专利名称：一种动物体细胞核移植中的融合方法
技术领域：
本发明涉及动物克隆技术领域，具体涉及一种克隆过程中动物体细胞核移植的融合方法。
背景技术：
1997年，世界首例体细胞克隆绵羊“多莉(Dolly) (ffiImut et al，1997)”诞生，在世界上第一次否定了“在体细胞核内基因组经历不可逆”这一传统观念，揭示了高度分化的体细胞核在去核(去染色体)卵胞质中能重新编程(Reprogramming),宣告人类已经进入高等动物体细胞可以进行无性繁殖(克隆)的新时代，在国际社会引起了轰动，由此体细胞克隆成为一个全世界科学家研究的热点。动物克隆是指动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传性状后代的过程，包括孤雌生殖、卵裂球分离与培养、胚胎分割以 及细胞核移植等(桑润滋，2002)。而产生克隆动物的方法则称之为动物克隆技术。目前，广为人知的动物克隆技术实际上就是指细胞核移植技术。细胞核移植(nuelear transfer或nuelear transplantation)通常是指通过显微操作的方法,将供体细胞的细胞核注入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的核质重组体，移入的核在受体胞质的作用下，发生发育程序重编Oteprogramming)，使得核质重组体与正常受精卵一样，经细胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体(张运海，2005 )。手工克隆(handmade cloning, HMC)技术是一项不需要显微操作仪操作的克隆技术。在体视显微镜下用特制的切割刀直接切割去核，然后将两个不含有细胞核的半卵与一个供体细胞靠近并施以直流电脉冲使其融合，最后将重构胚单个培养。因为此法需要去除透明带，并用两个半卵胞质体和供体细胞融合，因而也被称为去透明带双半卵法(Peura，1998)。同时又因为此法的整个过程靠手工操作即可完成并且不需一些精密的仪器，Vajta等(Vajta et al，2001)将其称之为手工克隆。将供体细胞的细胞核导入到卵母细胞质中，这个过程称之为融合。最早使用的融合方法是使用灭活的仙台病毒(HVJ) (McGrath and Solter, 1983)介导细胞融合融合,获得了成功，但是效果很不稳定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的是直流电介导融合的方法，简便而且高效，电融合技术也是从这个时候开始发展起来的，其原理是通过电流的刺激使紧密接触的细胞膜磷脂双分子层发生结构改变，进而形成细胞间的孔道，随着孔道逐渐扩大使胞质交融在一起。目前已经成为动物克隆中普遍采用的融合方法。然而，由于供体细胞的体积较小，与卵母细胞的接触面积小，会影响供体细胞与卵母细胞的融合率。特别是在手工克隆操作中，卵母细胞一般采用切割法去核，会去除约1/3胞质，由于切除胞质过多，采用的是双半卵融合，即先将一枚半卵与一枚供体细胞粘合，再放入电融合槽交流电场定位后通过手工拨动使体细胞对正后融合，然后融合后的半卵再与另一枚半卵进行融合。在实际操作过程中存在几个问题1、卵母细胞变小也会影响操作，从而影响与供体细胞的融合；2、做一次融合时是靠交流电定位后贴于融合槽一侧后再拨正体细胞，操作上会使半卵发散；3、这种融合方法先融合供体细胞，操作相对麻烦，若后来判融合时卵发散，会浪费更大的工作量。
发明内容
本发明的发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种操作简单、融合效果好的动物体细胞核移植的融合方法。为实现上述发明目的本发明采用如下技术方案，一种动物体细胞核移植中的融合方法，包括以下步骤(I)、将两枚半卵细胞放入植物凝集素浓度为0. 5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵细胞对；(2)、将粘合好的卵-卵细胞对放入融合液中平衡1-3分钟； (3)、将平衡后的卵-卵细胞对放入电融合槽中电融合，并施加交流场对卵-卵细胞对进行瞬间定位；(4)、将融合好的卵-卵细胞对移入含有供体细胞的操作液中与供体细胞粘合形成体-卵细胞；(5)、将粘合好的体-卵细胞移入融合激发液中平衡1-3分钟，再移入到融合槽中进行电融合同时激活。本发明所采用的方法先将两个半卵细胞融合，再将融合后的卵-卵细胞与供体细胞融合，增大卵细胞与供体细胞的接触面积，操作上更加简单。本发明进一步改进在于，在进行步骤(I)前先将所述两枚半卵细胞分别放入含有植物凝集素的操作液中3-8秒。本发明的优选方式，步骤(2)中所述融合液中，含有浓度为0. 2 w 0. 5mmol/L的甘露醇、浓度为0. 5 - 2mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、以及浓度为0. 01g/L的聚乙烯醇。本发明的优选方式，步骤(5)中所述融合激发液中含有浓度为0. 2…0. 5mmol/L甘露醇、浓度为 0. 05 ⑵ 0. 2mmol/L CaCl2 2H20、浓度为 0. 05 ⑵ 0. 2mmol/L Mg Cl2 6H20、浓度为0. 5 - 2mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、浓度为0. 01g/L聚乙烯醇。本发明的有益效果先将两枚半卵粘合，粘合好的半卵对放入融合液中平衡数秒钟，再放入电融合槽中交流电瞬间定位，其接触面会自动与电场方向垂直，然后再施加直流电诱导融合。将融合好的半卵细胞对再与供体细胞进行融合激活，由于是融合了双半卵，体积较大会更方便操作，无需施加交流电场，直接以圆头玻璃针拨正体细胞即可。
