专利名称：一种多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种属于生物技术和医药领域，是分子生物学研究的物质，在医药领域的具体应用，即多肽，尤其是涉及一种抑制血清糖皮质激素激酶家族(Serum andGlucocorticoid Induced Kinase family)的酶活性的多妝。
背景技术：
目前，以多肽为主的生物药物在世界范围内呈现出迅速推广的态势。多肽类生物药物药效显著，并能够治疗许多化合物类药品无法见效的遗传类疾病。血清糖皮质激素激酶家族(Serumand Glucocorticoid Induced Kinase family)是一种能够对多种激素和类激素分子产生快速反应的酶蛋白家族。它主要包括三种已知激酶，即血清糖皮质激素激酶甲(Serum and glucocorticoid inducible kinase I, SGK1)、血清糖皮质激素激酶乙(Serum and glucocorticoid inducible kinase 2, SGK2)和血清糖皮质激素激酶丙(Serum and glucocorticoid inducible kinase 3, SGK3),及它们的异构体。它们在细胞受体接触到相关激素或类激素物质后大量表达，它的活性在体内激素调节过程中具有重要作用。类激素物质在农药，化肥和食品添加剂等化工产品中广泛存在。这些类激素物质通过食物，皮肤等渠道进入人体，造成多种人体应激性反应。长期摄入含有较高激素或类激素物质的食物，会造成人体激素调节系统紊乱，并导致多种相关的疾病。同时，由于细胞老化和内分泌紊乱等原因所造成的内生性激素水平失常也会形成多种相关的疾病。血清糖皮质激素激酶家族是类激素物质对细胞的刺激过程中的重要信号传导酶。它直接参与多种激素与类激素物质对细胞的调控过程。对血清糖皮质激素激酶家族的抑制性调节能够有效缓解上述激素调节紊乱对人体健康造成的危害，是治疗相关疾病的潜在优秀药物。活性多肽，能防治血栓，高血压和高血脂，还能延缓衰老，提高肌体对肿瘤形成(Neoplasia)的免疫能力。从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的多肽。多肽用作药物载体，既可以用作药物载体的修饰剂，也可以作为药物载体的主要组成部分。多肽药物已引起我国的高度重视，我国制定的“十五”生物医药研究的重点方向之一就包括多肽药物。在未来将会有大量的多肽药物和试剂进入临床试验，部分将被批准生产销售。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种多肽，能够在细胞中抑制血清糖皮质激素激酶家族(Serum and Glucocorticoid Induced Kinase family)的酶活性，该多妝具有良好的水溶性和稳定性，在人体细胞对血清糖皮质激素及其类似物，以及性激素及其类似物反应紊乱的情况下，具有良好的调节作用。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是提供一种多肽，所述的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列。在本发明一个较佳实施例中，所述的多肽通过高特异性的竞争性抑制在细胞中抑制血清糖皮质激素激酶家族的酶活性。在本发明一个较佳实施例中，所述的PepSeq-I所示的氨基酸序列是通过脱氧核糖核酸在细胞内或者细胞外编码翻译表达获得，或通过氨基酸直接合成获得。在本发明一个较佳实施例中，所述的编码翻译表达PepSeq-I的脱氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列。在本发明一个较佳实施例中，所述的血清糖皮质激素激酶家族，包括血清糖皮质激素激酶甲、血清糖皮质激素激酶乙和血清糖皮质激素激酶丙，及血清糖皮质激素激酶甲、血清糖皮质激素激酶乙和血清糖皮质激素激酶丙的异构体。
在本发明一个较佳实施例中，所述的细胞为人体细胞，包括人体的胚胎细胞。在本发明一个较佳实施例中，所述的抑制为降低酶对下游靶蛋白进行生物催化反应的效率和能力。本发明的有益效果是本发明提供了一种多肽，与现有技术相比该多肽是第一个能够有效抑制血清糖皮质激素激酶家族的酶活性的抑制剂。本发明的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列，能够通过高特异性的竞争性抑制，显著降低血清糖皮质激素激酶家族的酶活性，从而增强人体细胞对糖皮质激素型化合物以及性激素类化合物的耐受性，该多肽具有良好的水溶性和稳定性，在人体细胞对糖皮质激素及其类似物，以及性激素及其类似物反应紊乱的情况下，具有良好的调节作用，可以作为治疗摄入性激素紊乱和内分泌性激素紊乱的潜在特效药物，对阿尔茨海默病、激素紊乱造成的皮疹、糖尿病以及其他由激素紊乱导致的疾病有潜在的治疗作用。
