专利名称：一种紫云蛤科贝类线粒体coi基因扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种紫云蛤科线粒体COI [the cytochrome c oxidase I]基因的扩增引物。
背景技术：
紫云蛤科(Corbiculacea)隶属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida)，全部海产，广泛分布于中国沿海，日本、菲律宾和印度洋。该科贝类种类较多，中国已知约25种，通常埋栖于潮间带至浅海细沙或泥沙质海底。紫云蛤科的贝类多数肉质鲜美，营养价值高，具有重要的经济价值。例如，中国紫蛤、双线紫蛤、紫彩血蛤和尖紫蛤都是名贵的海珍品。然而由于紫云蛤科种类的贝壳外部形态高度可塑性和外套窦形 态高度相似性，利用形态特征对紫云蛤科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些亲缘物种，单利用形态学数据很难区分开来。而且，近年来由于过度捕捞等原因，其种质资源已明显消退，紫云蛤种质资源合理利用和保护亟不可待。关于紫云蛤的增养殖和生物学特征等方面研究已有报道，但是基于分子标记的遗传多样性的研究开展较少，这种现状极大的阻碍了紫云蛤种质资源的开发利用和保护。线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中性进化等特性,在分子遗传学研究中发挥着重要作用。其中，COI基因作为进化速率相对较快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用，已成为区分物种和研究物种进化关系的理想基因。因此，利用mtCOI基因对紫云蛤科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法。由于Folmer (1994)设计的通用引物C0IL1490和C0IH2198在紫云蛤中扩增结果不理想(即琼脂糖电泳检测大部分个体无扩增条带)，因此，开发研究紫云蛤科线粒体COI基因扩增专用引物，对利用分子方法鉴定紫云蛤科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用COI基因保护紫云蛤科种质资源提供技术条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫云蛤科线粒体COI基因适用性好的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。本发明根据紫云蛤科物种mtCOI序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验筛选出紫云蛤科mtCOI基因的扩增引物。采用本发明的紫云蛤科线粒体mtCOI基因的扩增引物，可以有效的扩增出紫云蛤科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究紫云蛤科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护紫云蛤科种质资源具有重
要意义。
具体实施例方式本发明的紫云蛤科线粒体COI基因的扩增引物的筛选方法采用三个步骤a、利用COI通用扩增引物(LC01490F和HC02198R，Folmer 1994)扩增出部分紫云蛤科物种的COI序列山、从上述得到的部分紫云蛤科COI序列中，通过比对找出保守的序列片段，合成多套扩增引物序列、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增紫云蛤科线粒体COI基因效果最好的一对引物。下面结合实施例对本发明作进一步说明I.样品采集于2002年 2010年，从中国南北沿海共采集紫云蛤科4个属10个种类的200个个体。2. DNA提取用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。COI通用扩增引物扩增利用Folmer于1994年设计的COI通用扩增引物LC01490F:5， -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
HC02198R 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ’对上述采集的紫云蛤科200个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同，退火温度范围为42 56°C。扩增产物经I. 5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得5个种类64个个体的COI序列，其长度约为650bp，其余个体均未扩增出。3.序列比对利用CLUSTALW软件将上述测得的64个个体的COI序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。4.弓丨物合成根据上述的比对结果,利用引物设计软件Primer Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出3对扩增引物。5.引物扩增将上述设计的6对扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的紫云蛤科10个种类的200个个体。不同物种的PCR热循环退火温度不同，PCR热循环退火温度范围为48 54°C。扩增产物用I. 5倍的琼脂糖电泳进行检测。6.引物扩增结果上述3对扩增引物均可扩增出上述紫云蛤科个体，I对引物能扩增出72个个体，I对引物只能扩增出120个个体，另一对引物能够扩增出185个个体，扩增
效果非常好。特异性扩增引物序列经过大量的重复试验，最终筛选出上述扩增紫云蛤科COI基因效果最好的一对引物序列为C0IZGF(5’ -ACAAATCATTAAGGATAITGG-3’)、C0IZGR(5’ -GTCCGAAGAATCAAAACAAATG-3’ )。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为650bp。7.特异性扩增引物扩增条件上述COIZGF与COIZGR扩增引物的10 U LPCR反应体系为1 U LlOXbuffer Mg2+, I u L DNTP (2mM), 0. 6 u L Mgcl2 (25mM)，I y L 弓I 物COIZGF (10 iiM)，Iii L 引物 COIZGR (IOiiM)，0.08 ii L r-Taq (5u/ u L), I U L DNA 模板，
4.32 u L双蒸水。PCR热循环的退火温度为48 54°C。
权利要求
1.一种紫云蛤科贝类线粒体COI基因的扩增引物COIZGF和COIZGR，其特征是用IOylPCR体系在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
2.如权利要求I所述的紫云蛤科线粒体部分COI序列扩增的引物特征是COIZGF :5’ ACAAATCATTAAGGATATTGG-3’COIZGR :5’ -GTCCGAAGAATCAAAACAAATG-3，
3.如权利要求I所述的IOiUPCR体系，其特征是lii LlOXbuffer Mg2+, I u LDN< >TP(2mM),0. 6 u L Mgcl2(25mM)，Iy L 引物 C0IXF(10y M)，Iy L 弓I 物 C0IXR(10y M)，0. 08u L r-Taq (5u/ u L), I U L DNA 模板，4. 32 y L 双蒸水。
4.如权利要求I所述的特定的PCR扩增条件，其特征为94°C预变性5min，94°C变性lmin, 48 54°C退火温度lmin, 72°C延伸lmin,共35个循环，最后72°C延伸IOmin0
5.如权利要求I所述的目标片段，其特征是长度为650bp。
全文摘要
本发明利用由通用引物扩增得到的64条紫云蛤科序列，利用CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，用200个紫云蛤科个体在10μl体系下反复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种紫云蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，其特征是COIZGF5’-ACAAATCATTAAGGATATTGG-3’COIZGR5’-GTCCGAAGAATCAAAACAAATG-3’采用本发明的紫云蛤科贝类线粒体COI引物，可以有效地扩增出紫云蛤科贝类不同物种的目的片段，扩增效率大于90％，能够满足紫云蛤科遗传多样性研究的需要，对紫云蛤科的资源保护和利用、多样性评估、遗传育种等方面将起到重要作用。
文档编号C12N15/11GK102776182SQ20121019455
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者于贞贞, 孔令锋, 李琪 申请人:中国海洋大学