植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用。实验证明，将序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的GmNF-YC14基因的重组表达载体pAHCPSK-GmNF-YC14转化拟南芥得到的T3代纯合转基因植株，在耐旱性实验中的存活率为84.6%-86.4%，而野生型植株和转空载体植株的存活率分别为47.6%和46.2%；在耐盐性实验中的存活率为86.8%-88.1%，而野生型植株和转空载体植株的存活率分别为43.6%和42.4%。本发明所提供的GmNF-YC14蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义。
【专利说明】植物耐逆性相关蛋白GmNF-YCM及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中的一种耐逆性相关的蛋白及其编码基因和应用，特别是一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用，该蛋白质GmNF_YC14来源于大豆，具有提高植物耐旱性和耐盐性的能力。
【背景技术】
[0002]干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的重要任务之一。
[0003]在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004]在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类:第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物； 第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
[0005]转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。
[0006]目前已知在植物中与胁迫相关`的转录因子主要有:具有AP2结构域的 AP2 (APETALA2)/EREBP (乙烯应答兀件结合蛋白，ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF (CCAAT binding factor)类转录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的 MYB 家族。
[0007]NF-Y是一类结合顺式作用元件CCAAT-box的转录因子，特异的识别并结合许多真核生物组成型、诱导性和细胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的顺式作用元件 CCAAT-box,进而在转录水平调控这些基因的表达。NF-Y是由NF_YA、NF_YB和NF-YC三个不同亚基组成的杂合三聚体。NF-YB蛋白与NF-YC蛋白通过彼此的HFM保守域，采用头尾相接的方式形成异源二聚体互作平台，吸引NF-YA蛋白结合到这个二聚体平台从而形成具有活性的异源三聚体核转录因子。NF-Y通过NF-YA亚基上的DNA结合域结合到靶基因启动子部分的CCAAT盒，执行转录激活或转录抑制功能。NF-Y的三个亚基的保守域分别具有不同的蛋白结构域，其中NF-YA保守域具有DNA结合结构域(DNA binding domain)和与NF-YB/ C异源二聚体互作结构域(subunit interaction domain)。NF-YB和NF-YC蛋白保守域则由组蛋白折叠基序(Histone-fold motif)构成。其中NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相似， 而NF-YC与H2A组蛋白折叠基序相似，组蛋白基序由三个a螺旋和两个环组成，负责H2A/ H2B 二聚体的形成。[0008]由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键转录因子促进多个功能基因的表达， 增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmNF_YC14及其编码基因与应用。
[0010]本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白，来源于大豆(Glycine max L.),是一种结合CCAAT-box的核转录因子蛋白名称为GmNF-YC14，该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质:
[0011]a)由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012]b)将序列表序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质:耐旱性和耐盐性。
[0013]序列表序列I所示的氨基酸序列由166个氨基酸残基组成，第16位至第79位的氣基酸序列为保守的组蛋白折置基序。
[0014]为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015]表1标签的序列
[0016]
标签残基序列Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL
[0017]上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2中第21-521位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018]编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
[0019]所述蛋白质的编码基因为如下I)或2)或3)或4)的基因:
[0020]I)其核苷酸序列是序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的DNA分子;
[0021 ] 2 )其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；
[0022]3)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0023]4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA 分子。
[0024]序列表序列2由580个脱氧核糖核苷酸组成，是大豆GmNF_YC14蛋白的全长cDNA 序列，其中的第21位至第521位为开放阅读框。