图I是本发明中pcDNA3. I载体的结构示意 图2是本发明中P印Seq-I对SGKl催化活性的抑制水平；
图3是本发明中P印Seq-I存在下SGKl对底物蛋白ENaC的催化活性；
图4是本发明中Kinase-Glo激酶发光检测激酶的活性效果图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。本发明提供了一种多肽，所述的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列，所述的PepSeq-I 所不的氨基酸序列为 N，-Gly Met Arg Ser Arg Ser His Ser Phe Thr Gly ThrSer-C'，所述的多肽是通过高特异性的竞争性抑制在细胞中抑制血清糖皮质激素激酶家族的酶活性。其中，PepSeq-I所示的氨基酸序列是通过脱氧核糖核酸在细胞内或者细胞外编码翻译表达获得，或通过氨基酸直接合成获得。该脱氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列，所述的 DNASeq-I 所不的序列为 5’-ggcatgagat cgaggtctca cagtttcact ggaacgtccagcggc-3'。
上述，细胞为人体细胞，包括人体的胚胎细胞；抑制为降低酶对下游靶蛋白进行生物催化反应的效率和能力。本发明中的血清糖皮质激素激酶家族，包括血清糖皮质激素激酶甲(SGKl)、血清糖皮质激素激酶乙(SGK2)和血清糖皮质激素激酶丙(SGK3)，及其异构体。血清糖皮质激素激酶甲(SGKl)的序列为
I aagtggggtt cataacagaa cagggatagc cgtctctggc tcgtgctctc atgtcatctc61 agagttccag cttatcagag gcatgtagca gggaggctta ttccagccat aactgggctc121 tacctccagc ctccagaagt aatccccaac ctgcatatcc ttgggcaacc cgaagaatga181 aagaagaagc tataaaaccc cctttgaaag ctttcatgaa gcagaggagg atgggtctga241 acgactttat tcagaagatt gccaataact cctatgcatg caaacaccct gaagttcagt301 ccatcttgaa gatctcccaa cctcaggagc ctgagcttat gaatgccaac ccttctcctc361 caccaagtcc ttctcagcaa atcaaccttg gcccgtcgtc caatcctcat gctaaaccat421 ctgactttca cttcttgaaa gtgatcggaa agggcagttt tggaaaggtt cttctagcaa481 gacacaaggc agaagaagtg ttctatgcag tcaaagtttt acagaagaaa gcaatcctga541 aaaagaaaga ggagaagcat attatgtcgg agcggaatgt tctgttgaag aatgtgaagc601 accctttcct ggtgggcctt cacttctctt tccagactgc tgacaaattg tactttgtcc661 tagactacat taatggtgga gagttgttct accatctcca gagggaacgc tgcttcctgg721 aaccacgggc tcgtttctat gctgctgaaa tagccagtgc cttgggctac ctgcattcac781 tgaacatcgt ttatagagac ttaaaaccag agaatatttt gctagattca cagggacaca841 ttgtccttac tgacttcgga ctctgcaagg agaacattga acacaacagc acaacatcca901 ccttctgtgg cacgccggag tatctcgcac ctgaggtgct tcataagcag ccttatgaca961 ggactgtgga ctggtggtgc ctgggagctg tcttgtatga gatgctgtat ggcctgccgc1021 ctttttatag ccgaaacaca gctgaaatgt acgacaacat tctgaacaag cctctccagc1081 tgaaaccaaa tattacaaat tccgcaagac acctcctgga gggcctcctg cagaaggaca1141 ggacaaagcg gctcggggcc aaggatgact tcatggagat taagagtcat gtcttcttct1201 ccttaattaa ctgggatgat