犀牛角制品真伪及其所属种类的分子鉴定方法

专利名称：犀牛角制品真伪及其所属种类的分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种犀牛角制品真伪及其所属种类的分子鉴定方法。
背景技术：
世界上的犀牛主要包括五个物种，S卩非洲的黑犀(Diceros bicornis)和白犀(Ceratotherium simum),亚洲的印度犀(Rhinoceros unicornis)、爪睡犀(Rhinoceros sondaicus)和苏门达腊犀(Dicerorhinus sumatrensis)。由于犀牛角是贵重的中成药原料配药，犀牛成为近现代偷猎的对象，犀牛栖息地的减少，导致犀牛数量急骤减少。目前亚洲犀几近灭绝，而现存的非洲犀，数量也不多，为了挽救面临绝种的犀牛，印度犀和白犀被濒危动物红皮书(IUCN)列为受威胁物种，黑犀、爪哇犀和苏门达腊犀都被列为极危物种。由于犀角被夸大的近乎神奇的药用价值及其工艺品巨大的收藏价值，目前仍有很多人大量偷猎犀牛或进行有关犀角的非法交易，且据称不同种类的犀角药用价值及收藏价值差异相当大，因此区分和鉴别生物工艺品及制品中是否是犀角或是否含有犀角成分及其所属种类，在实际应用中极为重要，准确、可靠的鉴定方法为相关部门执法和查验提供有力的证据。我国境内已经没有野生犀牛，作为《国际濒危野生动物种贸易公约》的成员国之一，为了更好的保护这个濒危种，1993年5月29日中国国务院发出了《关于禁止犀牛角和虎骨贸易的通知》，并停止生产含犀角成分的中成药。但93年以前生产的含有犀角成分的药物或犀角制品在市场中仍然有售，且价格不菲，药品成分中是否真的含有犀角成分，需要可靠的鉴定方法。近些年，由于犀角的稀缺和珍贵，有关犀角的非法贸易、偷运或走私从未停止，犀角工艺品价值不断攀升，而亚洲犀角工艺品的收藏价值更是无法估量，一只明清时代由名家雕刻的亚洲犀角杯价值百万，甚至千万。在巨额的经济利益的诱使下，市场上甚至出现了用牛角或其它仿伪品冒充犀角工艺品及其制品，因此寻找能够准确鉴定犀角制品真伪或其制品中是否含有犀角成分的生物学方法显得尤为重要。传统的犀牛角鉴定方法，主要是形态学和组织学鉴定，这些方法可以鉴定形态完整的犀牛角，然而市场上销售的犀角多为半成品、粉末状或经过打磨、抛光、上色后的工艺品，其结构特征不易分辨，此时形态学观察未必能准确判定犀角制品真伪或其制品中是否含有犀角成分。

发明内容
本发明的目的是提供一种犀牛角制品真伪及其所属种类的分子鉴定方法。本发明提供了通用引物对在辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛的应用；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对。所述犀牛具体可为非洲黒犀。本发明还提供了一种辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛的方法，包括如下步骤(I)以犀牛角制品的基因组DNA为模板，用通用引物对进行PCR扩增；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对； (2 )将步骤(I)得到的PCR扩增产物依次进行测序和同源性比对，根据同源性比对结果辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛。所述“根据同源性比对结果辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛”的实现方法具体如下将所述测序结果与NCBI的GenBank库中的COI基因进行BLAST比对，如果测序结果与某种犀牛的COI基因片段同源性最高且为98%以上，则判断所述犀牛角制品中的犀牛角材料来源于该种犀牛。因为同源性比对结果可能具有一定的局限性，可结合其它现有方法(如构建系统发育树)进行辅助判断。所述基因组DNA是采用磁珠法从所述犀牛角制品中提取得到的。所述基因组DNA 具体是采用美国Promega公司的DNA Purification System for food从所述犀牛角制品中提取得到的。从犀角中提取总的DNA存在一定难度，首先犀角中蛋白含量很高，且高度角质化，不利于DNA的释放；其次，犀牛角制品的打磨工艺、染色等都可能严重的破坏基因组DNA，且年代久远，部分DNA会有降解，也增加了提取难度；再次，由于取材时不能破坏犀牛角制品的表面，因此只能得到极微量的碎屑。磁珠法试剂盒采用先进的分离、纯化技术，有效分离并得到了高质量的DNA，特别适用于低拷贝、微量样本的提取。所述步骤(I)中，所述PCR扩增的反应程序如下94 °C 3min ；94 °C 30sec、
45°C 30sec,72 °C lmin，5 个循环；94 °C 30sec,51 °C lmin、72 °C lmin，35 个循环；72°C IOmin。所述犀牛具体可为非洲黒犀。本发明还保护通用引物对在鉴定市售犀牛角制品真伪中的应用；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对。所述犀牛角制品具体可为非洲黒犀的犀牛角制品。本发明还保护一种辅助鉴定市售犀牛角制品真伪的方法，包括如下步骤(I)以市售犀牛角制品的基因组DNA为模板，用通用引物对进行PCR扩增；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对；(2)将步骤(I)得到的PCR扩增产物依次进行测序和同源性比对，根据同源性比对结果辅助鉴定市售犀牛角制品的真伪。所述“根据同源性比对结果辅助鉴定市售犀牛角制品的真伪”的实现方法具体如下将所述测序结果与NCBI的GenBank库中的COI基因进行BLAST比对，如果测序结果与犀牛的COI基因片段同源性最高且为98%以上则判断所述犀牛角制品为真，如果测序结果与非犀牛的COI基因片段同源性最高且为98%以上则判断所述犀牛角制品为伪。所述基因组DNA是采用磁珠法从所述市售犀牛角制品中提取得到的。所述基因组DNA具体是米用美国Promega公司的DNA Purification System for food从所述市售犀牛角制品中提取得到的。所述步骤(I)中，所述PCR扩增的反应程序如下94 °C 3min ；94 V 30sec、45°C 30sec,72°C lmin，5 个循环；94°C 30sec、51°C lmin、72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin0所述犀牛具体可为非洲黒犀。
以上任一所述的犀牛角制品可为主要材料为犀牛角的犀牛角工艺品，也可为仅添加了少量犀牛角材料的药品或营养品。本发明为犀牛角制品真伪及其所属种类的的鉴定提供准确可靠的分子生物学技术方法，也为出入境生物资源查验及物种管制，防止非法交易及口岸执法提供科学有效的鉴定依据。


