专利名称：一种蚬科贝类线粒体coi基因扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蚬科线粒体COI [the cytochrome c oxidase I]基因的扩增引物。
背景技术：
蚬科(Corbiculacea)隶属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida),广泛分布于除南极洲外各大洲水域,种类不多,全世界共有4属约60种，中国已知约5种。营底栖生活，主要栖息于河川和湖沼的泥沙底，少数种类栖息于红树林的泥底。蚬科物种在维持水域生态平衡中具有重要作用，部分物种还可以作为检测海洋有毒污染物tributyltin (TBT)的指示工具。一些物种肉食鲜美，营养价值高，可供食用，亦可入药，是鱼类、水禽的天然饵料，并可做为农田肥料，具有重要的经济价值。然而由于蚬科的贝壳外部形态高度可塑性和近缘种间高度相似性，利用形态特征对蚬科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些近缘物种，单利用形态特征很难区分开来。 近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效的方法。线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中性进化等特性，在分子遗传学研究中发挥着重要作用。其中，COI基因作为进化速率相对较快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用，已成为区分物种和研究物种进化关系的理想基因。因此，利用mtCOI基因对蚬科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法。尽管蚬科物种mtCOI序列比较保守，但种间变异度较大，使得COI非特异性扩增引物的扩增效率低下，有些物种根本无法扩出，以致阻碍了分子技术的使用。因此，蚬科线粒体COI基因扩增引物的筛选，对利用分子方法鉴定蚬科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用COI基因研究蚬科系统地理学和开发、保护蚬科种质资源提供技术条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种蚬科线粒体COI基因适用性好的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。本发明根据蚬科物种mtCOI序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验筛选出蚬科mtCOI基因的扩增引物。采用本发明的蚬科线粒体mtCOI基因的扩增引物，可以有效的扩增出蚬科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究蚬科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护蚬科种质资源具有重要意义。
具体实施例方式本发明的蚬科线粒体COI基因的扩增引物的筛选方法采用三个步骤a、利用COI通用扩增引物(LC01490F和HC02198R，Folmer 1994)扩增出部分蚬科物种的COI序列；b、从上述得到的部分蚬科COI序列中，通过比对找出保守的序列片段，合成多套扩增引物序列；C、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增蚬科线粒体COI基因效果最好的一对引物。下面结合实例对本发明作进一步说明I.样品采集于2002年 2011年，从中国南北沿海共采集蚬科3个属4个种类的126个个体。2. DNA提取用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。COI通用扩增引物扩增利用Folmer于1994年设计的COI通用扩增引物
LC01490F 5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 ’HC02198R 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ’对上述采集的蚬科126个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不 同，退火温度范围为48 52°C。扩增产物经I. 5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得2个种类20个个体的COI序列，其长度约为650bp，其余个体均未扩增出。3.序列比对利用CLUSTALW软件将上述测得的20个COI序列进行比对，找出比
较保守、碱基变异度最小的序列片段。4.弓丨物合成根据上述的比对结果,利用引物设计软件Primer Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出6对扩增引物。5.引物扩增将上述设计的6对扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的蚬科4个种类的126个个体。不同物种的PCR热循环退火温度不同，PCR热循环退火温度范围为46 52°C。扩增产物用I. 5倍的琼脂糖电泳进行检测。6.引物扩增结果上述6对扩增引物中，3对引物无法扩增出上述任何蚬科个体，I对引物只能扩增出12个个体，I对引物只能扩增出25个个体，另一对引物能够扩增出蚬科全部的126个个体，扩增效果非常好。特异性扩增引物序列经过大量的重复试验，最终筛选出上述扩增蚬科COI基因效果最好的一对引物序列为 COIXF (5，-TCATAAAGATATTGGGACTCT -3’ )、⑶IXR(5’ -GGGTGACCAAAAAATCAAAAT-3’ )。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为650bp。7.特异性扩增引物扩增条件上述COIXF与COIXR扩增引物的IOiiL PCR反应体系 S:liiL10XbufTer Mg2+，I y L DNTP (2mM), 0. 6 u L Mgcl2 (25mM)，I y L 弓I 物COIXF (10 ii M)，I ii L 引物 COIXRdO u M), 0. 08 u L r-Taq (5u/ u L), I U L DNA 模板，4. 32 u L双蒸水。PCR热循环的退火温度为46 52°C。
权利要求
1.一种蚬科贝类线粒体COI基因的扩增引物COIXF和C0IXR，其特征是用IOiIl PCR体系在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
2.如权利要求I所述的蚬科线粒体部分COI序列扩增的引物特征是COIXF5’ -TCATAAAGATATTGGGACTCT-3’， COIXR :5’ -GGGTGACCAAAAAATCAAAAT-3’。
3.如权利要求I所述的IOiUPCR体系，其特征是lii LlOXbuffer Mg2+, I u LDNTP(2mM),0. 6 u L Mgcl2(25mM)，Iy L 引物 C0IXF(10y M)，Iy L 弓I 物 C0IXR(10y M)，0. 08u L r-Taq (5u/ u L), I U L DNA 模板，4. 32 u L 双蒸水。
4.如权利要求I所述的特定的PCR扩增条件，其特征为94°C预变性5min，94°C变性lmin，46 52°C退火温度lmin，72°C延伸lmin，共35个循环，最后72°C延伸IOmin0
5.如权利要求I所述的目标片段，其特征是长度为650bp。
全文摘要
本发明利用由通用引物扩增得到的20条蚬科序列，利用CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，用126个蚬科个体在10μl体系下反复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种蚬科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，其特征是COIXF5’-TCATAAAGATATTGGGACTCT-3’COIXR5’-GGGTGACCAAAAAATCAAAAT-3’采用本发明的蚬科贝类线粒体COI引物，可以有效地扩增出蚬科贝类不同物种的目的片段，对利用分子方法鉴定蚬科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用COI基因研究蚬科系统地理学和开发、保护蚬科种质资源提供技术条件。
文档编号C12N15/11GK102776181SQ20121019455
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者于贞贞, 孔令锋, 李琪 申请人:中国海洋大学