ctcattaata agaagattac tccccctttt aacccaaatg1261 tgagtgggcc caacgaccta cggcactttg accccgagtt taccgaagag cctgtcccca1321 actccattgg caagtcccct gacagcgtcc tcgtcacagc cagcgtcaag gaagctgccg1381 aggctttcct aggcttttcc tatgcgcctc ccacggactc tttcctctga accctgttag1441 ggcttggttt taaaggattt tatgtgtgtt tccgaatgtt ttagttagcc ttttggtgga1501 gccgccagct gacaggacat cttacaagag aatttgcaca tctctggaag cttagcaatc1561 ttattgcaca ctgttcgctg gaagcttttt gaagagcaca ttctcctcag tgagctcatg1621 aggttttcat ttttattctt ccttccaacg tggtgctatc tctgaaacga gcgttagagt1681 gccgccttag acggaggcag gagtttcgtt agaaagcgga cgctgttcta aaaaaggtct1741 cctgcagatc tgtctgggct gtgatgacga atattatgaa atgtgccttt tctgaagaga 1801 ttgtgttagc tccaaagctt ttcctatcgc agtgtttcag ttctttattt tcccttgtgg1861 atatgctgtg tgaaccgtcg tgtgagtgtg gtatgcctga tcacagatgg attttgttat1921 aagcatcaat gtgacacttg caggacacta caacgtggga cattgtttgt ttcttccata1981 tttggaagat aaatttatgt gtagactttt ttgtaagata cggttaataa ctaaaattta2041 ttgaaatggt cttgcaatga ctcgtattca gatgcttaaa gaaagcattg ctgctacaaa2101 tatttctatt tttagaaagg gtttttatgg accaatgccc cagttgtcag tcagagccgt2161 tggtgttttt cattgtttaa aatgtcacct gtaaaatggg cattatttat gttttttttt2221 ttgcattcct gataattgta tgtattgtat aaagaacgtc tgtacattgg gttataacac2281 tagtatattt aaacttacag gcttatttgt aatgtaaacc accattttaa tgtactgtaa2341 ttaacatggt tataatacgt acaatccttc cctcatccca tcacacaact ttttttgtgt2401 gtgataaact gattttggtt tgcaataaaa ccttgaaaaa tatttacata taaaaaaaa血清糖皮质激素激酶甲(SGKl)通过脱氧核糖核酸在细胞内或者细胞外用特异的编码翻译表达，转化为
MSSQSSSLSEACSREAYSSHNWALPPASRSNPQPAYPWATRRMKEEAIKPP LKAFMKQRRMGLNDFIQKIANNSYACKHPEVQSILKISQPQEPELMNANPSPPPSP
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实施例一利用多肽P印Seq-I对SGKl的酶活性进行肝细胞系的细胞内抑制，包括 a、构建PepSeq-I的表达载体和底物蛋白表达载体
根据脱氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列，所述的DNASeq-I所示的序列为5' -ggcatgagat cgaggtctca cagtttcact ggaacgtcca gcggc-3',合成该段 DNA 序列，并在两端引入EcoRI和BamHI酶切位点。根据底物蛋白ENaC的全长cDNA序列，利用Primer Primer 5. 0软件设计引物，并分别在上游引物和下游引物前加上限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列及接头，通过PCR方法从细胞基因组中扩增出ENaC，反应体系如下
10 X Taq聚合酶缓冲液5 y L
dNTPs4u L
上游引物2. 5iiL
下游引物2. 5iiL
TaqDNA 聚合酶I ii L