[0025]所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗； 还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在 65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 XSSC,0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0026]含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
`[0027]可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pR0KI1、pBin438、pCAMBIA1302、 PCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391_Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos 基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0028]含有所述基因的所述重组载体具体可为YEP-GAP-GmNF-YC 14或 pAHCPSK-GmNF-YC14 ；
[0029]所述YEP-GAP-GmNF-YC 14可为将所述基因插入载体YEP-GAP得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2中第21位至第518位核苷酸序列所示的DNA分子插入载体YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间得到的重组表达载体；
[0030]所述pAHCPSK-GmNF-YC14可为将所述基因插入载体pAHCPSK得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的DNA分子插入载体pAHCPSK的Sma I和SpeI酶切位点之间得到的重组表达载体。
[0031]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0032]本发明所述的培育转基因植物的方法是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
[0033]在上述方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。
[0034]在上述方法中，所述双子叶植物具体可为拟南芥。
[0035]在上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
[0036]本发明保护所述蛋白在作为转录因子中的应用。
[0037]实验证明，将序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的GmNF_YC14基因的重组表达载体pAHCPSK-GmNF-YC14转化拟南芥得到的T3代纯`合转基因植株，在耐旱性实验中(将正常生长萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株枯萎时，再复水一周)的存活率为84.6%-86.4%，而野生型植株和转空载体植株的存活率分别为47.6%和46.2% ;在耐盐性实验中(将正常生长萌发15天的幼苗浇IOOmM NaCl水溶液，直至野生型植株枯萎时，再复水一周)的存活率为86.8%-88.1%，而野生型植株和转空载体植株的存活率分别为43.6% 和 42.4%o
[0038]本发明所提供的GmNF_YC14蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义，为人为控制抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育高抗逆性如强耐旱性和强耐盐性植物品种中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为实时荧光定量PCR分析不同胁迫处理下GmNF_YC14基因的表达图谱。其中， A-F依次分别为脱落酸、干旱、低温、高温、盐溃和乙烯的胁迫处理，横坐标为胁迫的时间，纵坐标为GmNF-YC14基因的相对表达量。
[0040]图2为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特异性和激活特性的原理示意图。
[0041]图3为重组载体pAHCPSK-GmNF-YC14的结构示意图。
[0042]图4为转基因拟南芥植株cDNA水平的PCR鉴定电泳图。其中，泳道M为分子量标准，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道C为哥伦比亚生态型拟南芥Col-0，泳道1-5为待鉴定植株，具有预期条带的为转基因植株。[0043]图5野生型和转基因拟南芥耐旱性比较。其中，图A为干旱处理前野生型(WT)和转基因拟南芥株系(11、!12、113)植株；图B为干旱处理14天，复水3天后的野生型(WT) 和转基因拟南芥株系(TL1、TL2、TL3)植株。
[0044]图6野生型和转基因拟南芥耐盐性比较。其中，图A为高盐处理前的野生型(WT) 和转基因拟南芥株系(11、!12、113)植株；图B为高盐处理后，复水7天后的野生型(WT) 和转基因拟南芥株系(TL1、TL2、TL3)植株。
【具体实施方式】
[0045]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
[0048]下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0049]大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号:中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献:孙嘯，董建辉，陈明，徐兆师，叶兴国，李连城，曲延英，马有志.2008.大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析.作物学报，34(8): 14751479。