图I为样本2的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；M为分子量标准，I至4均为样本的PCR扩增产物。
图2为样本I的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；M为分子量标准，I至4均为样本的PCR扩增产物。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例I、鉴定市售犀牛角制品真伪及其中的犀牛角材料来源于哪种犀牛样本I和样本2分别为两个市售犀牛角制品(犀角杯)，其中样本I已鉴定为非洲黑犀的犀牛角制品，样本2已鉴定为黄牛的牛角制品(即假冒伪劣的犀牛角制品)，将样本I和样本2分别进行以下操作I、用电钻钻取微量碎屑，采用磁珠法(DNA Purification System for food,美国Promega公司试剂盒)分别提取各个样本的基因组DNA。2、分别以步骤I提取的各个基因组DNA为模板，用Fl和Rl组成的引物对(靶基因为COI基因)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1，其中I代表样本1、2代表样本2。Fl :5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，；Rl :5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。PCR 反应体积(25 iil)，含 2. 5 ill IOXQiagen PCR 缓冲液(包含 15mM MgCl2),0. 5u IMgCl2 (25mM) ,0. 25 u I dNTP Mix(IOmM) ,0. 5u I Fl (IOmM)、0. 5 y I Rl (IOmM)、0. 5u ITaq DNA 酶(Qiagen, 5U/L)、2. Oii I 基因组 DNA。PCR 反应程序94 °C 3min ；94 °C 30sec、45 °C 30sec、72 °C lmin, 5 个循环；94°C 30sec,5rC lmin、72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin03、分别将步骤2得到的各个PCR扩增产物进行测序。样本I的测序结果见序列表的序列1，样本2的测序结果见序列表的序列2。根据测序原理，序列I和序列2中自5’末端第56位至自3’末端第57位之间的序列为可信区间。4、将步骤3得到的各个测序结果分别在GenBank中进行BLAST比对。样本I与非洲黑犀相似性高达98% (非洲黑犀中的同源序列见GENBANK ACCESSION NO. FJ905814. I自5’末端第5399至5999位核苷酸)，即该犀牛角制品中的犀牛角材料疑似来自非洲黒犀。样本2与黄牛的相似性为100% (黄牛中的同源序列见GENBANK ACCESSI0NN0. HQ184039. I自5’末端第5736至6 336位核苷酸)，即该犀牛角制品中的犀牛角材料疑似来自黄牛，为伪造的犀牛角制品。
权利要求
1.通用引物对在辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛中的应用；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对。
2.一种辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛的方法，包括如下步骤 (1)以犀牛角制品的基因组DNA为模板，用通用引物对进行PCR扩增；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对； (2)将步骤(I)得到的PCR扩增产物依次进行测序和同源性比对，根据同源性比对结果辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述基因组DNA是采用磁珠法从所述犀牛角制品中提取得到的。所述基因组DNA具体是采用美国Promega公司的DNAPurificationSystem for food从所述犀牛角制品中提取得到的。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中，所述PCR扩增的反应程序如下94で 3min ；94°C 30sec,45°C 30sec,72°C lmin，5 个循环；94で 30sec、51tlmin、72°C lmin，35 个循环；72で IOmin0
5.通用引物对在鉴定市售犀牛角制品的真伪中的应用；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对。
6.ー种辅助鉴定市售犀牛角制品的真伪的方法，包括如下步骤 (1)以市售犀牛角制品的基因组DNA为模板，用通用引物对进行PCR扩增；所述通用引物对为序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对； (2)将步骤(I)得到的PCR扩增产物依次进行测序和同源性比对，根据同源性比对结果辅助鉴定市售犀牛角制品的真伪。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在干所述基因组DNA是采用磁珠法从所述市售犀牛角制品中提取得到的。所述基因组DNA具体是采用美国Promega公司的DNAPurification System for food从所述市售犀牛角制品中提取得到的。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中，所述PCR扩增的反应程序如下94で 3min ；94°C 30sec,45°C 30sec,72°C lmin，5 个循环；94で 30sec、51tlmin、72°C lmin，35 个循环；72で IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种犀牛角制品真伪及其所属种类的分子鉴定方法。本发明提供了通用引物对在辅助鉴定犀牛角制品中的犀牛角材料来源于哪种犀牛中的应用。所述通用引物对为序列表的序列1所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成的引物对。本发明为犀牛角制品真伪的鉴定工作提供准确可靠的分子生物学技术方法，也为出入境生物资源查验及物种管制，防止非法交易及口岸执法提供科学有效的鉴定依据。
文档编号C12Q1/68GK102732634SQ20121024207
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者宋云, 张永江, 李明福, 王仁睿, 许瑾, 赵竹, 鲁洁 申请人:中国检验检疫科学研究院