模板I U L
__无菌水
34 u L
Total50 u L
反应条件94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30个循环；72°C延伸IOmin。PCR反应结束后取5 u L扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析并回收目的片段。将合成的DNASeq-I以及ENaC的PCR纯化产物经限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切后与经同样酶切的载体pcDNA3. 1，如图I所示。利用T4连接酶16°C连接过夜，然后转化筛选连接产物加入到感受态细胞中混匀后冰上放置30min，42°C热击90s再冰上放置3min，加入800 y L的LB培养液37°C震荡45min，取一定量铺于含Amp抗性的琼脂平板上，37°C培养过夜后，挑取单菌落接种于Amp抗性的LB培养液中，37°C振荡培养12h，SDS碱裂解法小量提取质粒。阳性克隆pcDNA3. I- X和pcDNA3. I-ENaC经酶切及测序验证。b、载体转染肝细胞系
如图I所示，鉴定正确的阳性质粒pcDNA3 . 1-X、pcDNA3. I-ENaC0采用GenEscortTMI进行细胞转染生长良好的HepG2细胞于转染前24h接种到6孔板仲，待细胞总面积达到60%-80%，取I. 5 ii g DNA3. 1-X、I. 5u g pcDNA3. I-ENaC质粒进行瞬时共转，3天后收获转染细胞。C、检测P印Seq-I在肝细胞系内的表达水平
对转染细胞通过蛋白印迹法检测P印Seq-I在HepG2细胞系内的表达水平转染细胞加入细胞裂解液冰上裂解15min,离心取上清加入IXSDS Loading Buffer后100°C煮5min进行SDS-PAGE电泳，通过湿转方法转移至NC膜上，选用1:1000稀释的SGKl抗体(Abcam)、1:3000稀释的羊抗兔抗体以及ECL化学发光液进行Western Blotting检测。d、检测PepSeq-I对细胞内SGKl催化活性的抑制水平
如图2所示,通过蛋白凝胶电泳Western Blotting]检测HepG2细胞内PepSeq-I对SGKl催化活性的抑制水平。实施例二 利用多肽P印Seq-I对SGKl的酶活性进行细胞外抑制，包括
a、体外转录SGKl和底物蛋白ENaC的相关表达载体
将经限制性内切酶EcoRV线性化后的pcDNA3. 1_X、pcDNA3. I-ENaC采用TnT快速转录/翻译偶联系统(Promega)进行体外转录,反应体系如下
权利要求
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽具有PepSeq-I所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的多肽，其特征在于，所述的多肽通过高特异性的竞争性抑制在细胞中抑制血清糖皮质激素激酶家族的酶活性。
3.根据权利要求I所述的多肽，其特征在于，所述的PepSeq-I所示的氨基酸序列是通过脱氧核糖核酸在细胞内或者细胞外编码翻译表达获得，或通过氨基酸直接合成获得。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述的编码翻译表达PepSeq-I的脱氧核糖核酸具有DNASeq-I所示的序列。
5.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述的血清糖皮质激素激酶家族，包括血清糖皮质激素激酶甲、血清糖皮质激素激酶乙和血清糖皮质激素激酶丙，及血清糖皮质激素激酶甲、血清糖皮质激素激酶乙和血清糖皮质激素激酶丙的异构体。
6.根据权利要求2或3所述的多肽，其特征在于，所述的细胞为人体细胞，包括人体的胚胎细胞。
7.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述的抑制为降低酶对下游靶蛋白进行生物催化反应的效率和能力。
全文摘要
本发明公开了一种多肽，所述的多肽具有PepSeq-1所示的氨基酸序列，通过高特异性的竞争性抑制在细胞中抑制血清糖皮质激素激酶家族的酶活性。本发明提供的多肽，具有良好的水溶性和稳定性，在人体细胞对糖皮质激素及其类似物，以及性激素及其类似物反应紊乱的情况下，具有良好的调节作用，可以作为治疗摄入性激素紊乱和内分泌性激素紊乱的特效药物，对阿尔茨海默病、激素紊乱造成的皮疹、糖尿病以及其他由激素紊乱导致的疾病有潜在的治疗作用。
文档编号C12N15/11GK102746379SQ20121024204
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者张芃芃, 杨艳坤, 白仲虎, 龙泉 申请人:张芃芃, 杨艳坤, 白仲虎, 龙泉