[0050]载体YEP-GAP:中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供；参考文献: Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， Abe H， Miura S， Yamaguch1-Shinozaki K， Shinozaki K.Two transcription factors, DREBl and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought—and low-temperature-responsive gene expression,respectively,in Arabidopsis，Plant Cell 1998 Aug;10(8):1391-1406。
[0051]载体pAHCPSK:中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供；参考文献:高东尧.2010.小麦穗发芽抗性相关Vp-1B和AIP2基因的克隆及功能分析.[博士`学位论文].吉林大学。
[0052]实施例1、GmNF-YCH基因的克隆
[0053]一、mRNA 的分离
[0054]将水培生长10天的大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号四叶期幼苗干旱处理2小时,用液氮速冻，-80°C保存备用。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)进行mRNA的分离。第一链cDNA合成用反转录酶XL (AMV)0采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0055]二、GmNF_YC14基因全长序列的获得
[0056]通过5’ RACE和3’ RACE的方法获得大豆CCAAT-box的核转录因子B族基因全长 cDNA序列，如序列表序列2所示，名称为GmNF-YC14基因，其开放阅读框架为自序列表序列 2的5'端第21位至第521位核苷酸，其翻译的蛋白GmNF-YC14的氨基酸序列如序列表序列I所示，由166个氨基酸残基组成，该蛋白的第16位至第79位氨基酸序列为保守的组蛋白折叠基序，将该蛋白的氨基酸序列在Genabnk上进行比对，与拟南芥中的蛋白AtNF_YC13 (At5g43250)具有较高同源性，而在大豆中未发现同源蛋白，证明GmNF-YC14蛋白是一个新的蛋白。
[0057]实施例2、实时荧光定量PCR分析GmNF_YC14基因的表达特性[0058]一、胁迫处理
[0059]将盆栽的苗龄为10天的大豆铁丰8号幼苗，进行以下处理:
[0060](I)脱落酸处理(图1A):置于IOOii M的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养0.5小时、 I小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，_80°C保存备用。
[0061](2)干旱处理(图1B):取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养0.5小时、I小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，_80°C保存备用。
[0062](3)低温处理(图1C):置于4°C培养箱，光照培养0.5小时、I小时、2小时、5小时、 12小时、24小时后取出并用液氮速冻，_80°C保存备用。
[0063](4)高温处理(图1D):置于42°C下，光照培养0.5小时、I小时、2小时、5小时、12
小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0064](5)盐溃处理(图1E):置于200mM的NaCl溶液中，光照培养0.5小时、I小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80°C保存备用。
[0065](6)乙烯(EH)处理(图1F):置于50 ii M的溶液中，光照培养0.5小时、I小时、 2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，_80°C保存备用。
[0066]对照的处理:直接取未经任何处理的大豆幼苗_80°C冻存作为对照(0小时)。
[0067]二、mRNA 的分离
[0068]米用Quikprep Micro `mRNA Purification Kit (Pharmacia)对步骤一的材料分别进行mRNA的分离纯化。
[0069]三、反转录为cDNA
[0070]采用R103_Quant_Reverse_Transcriptase (天根生化科技(北京)有限公司)将步骤二纯化的mRNA反转录为cDNA。
[0071]四、实时荧光定量PCR
[0072]将步骤三获得的cDNA稀释50倍后用作实时荧光定量PCR的模板。根据GmNF_YC14 基因的序列，在其3'端非编码区设计特异引物对F和R对样品进行实时荧光定量PCR扩增，分析该基因对各种处理的应答情况，以actin为内参基因，引物为actin-F和actin-R。
[0073]实时荧光定量PCR在ABI PRIStf 7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法，即2_AACT计算相对表达量。
[0074]A AGt ^ ^T.Target ^T.Actin^ Time x ^ ^T.Target ^T.Actin^ Time 0
[0075]Time x表示任意时间点，Time ^表示经actin校正后I倍量的目标基因表达。
[0076]引物F:5’ -TCTCAGCCCACCAAGCCCGAT-3’(对应序列表序列 2 的第 303-323 位)；
[0077]引物R:5’ -GGTACTGGCGAITGGGCT-3’(对应序列表序列 2 的第 488-505 位)；
[0078]引物actin-F:5，-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3，；
[0079]引物actin-R:5，-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3，。
[0080]结果如图1中的A-F所示，GmNF-YCH基因对上述6种胁迫中的干旱、高盐、高温和乙烯胁迫表现出响应。干旱、高盐和乙烯胁迫时，随着处理时间的延长，基因表现上调；高温胁迫时，基因的表达则是先下调后上调。
[0081 ] 实施例3、GmNF-YCH的激活特性
[0082] 用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图2所示，将CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHIS1-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin (minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(His3、LacZ和 URA3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP (不含激活功能)分别转化到连有CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体 CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。