具体实施例方式本发明所述的一种动物体细胞核移植中的融合方法，其特征在于，包括以下步骤(I)、将两枚半卵细胞放入含有0.5_5mg/ml植物凝集素的操作液中粘合形成卵-卵细胞对；(2)、将粘合好的卵-卵细胞对放入融合液中平衡1-3分钟；(3)、将平衡后的卵-卵细胞对放入电融合槽中电融合，并施加交流场对卵-卵细胞对进行瞬间定位；(4)、将融合好的卵-卵细胞对移入含有供体细胞的操作液中与供体细胞粘合形成体-卵细胞；操作液中植物凝集素浓度为0. 5-5mg/ml的；(5)、将粘合好的体-卵细胞移入融合激发液中平衡1-3分钟，再移入到融合槽中进行电融合同时激活。上述步骤(2)中所述融合液中，含有浓度为0. 2…0. 5mmol/L的甘露醇、浓度为0. 5 - 2mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、浓度为0. 01g/L的聚乙烯醇。上述步骤(5)中所述融合激发液中含有浓度为0. 2 w0. 5mmol/L甘露醇、浓度为 0. 05 w 0. 2mmol/L CaCl2 2H20、浓度为 0. 05 …0. 2mmol/L Mg C12*6H20、浓度为0. 5 - 2mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、浓度为0. 01g/L聚乙烯醇。本发明的进一步改进在于，在进行步骤(I)前先将所述两枚半卵细胞分别放入含、有植物凝集素的操作液中3-8秒。
权利要求
1.ー种动物体细胞核移植中的融合方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、将两枚半卵细胞放入植物凝集素浓度为O.5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵细胞对； (2)、将粘合好的卵-卵细胞对放入融合液中平衡1-3分钟； (3)、将平衡后的卵-卵细胞对放入电融合槽中电融合，并施加交流场对卵-卵细胞对进行瞬间定位； (4)、将融合好的卵-卵细胞对移入含有供体细胞的操作液中与供体细胞粘合形成体-卵细胞； (5)、将粘合好的体-卵细胞移入融合激发液中平衡1-3分钟，再移入到融合槽中进行电融合同时激活。
2.根据权利要求I所述的动物体细胞核移植中的融合方法，其特征在于，在进行步骤(O前先将所述两枚半卵细胞分别放入含有植物凝集素的操作液中3-8秒。
3.根据权利要求I所述的动物体细胞核移植中的融合方法，其特征在于，步骤(2)中所述融合液中，含有浓度为O. 2⑷O. 5mmol/L的甘露醇、浓度为O. 5 - 2mmol/L的4-羟こ基哌嗪こ磺酸、以及浓度为O. Olg/L的聚こ烯醇。
4.根据权利要求I所述的动物体细胞核移植中的融合方法，其特征在于，步骤(5)中所述融合激发液中含有浓度为O. 2⑷O. 5mmol/L甘露醇、浓度为O. 05 - O. 2mmol/LCaCl2 · 2H20、浓度为 O. 05 ^ O. 2mmol/LMg Cl2 · 6H20、浓度为 O. 5 ^ 2mmol/L 4-羟こ基哌嗪こ磺酸、浓度为O. 01g/L聚こ烯醇。
全文摘要
本发明公开了一种动物体细胞核移植中的融合方法，包括以下步骤(1)将两枚半卵细胞放入植物凝集素浓度为0.5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵细胞对；(2)将粘合好的卵-卵细胞对放入融合液中平衡1-3分钟；(3)将平衡后的卵-卵细胞对放入电融合槽中电融合，并施加交流场对卵-卵细胞对进行瞬间定位；(4)将融合好的卵-卵细胞对移入含有供体细胞的操作液中与供体细胞粘合形成体-卵细胞；(5)将粘合好的体-卵细胞移入融合激发液中平衡1-3分钟，再移入到融合槽中进行电融合同时激活。本发明所采用的方法先将两个半卵细胞融合，再将融合后的卵-卵细胞与供体细胞融合，增大卵细胞与供体细胞的接触面积，操作上更加简单。
文档编号C12N15/873GK102703511SQ20121019440
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月10日 优先权日2012年6月10日
发明者吴珍芳, 周秀, 周荣, 石俊松, 罗绿花 申请人:广东温氏食品集团有限公司