. 2 ;固体斜面培养基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，KH2PO4 I g，MgSO4 0· 2 g，Na2CO3 10 g，琼脂20 g，蒸馏水IOOOmL,调节pH至7. 2 ;
分离培养基(以大豆抗原蛋白为唯一氮源)的制备粉碎过60目筛的豆柏样品5g,以
0.03mol/L pH 8. 8 的 Tris-HCl 缓冲液(含 0. 01mol/L 亚硫酸钠)按 I 20 (ff/V, g/mL)料液比浸提。37°C下，180r/min提取I h，取出，将pH值调回8. 8。再置摇床180r/min提取I. 5 h, 8000r / min离心20min,取上清并调pH至4. O,上清浑池,4000r/min离心5min,弃去上清。用蒸懼水溶解沉淀，调pH至 · 2,加上2. 5g葡萄糖、NaCl 0. 2g、K2HPO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g，加蒸馏水定容至 1000mL，加琼脂 15g，115°C灭菌 20min。2、菌株的分离纯化
取10 g辽宁锦州地区长期存放豆柏的土壤置于已加入90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，漩涡混合仪上震荡2min，静止30min，80°C水浴加热20min，杀死营养细胞。取IOmL所得液加入到IOOmL富集培养基中，25°C，160r/min摇床培养24h。用无菌生理盐水对富集培养后的菌液进行梯度稀释至10_4，分别取10_2、10_3、10_4稀释液各0. ImL涂布于分离培养基平板上，25°C培养24 h,挑选出不同菌落形态的革兰氏阳性菌接入固体斜面培养基中，置于25°C培养箱中培养24h，放入4°C冰箱中保藏，待筛选。、3、产蛋白酶菌株的初筛
大试管(2.0 cmX 20 cm)内装5 mL富集培养基，分别接入上述分离菌株，25°C条件下160 r/min旋转摇床培养48 h,发酵液经3500r/min离心后，以0. 5 cm直径圆形滤纸片沾上清液贴于初筛培养基平板上，于25°C保温24 h，形成蛋白酶水解圈，然后用直尺测蛋白酶水解圈直径，选出水解圈直径和菌落直径的比值(R/r)大于3的菌株。4、摇瓶发酵试验复筛高产蛋白酶的菌株
将初筛得到的菌株经斜面活化后，接一环于种子培养基中，25°C条件下160 r/min振荡培养12h，按5%的接种量转接至发酵培养基中，25°C继续振荡培养48 h，3500 r/min离心30min，取上清液测蛋白酶活力。采用Folin-酚法测定蛋白酶的活力。酶活定义1 mL酶液在pH 7. 2、40°C下，每分钟水解酪蛋白产生Iyg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以“U /mL”表示。筛选酶活力大于538. O U/mL的菌株。5、菌种鉴定通过菌体的群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA序列对菌株进行菌种鉴定。经产蛋白酶能力的初筛、复筛最终得到I株能够降解豆柏中大豆抗原蛋白的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株，通过菌体的群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA序列比对，确定该菌株为芽孢杆 菌科芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(feci77心subtilis)mQn,已于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院，中科院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 5788。实施例2枯草芽孢杆菌subti I is) HNO13在发酵豆柏中的应用
I、试验材料
(1)普通豆柏；
(2)枯草芽孢杆菌UaciBm种子培养液；枯草芽孢杆菌Al (本实验室保藏，一株发酵豆柏生产菌株，作为对照菌)种子培养液。2、试验方法
豆柏粉碎后过10目筛，过筛后的豆柏与水按1:1 (ff/V, g/mL)混合均匀，分为3组，接种量为水体积的5%。I组为空白对照，加入蒸馏水5% ；2组为枯草芽孢杆菌Al对照组，加入Al种子培养液5% ；3组为试验组，加入枯草芽孢杆菌subtiHsmQU种子培养液5% ;分别混合均匀，于25°C密闭条件下培养48h。3、指标测定
(1)发酵样品抗原蛋白残留率测定发酵结束后，将各组样品在50°C烘箱中烘干。每种样品各称取I. OO g，加入20 mL O. 03 mo I / L的Tris — HCl抽提缓冲液研磨匀浆，修正各样品pH值为8.0，浸泡I h后离心(转速8000 r / min，时间10 min)去渣，调节上清液pH值为4. 5,离心(转速10 000 r / min,时间15 min),上清液干燥称重即为各样品中抗原蛋白的质量，抗原蛋白的残留率按下式计算
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(2)三氯乙酸可溶性氮(TCA-NSI)含量的检测参考QB/T2653— 2004大豆肽粉，用于评定大豆蛋白的降解程度。4、结果
从表I中可以看出，枯草芽孢杆菌(feci77w5· 5^ii7i5·) HN013发酵豆柏后抗原蛋白残留率最低，与枯草芽孢杆菌Al相比，抗原蛋白残留率降低87. 4%，说明枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)\MOl >菌株降解抗原蛋白的能力较强。
权利要求
1.一株大豆抗原蛋白降解菌株，该菌株保藏名称为枯草芽孢杆菌{Bacillus保藏日期2012年2月24日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5788。
2.根据权利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株，其特征在于，个体形态特征为细胞大小通常为(0. 7iim 0. 8iim)X(2. Oiim 3. Oii m)，杆状，很少成连，无荚膜，芽孢呈椭圆形或柱形，中生或偏生；菌落形态为规则圆形，白色，表面湿润，中间隆起，边缘光滑。
3.根据权利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株，其特征在于，主要生理生化特性为革兰氏反应阳性，接触酶阳性，能发生こ酰甲基甲醇反应；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；培养温度20°C 40°C，最适生长温度23。。 25°C，pH6 8，最佳pH7.2 ;产蛋白酶能力较高，达到539.5 U/mL。
4.根据权利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株的应用，其特征在于，用于发酵豆柏中。
全文摘要
一株大豆抗原蛋白降解菌株(Bacillussubtilis)HN013，该菌株于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5788；该菌株具有降解豆粕中大豆抗原蛋白和高产蛋白酶的特性，在发酵豆粕生产中应用可以降低大豆抗原蛋白含量，同时增加发酵豆粕中大豆多肽的含量，提高豆粕的应用价值。
文档编号C12N1/20GK102660480SQ20121014718
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者张莉力, 王安民, 田玉民, 苏玉虹, 许云贺, 郭福来, 韩丽娟 申请人:沈阳华年饲料有限公司