[0083]YPD液体培养基:细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L,细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone) 20g/L,调节pH至5.8,121 °C /15min灭菌，降至60°C以后加入40%的Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0084]SD/HisYUraVTrp-选择性培养基:不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6.7g/L,营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml,琼脂粉 (Bacteriological agar)20g/L,调节 pH 至 5.8,121°C /15min 灭菌,降至 60°C后加入 40% Glucose，使其终浓度为20g/L。
[0085]营养缺陷型混合物(Drop-outmix): (IOX ):L-1soleucine (异亮氨酸)300mg/L, L-Valine (纟颜氨酸)1500mg/L, L-Adenine (腺嘌呤)200mg/L, L-Arginine (精氨酸)200mg/L, L-Histidine Hcl monohydrate (组氨酸)200mg/L,L-Leucine (亮氨酸)1000mg/L,L-Lysine Hcl (赖氨酸)300mg/L, L-Methionine (甲硫氨酸)200mg/L, L-Phenylalanine (苯丙氨酸) 500mg/L, L-Threonine (苏氛酸)2000mg/L, L-Tyrosine (酿氛酸)300mg/L。
[0086]lXPEG/LiAc:50% PEG3350 8ml, IOXTE buffer lml, IOXLiAc 1ml。
[0087]IOXTE Buffer:100mM Tris-HcI, IOmM EDTA、pH=7.5，121°C高压灭菌，室温保存。
[0088]lXTE/LiAc: 10XTE buffer lml, IOXLiAc lml，ddH20 8ml。
[0089]Z Buffer =Na2HPO4 ? 7H20 16.lg/L, NaH2PO4 ? H2O 5.5g/L, KCl 0.75g/L, MgSO4 ? 7H200.246g/L，调节 pH 至 7.0,121°C /15min 灭菌，4°C保存。
[0090]X-gal 储存液(X-gal Stock Solution):用 N, N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20°C贮存。
[0091]含有X-gal 的 Z buffer 缓冲液 100ml (Z buffer with X_gal),现用现配:Z buffer98ml, 0 -疏基乙醇(0-mercaptoethanol) 0.27ml, X-gal 储存液(X-gal stock solution) 1.67ml。
[0092]IOXLiAc: IOOMm Tris-HcI, IOOmM EDTA, pH=7.5。121°C高压灭菌、室温保存。
[0093]—、重组表达载体的构建
[0094]1、GmNF-YC 14 基因的获得
[0095]根据GmNF-YC14基因的序列设计引物GmNF-YC14_BHI和GmNF-YC14_XI，引物末端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，以大豆品种铁丰8号的cDNA为模板，PCR扩增GmNF_YC14 基因，将PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0096]GmNF-YCH-BH1:5’ -TTTGGATCCATGGCGGAGGAAGAAGAAAG-3’ ；
[0097]GmNF-YCH-X1:5’ -GGTCTCGAGAGACTCATCTACGGGTACTGG-3’。
[0098]米用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa 公司，CodeN0.:DV807A)回收纯化517bp的PCR产物。
[0099]2、重组表达载体的构建
[0100]①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤I回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
[0101]②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收载体骨架；
[0102]③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
[0103]④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(购自Clontech公司)，37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组载体YEP-GAP-GmNF-YC14 (即在 YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表序列2自5’端第21-518位核苷酸所示的DNA片段)。
[0104]二、GmNF_YC14的体内结合特异性和激活特性的验证
[0105]1、酵母报道子的构建
[0106](I)正常双重酵母报道子的构建
[0107]DNA 片段 A (含 4 个 CCAAT 元件:TTTAACCAATCAGAAA):
[0108]5’ -GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3’ (CCAAT 的核心序列:CCAAT)。 DNA片段A的核苷酸序列见序列表的序列3。
[0109]将DNA 片段 A 构建到 pHis-1 载体(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司)的Pminms3启动子上游，得到重组载体pHis-1-CCAAT，用Xho I`和Nco I内切酶将 pHi s-1-CCAAT载体切成线状。
[0110]将DNA 片段 A 构建到 pLacZi 载体(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司)PCYCI启动子上游，得到重组载体pLacZ1-CCAAT，用Xho I和Nco I内切酶将 pLacZ1-CCAAT载体切成线状。
[0111]先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞(YM4271株系， MATCHMAKEROne-Hybrid System, Clontech公司)内，获得能在SD/His-培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有 4个重复CCAAT元件的pLacZ1-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His_/ Ura-培养基上，选择获得含有pHis-1-CCAAT和pLacZ1-CCAAT的正常双重酵母报道子。
[0112](2)突变体双重酵母报道子的构建
[0113]DNA 片段 B (含 4 个 mCCAAT 元件):5 ’ -GAATTC-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-GT CGAC-3’ (MDRE:将4个CCAAT元件的核心序列CCAAT突变成TTTTA)。DNA片段B的核苷酸序列见序列表的序列4。
[0114]用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤(I )，得到突变体双重酵母报道子。
[0115]2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析
[0116]⑴接种酵母菌株(YM4271株系)到lml YTO液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30°C /250rpm摇过夜，测 0D600=1.7-1.8 (计数约 4 X IO7 个 /mL)；
[0117](2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30°C /250rpm培养，约3小时(至0D600=0.5±0.1)，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积 I X TE 悬浮，1000g/5min 离心；[0118]⑶吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的I X TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；
[0119]⑷取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液:0.1 ii g YEP-GAP-GmNF-YC14、0.1mg ssDNA (鲑鱼精 DNA，SiTaa),0.6mlPEG/LiAc 高速振荡 I 分钟， 300C /200rpm振荡培养30分钟；
[0120](5)加入70ul DMSO (siTaa#D8779)，轻轻倒置混匀，42°C热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min ；
[0121](6)吸弃上清，加入0.5ml IXTE buffer悬浮细胞；
[0122](7)用接种环蘸取悬浮液,分别在含有0、15mmol/L 3_AT的SD/His_/Ura_/Trp_选择性培养基上画线培养。
[0123](8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。
[0124]⑶颠倒放置于培养箱中，30° C培养3 — 4天。
[0125](W)结果发现在Ommol/L 3_AT的SD/His7Ura7Trp_的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/ L3-AT的SD/His7Ura_/Trp_的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。
[0126]3、半乳糖苷酶活性检测
[0127]⑴从Ommol/L 3_AT的SD/His7Ura_/Trp_的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至Yro液体培养基中，于30°C振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s ；
[0128]⑵弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻lOmin，取出使其自然融解，加 50ul Z/X-gal溶液，30°C温育，结果发现正常的酵母报道子在6_8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子GmNF-YC14能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了 Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了 GmNF-YC14的体内结合特异性和激活功能。
[0129]实施例4、利用GmNF_YC14基因提高植物的耐旱性和耐盐性
[0130]—、重组表达载体的构建
[0131]l、GmNF-YC14 基因的克隆
[0132]根据GmNF-YC14基因的序列设计引物对(GmNF-YC14_PAHCPSKF和 GmNF-YC14-PAHCPSKR),引物末端分别引入Sma I和SpeI酶切识别位点，以大豆铁丰 8号(Glycine max L.) cDNA为模板PCR扩增GmNF_YC14基因，将PCR扩增产物进行 1.2 琼脂糖凝胶电泳，米用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa 公司，CodeN0.:DV807A)回收纯化500bp左右的条带。
[0133]GmNF-YCH-PAHCPSKF:5’ -TCCCCCGGGATGGCGGAGGAAGAAGAAAG-3’ ；
[0134]GmNF-YCH-PAHCPSKR: 5’ -CTAGACTAGTCTAAGACTCATCTACGGGTAC-3’。
[0135]2、重组表达载体的构建
[0136]①用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切步骤I回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
[0137]②用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切载体pAHCPSK，回收载体骨架；[0138]③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；[0139]④将步骤③的连接产物电击转化T0P10菌株(购自北京天根公司)，37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组载体pAHCPSK-GmNF-YC14 (即在 pAHCPSK的Sma I和SpeI酶切位点之间插入了序列表序列2自5’端第21-521位核苷酸所示的DNA片段,其结构示意图如图3所示)。
[0140]二、转基因植物的获得
[0141]1、将重组载体pAHCPSK-GmNF-YC14转化农杆菌C58C1 (北京拜尔迪生物技术公司购买)，得到重组农杆菌。
[0142]2、将步骤I得到的重组农杆菌接种于LB(含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素，50mg/L庆大霉素)液体培养基中，28°C、3000rpm培养约30小时；
[0143]3、将步骤2的菌液转至LB (含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素，50mg/L庆大霉素)中，28°C、300rpm培养约14小时(菌液0D600达到1.5-3.0)；
[0144]4、收集步骤3的菌体，4°C、4000g离心lOmin，用含10%蔗糖MS液体培养基(含
0.02%silwet)稀释至 0D600 约为 0.8-1.0 ；
[0145]5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司购买)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，单株收获T1代种子。
[0146]6、将T1代种子消毒后，平铺于MS培养基上(含50ii g/mL卡那霉素)，23°C、16h光照/8h黑暗培养7天后，挑选抗卡那霉素的转基因拟南芥植株(表现为四片真叶为绿色)，将 T1代抗性转基因拟南芥植株转至MS固体培养基(不含卡那霉素)上继续培养7天后移入土壤中，按单株收获T2代种子。按照同样的方法种植筛选T2代种子，移栽卡那霉素抗性分离比为3:1的T2代株系10个,并单株收获T2代株系内各单株上所结T3代种子,随机取5个 T3代株系的种子按照同样的方法进行卡那霉素抗性筛选，得到3个T3代不再产生卡那霉素抗性分离的纯合转基因株系。繁殖纯合转基因株系的植株和种子，进行下述的PCR鉴定和进一步的耐逆性鉴定。
[0147]同时，以相同的方法转化空载体pAHCPSK作为空载体对照，得到3个T3代纯合的转空载体对照株系。
[0148]T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
[0149]三、转基因植株的PCR鉴定
[0150]取步骤二获得的T3代纯合转基因株系植株，在cDNA水平进行PCR鉴定，引物对为 5’ -ATGGTTATGGCGGAGGAAG-3’ 和 5’ -CTAAGACTCATCTACGGGTAC-3’ ；预期条带为 501bp ;部分结果如图4所示。
[0151 ] 取步骤二获得的T3代纯合转空载体对照株系植株，经DNA水平的PCR鉴定均为阳性。
[0152]四、转基因植物的耐旱性鉴定和耐盐性鉴定
[0153]1、耐旱性鉴定
[0154]分别将步骤三获得的PCR鉴定呈阳性的纯合T3代转基因株系(TL1、TL2、TL3)植株、步骤三获得的PCR鉴定呈阳性的纯合T3代转空载体对照株系植株(CK)和非转基因的野生型拟南芥Col-O (WT)各60株，分别按照如下步骤的方法进行耐旱性鉴定(设置三次重复实验，结果取平均值):
[0155]将正常生长的萌发15天的幼苗不浇水，直至WT植株枯萎(2周左右)，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率结果如表2和图5所示。
[0156]表2.转基因拟南芥植株耐旱性鉴定的存活率统计结果
[0157]
【权利要求】
1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质:a)由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质:耐旱性和耐盐性。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述蛋白质的编码基因为如下I)或2)或 3)或4)的基因:1)其核苷酸序列是序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；`3)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为YEP-GAP-GmNF-YC14 或 pAHCPSK-GmNF-YC14 ；所述YEP-GAP-GmNF-YC14为将权利要求2或3所述的基因插入载体YEP-GAP得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2中第21位至第518位核苷酸序列所示的DNA分子插入载体YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间得到的重组表达载体；所述pAHCPSK-GmNF-YC14为将权利要求2或3所述的基因插入载体pAHCPSK得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的DNA分子插入载体pAHCPSK的Sma I和SpeI酶切位点之间得到的重组表达载体。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述双子叶植物为拟南芥。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于:耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
10.权利要求1所述蛋白在作为转录因子中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK103509093SQ201210213523
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2012年6月25日
【发明者】马有志, 徐兆师, 郑炜君, 李连城, 陈明 申请人:中国农业科学院作物科学研究所